《中国药典》2015年版微生物培训.ppt

中国药典 2015年版微生物检查修订解析 微生物检验 LOREMIPSUMDOLOR 01 微生物基础 02 药品微生物检验及控制 03 微生物检验用培养基的质量管理 04 微生物检验用菌种的使用和管理 01 微生物基础 PartOne 1 微生物概念 微生物 microorganism 是对所有形体微小 单细胞或结构较为简单的多细胞 甚至无细胞结构的低等生物的统称 种类 微生物类群十分庞杂 包括 1 无细胞结构的病毒 类病毒 拟病毒等 2 属于原核生物的细菌 放线菌 立克次氏体 衣原体等 3 属于真核生物的酵母菌和霉菌 单细胞藻类 原生动物等 01 体积小 面积大 02 吸收多 转化快 03 生长旺 繁殖快 04 适应强 易变异 05 种类多 分布广 2 微生物特点 3 微生物的分类 三型八大类 真核细胞型微生物 细胞核分化程度高 有核膜和核仁 细胞器完整 如真菌 原核细胞型微生物 细胞核的分化较低 仅有原始核 无核膜 核仁 细胞器很不完善 DNA和RNA同时存在 这类微生物众多 有细菌 放线菌 支原体 衣原体 立克次体 螺旋体 非细胞型微生物 是最小的一类微生物 无典型的细胞结构 只能在活细胞内生长繁殖 核酸类型为DNA或RNA 病毒属之 微生物的形态 葡萄球菌 微生物的形态 乳酸杆菌 微生物的形态 蜡样芽孢杆菌 微生物的形态 淡水中的螺旋菌 微生物的形态 青霉是种真菌 属于子囊菌 有的能产生青霉素 救了无数人的命 产生无性孢子 微生物的形态 酵母菌 微生物的形态 根霉 Rhizopus 是种真菌 属于接合菌 能产生无性孢子菌丝体的直径约12um黑的是孢子囊 细菌 细菌是一类个体微小 具有细胞壁的单细胞原核微生物 粘质沙雷氏菌的菌落特征 沙门氏菌的菌落特征 铜绿假单孢菌的菌落特征 弗氏志贺氏菌的菌落特征 粘质沙雷氏菌的菌落特征 细菌生长的环境因素 PH一般细菌的生长最适酸碱度 pH 为7 2 7 6 少数菌需在较酸或较碱的环境中生长繁殖 温度温度是细菌生长的重要因素之一 各种细菌的适宜温度范围相差很大 据此而有嗜热 52 嗜温及嗜冷菌之分 大多为嗜温菌 15 40 一般细菌的培养采用37 气体专性需氧菌 具有完善的呼吸酶系统 仅能在有氧环境下生长 微需氧菌 在低氧压 5 6 生长最好 兼性厌氧菌 兼有有氧呼吸和无氧发酵两种功能 但以有氧时生长较好 大多数病原菌属于此 专性厌氧菌 缺乏完善的呼吸酶系统 氧化还原电势高的呼吸酶 分解有毒氧基团的酶 只能在无氧环境中进行发酵 霉菌 真菌在微生物世界中可以称得上是个 巨人家族 真菌的个头较大 其中的许多成员对我们来说都是很熟悉的 例如 在潮湿的天气里 常常发现粮食 衣服 皮鞋上长了霉 我们做酱 酱油 豆腐乳用的曲霉和毛霉等霉菌 发面 酿酒用的酵母菌等都是真菌 就连人们爱吃的蘑菇 木耳等蕈子 也都是真菌大家族的成员 真菌是微生物中的一大类群 属于真核微生物 与人类关系非常密切 真菌是抗生素 如青霉素 头孢霉素 有机酸等多种发酵工业的基础 在自然界中则扮演着各种复杂有机物分解者的角色 然而有些真菌是病原菌 引起人类和动植物病害 有些真菌产生毒素 使人 畜中毒 严重者引起癌症 如黄曲霉产生的黄曲霉毒素毒害肝脏 易引发肝癌 各种霉菌的菌斑 各种病原真菌的菌落 青霉的菌落 青霉的菌落 酵母菌 提起酵母菌这个名称 也许有人不太熟悉 但实际上人们几乎天天都在享受着酵母菌的好处 因为我们每天吃的面包和馒头就是有酵母菌的参与制成的 我们喝的啤酒 也离不开酵母菌的贡献 酵母菌是人类实践中应用比较早的一类微生物 我国古代劳动人民就利用酵母菌酿酒 酵母菌的细胞里含有丰富的蛋白质和维生素 所以也可以做成高级营养品添加到食品中 或用作饲养动物的高级饲料 酵母菌在自然界中分布很广 尤其喜欢在偏酸性且含糖较多的环境中生长 例如 在水果 蔬菜 花蜜的表面和在果园土壤中最为常见 酵母菌的菌落 大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似 但比细菌菌落大而厚 菌落表面光滑 湿润 粘稠 容易挑起 菌落质地均匀 正反面和边缘 中央部位的颜色都很均一 菌落多为乳白色 少数为红色 个别为黑色 各种酵母菌的菌落 啤酒酵母的菌落 红酵母的菌落 4 微生物的营养 水碳源氮源无机盐生长因子 水 水是各种生物细胞必需的 水是良好的溶剂 微生物的新陈代谢过程中的一切生化反应都离不开水的作用 碳源 碳源是合成菌体成分的原料 也是微生物获取能量的主要来源 整体上看来 微生物可以利用的碳源范围极广 从大类上说 可以分为有机碳源和无机碳源两大类 凡必须利用有机碳源的微生物就是异养微生物 凡能利用无机碳源的微生物就是自养微生物 糖类是最广泛利用的碳源 氮源氮源主要是供给合成菌体结构的原料 很少作为能源利用 与碳源相似 微生物作为一个整体来说 能利用的碳源种类十分广泛 某些微生物 如固氮菌 能利用空气中分子态的氮或利用无机氮化物如铵盐 硝酸盐合成有机氮化物 多数致病菌则必须供给蛋白胨 氨基酸等有机氮化物才能生长 无机盐类 无机盐主要可为微生物提供除碳 氮以外的各种重要元素 微生物需要的无机盐类很多 主要有P S K Na Ca Mg Fe等 其主要功能为构成菌体成分 调节渗透压 作为某些酶的成分 并能激活酶的活性等 生长因子 有些微生物虽然供给它适合的碳源氮源和无机盐类 仍不能生长 还要供给一定量的所谓 生长因子 其种类很多 主要是B族维生素的化合物等 生长因子可以从酵母浸出液 血液或血清中获得 细菌典型的生长曲线 延迟期 对数期 稳定期 衰亡期 5 微生物的营养类型 根据碳源 能源及电子供体性质的不同 可将绝大部分微生物分为光能无机自养型 光能有机异养型 化能无机自养型 化能有机异养型四种类型 NH4 NO2 S H2S H2 Fe2 等 02 药品微生物的检验与控制 PartOne 药品微生物 PharmaceuticalMicrobiology 药品环境对微生物的影响消毒与灭菌无菌保障技术微生物监控微生物检验 药品微生物检查特点 药品因素抽样检查环境控制操作影响破坏试验培养观察OOS调查 一次性结论 结果判断 方法验证 过程控制 中国药典 2015年版微生物检验 1101无菌检查法1105非无菌产品微生物限度检查法 微生物计数法1106非无菌产品微生物限度检查法 控制菌检查法1107非无菌产品微生物限度标准1121抑菌效力检查法1421灭菌法9201药品微生物检验替代方法验证指导原则9202非无菌药品微生物限度检查指导原则9203药品微生物实验室质量管理指导原则9204微生物鉴定指导原则9205药品洁净实验室微生物检测和控制指导原则9206无菌检查用隔离系统验证指导原则 03 培养基的质量管理 PartOne 培养基的定义和分类 培养基液体 半固体或固体形式的 含天然或合成成分 用于保证微生物繁殖 含或不含某类微生物的抑菌剂 鉴定或保持其活力的物质 培养基或试剂的批量培养基或试剂完整的可追溯单位 是指满足产品要求 内部控制 和性能测试 产品型号和质量稳定的一定量的半成品或成品 这些产品在特定的生产周期生产 而且编号相同 培养基及试剂的性能在特定条件下培养基对测试菌株的反应 培养基的定义和分类 培养基的分类依据1 按组成成分分类2 按状态分类3 按用途分类4 按制备方法分类 1 按组成成分分类 1 纯化学培养基 有已知分子结构的纯度的化学成分配制而成的培养基 2 未定义和部分定义的化学培养基 全部或部分由天然物质 加工过的物质或其他不纯的化学物质构成的培养基 2 按状态分类 1 固体培养基 在液体培养基中加入一定量的固化物 如 琼脂 明胶等 加热至100 溶解 冷却后凝固成固体状态的培养基 倾注到平皿内的固体培养基一般称之为 平板 倒入试管并摆放成斜面的固体培养基 当培养基凝固后通常称作 斜面 2 半固体培养基 在液体培养基中加入极少量固化物 如 琼脂 明胶等 加热至100 溶解 冷却后凝固成半固体状态的培养基 3 液体培养基 固体培养基的对应词 是微生物或动植物细胞的液状培养基 它具有通气培养 震荡培养的优点 在静止的条件下 在菌体或培养细胞的周围 形成透过养分的壁障 养分的摄入受到阻碍 由于在通气或在振荡的条件下 可消除这种阻碍以及增加供氧量 所以有利于细胞生长 提高生产量 3 按用途分类 1 运输培养基 在取样后和实验室处理前保护和维持微生物活性且不允许明显增值的培养基 运输培养基中通常不允许包含使微生物增值的的物质 但是培养基应能保护保护菌株 例如 缓冲甘油 氯化钠溶液 2 保藏培养基 由于在一定期限内保护和维持微生物活力 防止长期保存对其的不利影响 或使其在长期保存后容易复苏的培养基 例如 营养琼脂斜面 3 悬浮培养基 将测试样本的微生物分散到液相中 在整个接触过程中不产生增值或抑制作用 例如 磷酸盐缓冲液 4 复苏培养基 能够使受损或应激的微生物修复 使微生物恢复正常生长能力 但不一定促进微生物繁殖的培养基 3 按用途分类 5 增菌培养基 通常为液体培养基 能够给微生物的繁殖提供特定生长环境 6 选择性增菌培养基 能够允许特定的微生物在其中繁殖 而部分或全部抑制其他微生物生长 7 非选择性增菌培养基 能够保证多种微生物生长的培养基 8 分离培养基 支持微生物生长的固体或半固体培养基 9 选择性分离培养基 支持特定微生物生长而抑制其他微生物生长的分离培养基 10 非选择性培养基 对微生物没有选择性抑制的分离培养基 按用途分类 11 鉴别培养基 能够进行一项或多项微生物生理或 和 生化特性鉴定的培养基 12 鉴定培养基 能产生一个特定的鉴定反应而通常不需要进一步确证试验的培养基 13 计数培养基 能够对微生物定量的选择性或非选择性培养基 14 确证培养基 在初步复苏 分离和 或 增菌阶段后对微生物进行部分或完全鉴别或鉴定的培养基 4 按制备方法分类 1 商品化即用型配培养基以即用形式或融化后即用形式置于容器 例如平皿 试管或其他容器 内供应的液体 固体或半固体培养基 完全可即用的培养基 需重新融化后的培养基 如用于平板倾注技术 使用前需重新融化并分装 如倾注到平皿 的培养基 使用前需重新融化 添加物质并分装的培养基 2 商品化脱水合成培养基使用前需加水和进行处理的干燥培养基 完全培养基 不完全培养基 使用的时候需要加添加剂 3 自制培养基依据完整配方的具体成份配制的培养基 培养基的质量保证 培养基的购买与接收 培养基由专人负责购买和接收 在收到培养基后 应检查以下内容 培养基的名称 批号 效期 COA 必要的安全和 或 危害数据等文件证明 实验室应建立相关的文件和台帐 在台帐上包括以下信息 接受日期 名称 货号 批号 外观的密封性 有效期 储存条件等检查内容 培养基的质量保证 贮存 应严格按照供应商提供的贮存条件 有效期和使用方法进行培养基的保存和使用 实验室应保存有效的培养基目录清单 清单应包括以下内容 容器密闭性检查 记录首次开封时间 内容物的感官检查培养基的贮存应建立经验证的有效期 观察培养基是否有颜色变化 蒸发 脱水 或微生物生长的情况 当培养基发生这类变化时 应禁止使用 培养基使用或再次加热前 应先取出平衡至室温 培养基的质量保证 培养基配制 严格遵守良好实验室规范和生产厂商提供说明 严格按照厂商提供的使用说明配制 如重量 体积 PH 制备日期 灭菌条件和操作步骤等 实验室使用各种基础成分制备培养基时 应按照配方准确配制 并记录相关信息 如 培养基名称和类型及试剂级别 每个成分物质含量 制造商 批号 PH 培养基体积 分装体积 无菌措施 包括实施的方式 温度及时间 配制日期 人员等以便溯源 以上需要详细的SOP 并严格按照SOP执行 培养基的质量保证 培养基配制 称重和溶解按称量数称量 必要时戴口罩或通风柜中操作 加适量水 充分混合 再加水至所需量 充分搅拌至完全溶解 含琼脂培养基加热前浸泡几分钟 PH值的测定和调整使用PH计测定 灭菌后冷却至25 时测定PH值PH值应在标准PH 0 2范围内 使用1mol L的氢氧化钠或盐酸溶液调整培养基的PH值 如需灭菌后调整PH值 则使用灭菌溶液 培养基的质量保证 培养基配制 分装将配制好的培养基分装容器体积应比培养基体积最少大20 灭菌湿热灭菌煮沸灭菌过滤除菌注意避免过度加热 1 大容积 1000ml 时容易过度加热 2 放置物品太多或灭菌后未及时冷却 检查PH值色泽灭菌效果均匀度等 培养基的质量保证 配制记录 培养基配制记录灭菌记录培养基质量控制记录 准确 及时 完整 给予一个可追踪性 具有唯一性的批号 例如 培养基的配制批号有培养基的配制日期和配制序号组成 150614A表示该培养基是2015年6月14日配制 配制序号为A 培养基灭菌指示条的表示 培养基的标签 培养基的名称 培养基的装量 培养基配制批号 配制人 配制日期 失效日期等 培养基的质量保证 培养基的使用 琼脂培养基的融化将培养基放到沸水浴中或采用有相同效果的方法使之融化 避免过度加热 固体培养基灭菌后的再融化仅允许一次 融化后的培养基放入47 50 的恒温水浴锅中冷却保温 融化后的培养基应尽快使用 放置时间一般不超过4h 未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用 倾注到样品中的培养基温度应控制在约45 左右 平板的制备和储存制备 融化培养基倾注平皿 至少3mm 置于水平面冷却凝固 储存 冷却凝固的平皿放于密封袋子中 置于暗处或5 3 冰箱保存 使用 表面接种的固体培养基 先对表面进行干燥 注意不要过度干燥 培养基的质量要求 微生物学要求 生长率按规定用适当方法将适量测试菌株的工作培养物接种至固体 半固体和液体培养基中 每种培养基上菌株的生长率应达到所规定的最低限值 选择性为定量评估培养基的选择性 应按照规定以适当方法将适量测试菌株的工作培养物接种至选择性培养基和参考培养基中 培养基的选择性应达到规定值 生理生化特性确定培养基的菌落形态学 鉴别特性和选择性 或试剂的鉴别特性 以获得培养基或试剂的基本特性 性能评价和结果解释若按照规定的所有测试菌株的性能测试达到标准 则该批培养基或试剂的性能测试结果符合规定 若基本要求和微生物学要求均符合规定 则该批培养基或试剂可被接受 中国药典 2015年版相关培养基变化 非无菌产品微生物限度检查 微生物计数法 通则1105 固体 对照培养基 比值0 5 2 0培养基的适用性检查液体 对照培养基 试验菌株生长良好 中国药典 2015年版相关培养基变化 非无菌产品微生物限度检查 控制菌检查法 通则1106 中国药典 2015年版相关培养基变化 非无菌产品微生物限度检查 控制菌检查法 通则1106 中国药典 2015年版相关培养基变化 非无菌产品微生物限度检查 控制菌检查法 通则1106 中国药典 2015年版相关培养基变化 非无菌产品微生物限度检查 控制菌检查法 通则1106 中国药典 2015年版相关培养基变化 非无菌产品微生物限度检查 控制菌检查法 通则1106 中国药典 2015年版相关培养基变化 Ch p2015培养基修订纯化水微生物限度检查法 微生物限度 取本品不少于1ml 经薄膜过滤法处理 采用R2A琼脂培养基 30 35 培养不少于5天 依法检查 通则1105 1ml供试品中需氧菌总数不得超过100cfu 04 微生物检验用菌种的使用和管理 PartOne 内容 菌种的相关术语与定义 1 法规要求 2 菌种的购买 接收 保藏 传代 使用 废弃 3 生物实验室安全 4 菌种的相关术语与定义 标准菌株从官方菌种保藏机构获得的并至少定义到属或种水平的菌株 来源已知 性能稳定 定义为0代 标准储备菌株标准菌株在实验室经过一次传代获得的一套完全相同的独立菌株 储备菌株从标准储备菌株转接一代获得的培养物 工作菌株由标准储备菌株 储备菌株或标准物质 经证明或未经证明 转接一代获得的菌株 不超过5代 工作菌株不应用来制作标准菌株 标准储备菌株或储备菌株 商业派生菌株对于从标准菌种保藏中心或其他有效的认证的商业机构获得的原包装的质控菌株 复苏和使用应按照制造商提供的使用说明书进行 环境分离菌从产品 原辅料 制药用水 环境等分离的菌株 可以做成储备菌株和工作菌株 传代任何形式的转种均被认为传代 菌种的相关术语与定义 保藏机构 CMCC 中国医学菌种保藏中心CMCC F 或CMCC B F代表真菌 B代表细菌ATCC 美国标准菌种收藏所著名的微生物保藏中心 创立于1899年 设在美国马里兰州罗克维尔市 收藏有细菌 真菌 动植物病毒 噬菌体 藻类和原生生物等共计16000株以上的微生物种株 NCIMB 英国食品工业与海洋菌种保藏中心NBRC 日本技术评价研究所生物资源中心CIP 法国巴斯德研究所菌种保藏中心 菌种的相关术语与定义 常用标准菌株 枯草芽孢杆菌 CMCC B 63501 ATCC6633 金黄色葡萄球菌 CMCC B 26003 ATCC6538 生孢梭菌 CMCC B 64941 ATCC19404 铜绿假单胞菌 CMCC B 10104 ATCC9027 大肠埃希菌 CMCC B 44102 ATCC8739 白色念珠菌 CMCC F 98001 ATCC10231 黑曲霉 CMCC F 98003 ATCC16404 法规要求 实验室必须保存着有满足试验需要的标准菌种 菌株 标准培养物 除检测方法 如药物敏感试验 抗菌性能测试 中规定的菌种外 还应包括应用于培养基验收质量控制 方法确认 证实 阳性对照 阴性对照 人员培训考核和结果质量保证等所需的菌株 并且 1 标准菌株必须从认可的菌种或标本收集途径获得 2 应有文件化的程序管理标准菌株 原始标准菌株 标准储备菌株和工作菌株 涵盖菌种申购 保管 领用 使用 传代 存储等方面 确保溯源性和稳定性 主要包括 标准储备菌株应定期传代 并作确认试验 包括活性 纯度 典型生理生化反应等 并有记录 每一只标准菌株都应以适当的标签 表示其名称 菌种号 接种日期和所传代数 记录中还应包括以下内容 从标准菌种到工作菌种的代数 菌种生长的培养基及培养条件 Ch p2015对菌种的要求 购置应从认可的国内或国外菌种保藏机构获得标准菌株 也可使用与标准菌株等效的可以溯源的商业派生菌株 保藏应采用适宜的方法保藏菌种 保证菌种的生物学特性稳定一致 复苏 复壮或培养物的制备应按供应商提供的说明书或按照验证的方法进行 从国内或国的外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后 即为标准储备菌株 标准储备菌株应进行纯度和特性确认 工作菌株标准储备菌株可用于制备工作菌株 工作菌株传代次数严格控制 不得超过5代 记录实验室必须建立和保存其所有菌种进出 收集 储藏 销毁记录 菌种的购买 接收 购买计划 购买的菌种一般为药典规定的标准菌种 应从CMCC授权的代理商处经过ISO9001认证机构购买 国外购买菌种 需要到公安局机关备案 菌种验收 由专人接收 检查 填写相关台帐 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿瓶的冻干菌 接收菌种时应检查安瓿的数量和名称 和每一支安瓿的完整性 在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息 接收标准菌种时 记录必须包括但不限于以下信息 1 菌种名称 2 代码 CMCC ATCC 3 菌种代数 4 供应商名称 5 生产批号 6 有效期 7 接收数量 8 接收日期 菌种的保藏 传代 菌种保藏微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏 避免死亡 污染 保持其原有形状基本稳定 以便于研究 交换和使用 微生物具有容易变异的特性