多药耐药基因与细胞凋亡基因产物在非小细胞肺癌中的表达及其意义.doc

多药耐药基因与细胞凋亡基因产物在非小细胞肺癌中的表达及其意义【摘要】目的检测非小细胞肺癌（NSCLC）多药耐药相关基因及细胞凋亡基因的表达，探讨其表达的相关性及临床病理意义。方法采用SP免疫组化法检测113例NSCLC中多药耐药相关蛋白（MRP）、谷胱甘肽巯基转移酶（GST）、肺耐药相关蛋白（LRP）、突变型p53和bcl2的表达。结果NSCLC中MRP、GST、LRP、p53和bcl2的检出率分别为79.65、75.22、80.53、61.95%、59.29%。MRP、LRP和bcl2的表达与组织学类型有关（P0.05）。p53与肿瘤细胞的分化程度有关（P0.05），随着肿瘤细胞分化的恶性程度增加呈递增趋势。MRP与GST、LRP表达之间，p53和bcl2表达之间相关性有统计学意义(P0.05)。结论不同组织学类型NSCLC的多药耐药性各不相同，且其耐药性之间还存在一定的相关性。检测NSCLC的多药耐药性有助于指导肺癌的化疗。 【关键词】 肺肿瘤 多药耐药 细胞凋亡 免疫组织化学0 引言 化疗是肺癌综合性治疗的重要手段之一。但是，肺癌特别是非小细胞肺癌（NSCLC）的化疗效果多不佳，其主要原因是多药耐药（multidrug resistance，MDR）的产生。肺癌的多药耐药机制相当复杂，为一多基因、多因素参与的过程，且不同类型肺癌的耐药表型亦不相同1。本实验采用SP免疫组化法，对113例未经治疗的NSCLC中3种MDR有关蛋白和2种细胞凋亡基因产物进行了检测，旨在探讨其表达与NSCLC临床病理特征间的关系以及MDR与细胞凋亡之间的联系。1 材料与方法1.1 材料收集武汉大学中南医院病理科1996年2000年间手术切除并经病理确诊的NSCLC共113例。所有病例术前均未经放化疗。其中，男性91例，女性22例。年龄3477岁，均龄为55.81岁。鳞癌39例，腺癌61例(含细支气管肺泡癌16例)，腺鳞癌13例。其中，高分化43例，中分化47例，低分化23例。根据1997年肺癌国际分期修正系统公布的TNM分期标准，A期20例，B期32例，A期15例，B期11例，A期6例，B期5例，期1例，23例无记录。有淋巴结转移者36例，无淋巴结转移者55例，另有22例无记录。1.2 方法 即用型多药耐药相关蛋白(multidrug resistance associated protein，MRP)单克隆抗体购于北京中山生物技术公司，即用型鼠抗人谷胱甘肽巯基转移酶π（GSTπ）、肺耐药相关蛋白（lung resistance associated protein，LRP）、突变型p53和bcl2单克隆抗体及SP免疫组化试剂盒购于福州迈新生物技术公司。SP免疫组化染色按试剂盒说明书操作， GSTπ未作特殊预处理，其余均采用柠檬酸微波抗原修复。以阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。MRP以胞膜和/或胞浆呈棕黄色为阳性细胞，p53以胞核呈棕黄色为阳性细胞，余均以胞浆呈棕黄色为阳性细胞，阳性细胞5%者为阴性，≥5%者为阳性。1.3 统计学处理 SPSS统计软件分析数据，结果采用χ2检验。P腺癌鳞癌，且差异有统计学意义（χ212.14，P腺癌鳞癌，但差异无统计学意义（P0.05）；LRP的表达为腺癌腺鳞癌鳞癌，差异亦有统计学意义（χ215.57，P0.05）；bcl2的表达为鳞癌腺鳞癌腺癌，且差异具有统计学意义（χ213.06，P0.005）。(2) p53的表达与肿瘤细胞分化程度相关（χ27.69，P0.05）。2.2 NSCLC中5种蛋白表达之间的关系2.2.1 MRP与GSTπ（χ25.42，P0.05）、 MRP与LRP（χ210.62，P0.01）的表达之间的相关性有统计学意义,见表。表1NSCLC中MDR相关蛋白及细胞凋亡基因产物表达与病理特征的关系（略）2.2.2 p53和bcl2表达间相关性具有统计学意义（χ24.697，P0.05）； 细胞凋亡基因产物p53、bcl2与多药耐药基因产物MRP、GST、LRP表达之间均无相关性（P均0.05）。表2 MRP与GSTπ、 LRP之间的关系（略）表3 p53与bcl2表达之间的关系（略）3 讨论化疗是肺癌特别是NSCLC的一种重要手段，但肿瘤细胞的耐药性又是化疗失败的常见原因之一。肺癌MDR的产生是一个多因素作用的结果。目前关于MDR产生机制的研究报道很多，主要包括以下几个方面：MDR1、MRP和LRP基因及其编码的蛋白过度表达，GSTπ解毒系统活性的增高，细胞凋亡抑制等。典型的MDR机制是指MDR1基因编码的Pgp致药物外流而产生的多药耐药2。但多数学者发现它们在肺癌中的表达水平并不高，难以解释NSCLC的高度耐药，因此，推测肺癌中存在另外的耐药机制3。MRP与Pgp作用机制相似，但能识别和转运与谷胱甘肽形成复合物的依赖ATP的GSX泵，并迅速将GSX复合物转运到细胞外，使胞内药物浓度下降而产生耐药。GSTπ是重要催化剂，可催化亲电物质与谷胱甘肽结合，也可和亲脂细胞毒药物结合，促进其代谢，从而降低抗肿瘤药物对肿瘤细胞的杀伤作用，可能是产生多药耐药的主要原因和内在性MDR标志之一4。LRP是Scheper于1993年从一株起源于NSCLC的细胞株SW1573/2R120中分离出的非Pgp的MDR蛋白5，它通过转运调节药物的浓度，并将药物储存于囊泡，从而导致耐药的发生。而很多抗肿瘤药物最终的效应是引起肿瘤细胞的凋亡，因而凋亡抑制也可导致MDR。野生型p53基因可启动凋亡，并能抑制MDR1基因的启动子，而突变型p53则具有活化该启动子的作用。因此，当野生型p53缺失或者发生突变时，即可产生MDR6,8。bcl2能抑制凋亡，在bcl2过度表达的细胞，药物仍能进入细胞内，诱导细胞损伤，但这种损伤不能有效的转换成凋亡的信号，以致在化疗期间表达bcl2的肿瘤细胞又能以较快的速率重新生长，导致MDR现象的产生。肺癌中常有突变型p53和bcl2的表达，有研究认为二者的过表达与MDR有关7,8。 本实验以未经治疗的NSCLC为研究对象，检测其MRP、GSTπ、LRP、p53与bcl2的表达，检出率分别为79.65、75.22、80.53、61.95%、59.29%，表达水平均较高。在不同组织学类型的NSCLC中MRP、LRP和bcl2表达差异具有统计学意义；GSTπ与p53表达差异无统计学意义。p53的表达与肿瘤细胞分化程度有关，肿瘤分化越差，p53的表达率越高。相关分析表明，MRP与GSTπ、MRP与LRP的表达之间具有显著相关性，推测三者可能是NSCLC产生MDR的主要原因。p53、bcl2的表达与MRP、GSTπ、LRP无相关性，此结果与Oshika等8的研究结果并不一致，推测突变型p53、bcl2表达的凋亡抑制所致的MDR可能与其它耐药基因相关，其与MDR的关系有待进一步研究。p53与bcl2的表达有相关性，二者协同表达，抑制NSCLC中的细胞凋亡。p53与肿瘤分化程度间的相关性提示其可以作为一种较好的预后参考指标。 总之，本组检测结果显示不同组织学类型NSCLC的多药耐药性各不相同，且其耐药性之间还存在一定的相关性。检测NSCLC的多药耐药性，有助于对肺癌实施个体化的有效治疗。【参考文献】 1 Heenan M, ODriscoll L, Cleary I, et al. Isolation from a human MDR lung cell line of multiple clonal subpopulations which exhibit significantly different drug resistanceJ. Int J Cancer, 1997， 71(5): 907915.2Pujol JL,Simony J,Cautier V,et al.Immunohistochemical study of Pglycoprotein distribution in lung cancerJ. Lung Cancer,1993,10(12):112.3Narasaki F, Oka M, Fukuda M, et al. Multidrug resistanceassociated protein gene expression and drug sensitivity in human lung cancer cellsJ. Anticancer Res, 1997，17(5A): 34933497.4戴广海，石廷章，李春海.肺癌组织MDR1和GSTmRNA水平测定及其临床意义J.中国肿瘤临床，1999，26（3）：165167.5Scheper RJ,Broxterman HJ,Scheffer GL,et al. Overexpression of a Mr 110000 vesicularprotein in nonPglycoprotein mediated multidrug resistanceJ. Cancer Res,1993,53:14751479.6Wang Q, Beck WT. Transcriptional suppression of multidrug resistanceassociated protein (MRP) gene expression by wildtype p53J. Cancer Res,1998, 58(24):57625769.7Zhang Y, Fujita N, Tsuruo T.p21Waf1/Cip1 acts in synergy with bcl2 to confer multidrug resistance in a camptothecinsselected human lungcancer cell lineJ. Int J Cancer, 1999,83(6): 79