小鼠骨髓细胞微核试验.ppt

实习四小鼠骨髓细胞微核试验 小鼠染毒 腹腔注射 0 2g环磷酰胺 33 33ml生理盐水6mg ml环磷酰胺染毒剂量 0 01ml g每组6只 4只染毒 右侧腹部标记苦味酸 两只注射生理盐水 目的和要求 1 学习骨髓液的制备和涂片方法 2 掌握小鼠骨髓多染红细胞 PCE 微核测定方法 概念 微核 微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒 大小相当于细胞直径的1 20 1 5 呈圆形或杏仁状 其染色与细胞核一致 在间期细胞中可以出现一个或多个 来源 1 染色体断片 当染色体受到电离辐射或外来化学物质诱变剂作用后 引起染色体的断裂 其断片形成微核 2 整条的染色体 当染色体受到电离辐射或外来化学物质诱变剂作用后 纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外 原理 微核试验是用于检测染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速方法 微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒 大小相当于细胞直径的1 20 1 5 呈圆形或杏仁状 其染色与细胞核一致 在间期细胞中可以出现一个或多个 原理 一般认为微核使细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质 所以 微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点 原理 微核可以出现在多种细胞中 但在有核细胞中较难于正常核的分叶及核突出物相区别 由于红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出 而仍保留微核于PCE细胞中 因此通常计数PCE细胞中的微核 试验设计 1 动物选择一般常用的实验动物为大 小鼠 以小鼠用的最多 要求体重18 20g 7 12周龄 每组小鼠数量10只 雌 雄各半 试验设计 2 染毒途径根据研究目的或受试化学毒物性质不同 可分别选用经口 经皮 经呼吸道及注射等染毒途径 但原则上应尽可能采取如人接触化学毒物相同的途径 试验设计 3 染毒次数及取样时间研究证实化学毒物需要在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突作用 不同化学毒物诱发微核出现的高峰时间不尽相同 波动范围可以达到24 72小时 这就要求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点 考虑到以上两方面的原因 建议采用多次染毒的方法 其中以4次染毒比较方便合理 即每天染毒一次 连续4天 第5天取样 这样 取样一次就能覆盖24 72小时高峰 如果高峰延迟到96小时也不会漏掉 试验设计 4 剂量选择受试化学毒物的最大剂量除受溶解度大小所限外 应达到最大耐受量 也可根据受试化学毒物的LD50 以1 2LD50为最高级剂量 一般情况下 应设3 5个或更多剂量组 剂量覆盖的范围要达到三个数量级以上 同时还应设阳性对照组和阴性对照组 阳性对照组可用环磷酰胺 50 100mg Kg 或丝裂霉素C 10mg Kg 腹腔注射一次到二次 阴性对照组使用等体的容积 操作步骤 1 取材 实验动物最后一次染毒后 按确定的时间将小鼠颈椎脱臼 大鼠断头 处死后 剪取一侧股骨 剔净肌肉 用纱布擦掉附在股骨上的血液和肌肉 剪掉股骨头 露出骨髓腔 用带 号针头的注射器吸取小牛血清 小鼠需 ml 大鼠需 ml 插入骨髓腔内少许 将骨髓冲入离心管内 然后 用吸管轻轻抽吸 打碎骨髓团块 使成均匀混悬液 操作步骤 2 制片 用以上方法制备的骨髓悬浮液 以1000rpm离心10min 用吸管吸去上清液 如沉淀物较多 可留少许血清 用吸管尖端混匀沉淀物滴于载玻片的一端 推片 在空气中晾干 3 固定 将制好的片子放入甲醇液中固定5 10min 如当日不染色 也需固定好保存 4 染色 片子固定后 滴加瑞氏 姬姆萨A溶液于涂片上 让染液覆盖整个标本涂片染色1分钟 再将B溶液滴加于A液上面 滴加量为A液的2 3倍 以嘴或洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状 使两液充分混合 染色8分钟 水洗 干燥 镜检 注意 不要把细胞冲洗掉 5 观察计数 先在低倍镜下进行观察 选择分布均匀 染色较好的区域 再在油镜下观察计数 骨髓多染红细胞 PCE 细胞呈灰蓝色 正染红细胞 NCE 呈桔黄色 细胞中含有的微核多数呈圆形 边缘光滑整齐 嗜色性与核质一致 呈紫红色或蓝紫色 一个细胞内可出现一个或多个微核 计数1000个PCE细胞中含有微核的PCE数 并且计数200个细