经典液相色谱法.doc

经典液相色谱法第一节 吸附色谱一、基本原理 吸附色谱是根据所用的吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，在流动相作用下，使各组分分离的色谱方法；其中固定相为吸附剂，一般为固体，所以又称液固色谱。 要求：固定相吸附剂（硅胶或AL2O3） 具有表面活性吸附中心 在吸附色谱中 tR = tm（1KVs/Vm） VR= VmKVS其中K是吸附平衡常数，Vs为固定相，即吸附剂的吸附表面积，也可以用吸附剂的量来表示。在吸附剂上存在着吸附平衡，即吸附 解吸附；若组分的吸附能力强，则在吸附状态时间长，解吸附状态时间短，即tR大，保留时间长，K ( K )大。分离机制：吸附平衡 Xm + nYa Xa + nYm 吸附系数分离机制：Ka与组分的性质、吸附剂的活性、流动相的性质及温度有关吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开 分离机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离二、吸附等温线吸附等温线可用来描述分配系数K（吸附平衡常数）随组分浓度变化的规律。即在一定温度下，组分在吸附剂上达到平衡时，用组分在固定相中的量（在固定相上被吸附着的浓度）对组分在流动相中的浓度（未被吸附）作图，即得吸附等温线。1线性等温线 K=tg= CS/Cm 特点：组分的K为一常数，不随组分的浓度而变化；虽然组分的前沿、中心、尾部浓度不等，但由于K与浓度无关，是常数，所以组分的分子以相同的速度迁移，得到完全对称的峰；组分的保留时间，不随样品的浓度而变化。2、凸型等温线（Langmuir型等温线）特点：K是浓度的函数，随浓度而变化；当组分浓度增大时，K减小，组分更多地分配于流动相中；对于组分谱带中，不同浓度区域的分子（前、中、后），因浓度不同，K不同；中心的浓高，K小，迁移快；两头浓度低，K大，迁移慢，形成拖尾峰；造成谱带不对称，tR值偏移，谱带展宽。原因：吸附剂上常存在一些强烈的活性中心，当组分在吸附剂上被吸附时，先占据活性能力最强的活性中心，然后占据次强的、弱的、最弱的，这样，当样品量大时，少部分占据强吸附中心；其它的在弱吸附中心，则移动快，K值小，所以随浓度的增大，K减小，移动快。克服方法：a.减少上样量，使之在线性容量内（线性容量，即吸附等温线为线性的区间所对应的组分的浓度区间）。B.覆盖强活性中心（用极性物质），增大线性容量用某种物质覆盖强活性中心，减低其吸附能力的过程，叫减活。3.凹型等温线（反langmuir型等温线）随浓度大，K大；则浓度大的区域移动慢，形成伸舌头峰。原因：a、化学吸附 b、相对于流动相超载，即当样品量过大时，局部浓度过高，流动相对其溶液能力有限，只能洗脱少量，所以浓度低处移动快。克服：减少上样量。三、常用吸附剂 多孔、微粒状物质（一）吸附剂的类型1.极性吸附剂 吸附剂表面是极性的，选择性吸附极性大的化合物。极性强，则保留能力强。2.非极性吸附剂 吸附力主要靠色散力，即大分子量的化合物、易极化的化合物。（二）吸附剂的吸附能力（活性）1 、影响吸附剂吸附能力的因素： 吸附剂的表面积 吸附剂表面的化学组成及表面原子或基团的几何排列含水量（对极性吸附剂来讲） 含水量越多，则吸附能力越弱2、吸附能力的定量指标活度活度：使吸附剂的活性标准化，它反映了吸附剂的活性与含水量的关系。方法：Brockman法样品：六种标准染料（0.04 w/v）10ml（石油醚溶解）色谱柱：干法装柱，柱长5cm将样品上柱，用20ml洗脱剂（石油醚苯 = 4:1）洗脱，用染料在柱上位置来确定吸附剂的活度。3、活度级别I级 V 级 含水量 增大 吸附能力 降低 活性 下降4、活化 将吸附剂加热，去除其吸附的水的过程。5 .减活 加入减活剂，降低吸附剂活性（三）常用吸附剂硅胶、氧化铝1、硅胶（SiO2xH2O）结构：内部硅氧交联结构多孔结构 表面有硅醇基氢键作用吸附活性中心特性： 1）与极性物质或不饱和化合物形成氢键 物质极性，吸附能力强极性吸附中心，不易洗脱 2）吸水失活 105110OC烘干30分钟(可逆失水)吸附力最大 500OC烘干(不可逆失水)活性丧失，无吸附力适用： 分析酸性或中性物质 含水量% 硅胶的活性 0 I 级 5 II 级 15 III 级 25 IV 级 38 V 级 续前2、氧化铝：分离亲脂性成分 活化：400，6h 级 加入相应的水 级碱性氧化铝 pH 910 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 45 适于分析酸性、中性物质 含水量% 氧化铝的活性 0 I 级 3 II 级 6 III 级 10 IV 级 15 V 级 （四）极性吸附剂对化合物的选择性1、极性吸附剂选择性吸附极性大的化合物2、化合物的极性大小，由化合物的官能团决定常见官能团的极性大小：烷烯醚硝基化合物（二甲胺）酯类酮醛硫醇胺类酰胺醇酚羧酸判断化合物极性大小时：基团母核相同时，则分子中基团的极性大，整个分子的极性大；极性基团多，极性大分子中双键多，吸附力强；共轭双键多，吸附力强取代基的空间排列：同一母核中，羟基处于能形成分子内氢键的位置，则吸附力弱于不能形成分子内氢键的位置。3、非极性吸附剂给出相反顺序。 四、洗脱剂（流动相、溶剂）（一）洗脱剂的洗脱强度（对组分K值的影响）（二）洗脱剂的选择性（一）洗脱剂（流动相）对组分K值的影响1、在固定相上与组分分子的竞争作用溶剂极性强 洗脱能力强 溶剂强度（0）大洗脱剂极性强，易被吸附剂所吸附，即易将组分分子从吸附剂上置换下来，即洗脱能力强，称之为强洗脱剂或溶剂强度大。2、流动相对组分的溶解能力对组分溶解度大 洗脱能力强 溶剂强度（0）大吸附剂对组分的吸附能力一定时，则流动相对组分的溶解能力越强，组分溶解在流动相中多，组分的K值越小，移动越快。3、各种溶剂的极性顺序（即强度顺序）根据溶剂的极性判断（如前）实验确定4 、混合溶剂的强度。 P=aPa+bPb 其中 为体积分数；P 为极性参数 （二）洗脱剂（流动相）的选择性1、溶剂与组分分子之间的作用力 色散作用、偶极作用、氢键作用、介电作用2、溶剂的分类以上四种作用力中，主要考虑偶极、氢键作用力，按它们的大小，把常用的溶剂分类 常用溶剂分类组别溶剂名称I脂肪族醚、三烷基胺II脂肪醇III吡啶衍生物、THF、酰胺（除甲酰胺外）、乙二醇醚、亚砜IV乙二醇、苯甲醇、甲酰胺、乙酸VCH2Cl2、二氯乙烷VI酮、酯、腈、聚酯VII卤代芳氢、芳氢、芳香醚、硝基化合物VIII水、氯仿、间甲苯酚、氟烷醇3、溶剂选择性处于同一组的溶剂，在色谱分离中具有相似的选择性；在分组三角形中相差较远的组中的溶剂，其选择性相差较大：组：良好的质子受体（醚、胺等），优先与含羟基化合物（如酚、羧酸等）作用；组：既可作为质子受体，又可作为质子给体；组：良好的质子给体溶剂（H2O、CHCl3等），与碱性样品优先作用。组（硝基化合物、腈、胺等）：与偶极矩大的组分之间的作用力大。4、改善选择性根据组分的性质，选择合适的溶剂。利用多元溶剂，既可调节K值，又可调节选择性。3、溶剂选择性处于同一组的溶剂，在色谱分离中具有相似的选择性；4 、改善选择性 根据组分的性质，选择合适的溶剂。利用多元溶剂，既可调节K值，又可调节选择性。吸附剂、被分离物质、流动相的选择原则五、吸附色谱分离体系的系统选择（一）选择固定相（吸附剂）（二）洗脱剂的选择（流动相的选择）（一）选择固定相（吸附剂）1、固定相的吸附能力：极性固定相：组分分子极性官能团多，则吸附作用强。 分离极性组分非极性固定相：分离非极性组分3、固定相的预处理活度级别、活化、减活 （二）洗脱剂的选择（流动相的选择）选择流动相时，需同时对固定相、流动相及组分的性质全面考虑。1、对溶剂的要求:稳定、粘度低、能溶解样品，浸润固定相、高纯度、挥发性好、安全价廉2、一般步骤根据固定相和组分的性质，选择一合适强度的溶剂，使K值在25范围内，即选用不同溶剂调节K= 25。若在一定n下，不能很好分离，则需改善系统的选择性，此时可根据组分的性质，选用二元溶剂系统来改善选择性，同时保持一定的溶剂强度，即使K在25。 可通过实验选择不同组别的溶剂来筛选。若二元溶剂仍不凑效，可试用三元溶剂。六、实验操作基本技术 经典柱色谱 图示1、装柱：将固定相装入柱管内柱管：玻璃柱、石英柱、尼龙柱， 柱径:柱长1:1020方法：干法装柱 湿法装柱注意事项:倾入时，一次性连续倾入柱子，以免由于颗粒大小不同，沉降速度不同，引起柱子出现的分层。搅拌要均匀（除气泡），洗脱过程中不能有气泡。固定相粒度要均匀，即装成的柱子密度要均匀，固定相粒度大小要均匀。 2、上样：方法：液体上样：即将样品溶液加到色谱柱顶即可。固体上样：用一定的固定