药品微生物限度检验规程1.doc

Q/操作标准 页号：1/21质量检验操作规程药品微生物限度检验规程起草人： 日期：审核人： 日期：批准人： 日期：执行日期：颁发部门： 质管部送达部门及份数：总经理、质管部、生产部、中心检验室、存档各1份，共5份。 药品微生物限度检验规程总 则1. 抽样1.1 按批号每批随机抽样方法取样。1.2抽样量应不少于检验用量(两个最小包装单位)一般要求的3倍。1.3抽样时凡发现有异常，应抽选有效的样品，因机械损伤明显破裂的包装不得作样品。1.4凡能从外观看出长螨、发霉及变质的药品，可直接判不合格，无需再抽样检验。2. 供试品保存供试品在检验前应保持原包装，保存在阴凉干燥处。3. 检验检验过程必须符合无菌技术要求，制成供试液后，应在均匀状态下取样，并在一小时内操作完毕。4. 检验量固体及半固体制剂检验量为10g，液体制剂为10ml。5. 供试液的制备5.1 固体、半固体供试品 称取5-10g置锥形瓶，加入50ml或100ml稀Q/药品微生物限度检验规程 页号：2/21释剂（生或0.1mol/L磷酸盐缓冲液），于45oC水浴中振摇使充分混匀，使成1：10供试液。5.2 液体供试品 量取10ml置无菌锥形瓶，加入90ml稀释剂，混匀成1：10供试液。6. 对照试验6.1 菌数测定阴性对照试验 吸取1ml的供用稀释液，于4个无菌培养平皿中，分别按细菌数、霉菌数测定方法注入培养基进行培养检查，不得长菌。6.2 阳性对照试验 方法同供试品检验，于供试液中加入规定阳性对照菌株50100个，作平行试验。7. 检验报告单位细菌、霉菌、酵母菌以1g或1ml为单位表示菌落数；控制菌一般以1g或1ml为单位表示是否检出。8. 复检8.1 细菌数、霉菌及酵母菌数一项一次测定不合格应作单项复检；控制菌检验以一次检出为准，不复检，但应保留检出菌株一个月供备查。8.2 复试需另取同批号样品，测定2次，以3次测定结果的算术平均值报告。细菌数测定1. 培养基 试剂1.1 营养琼脂1.2 无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2）或无菌生理盐水。2. 检验程序图解：Q/稀释稀释制备药品微生物限度检验规程 页号：3/21供试液1：1000供试液1：100供试液1：10供试品1ml1ml1ml23个平皿23个平皿23个平皿倾注琼脂482hr3035oC培 养菌落计数报 告3.操作步骤3.1 供试液制备 按各类制剂制备法制备供试液。3.2 稀释与吸样3.2.1 取1ml吸管吸取混匀的1：10供试液（或原液）1ml注入装有9ml的稀释剂的试管中，混匀成1：100（或1：10）的稀释液。3.2.2 吸样 取上述吸管分别取1：10（或原液）1ml，注入23个平皿中。3.2.3 另取1ml吸管按（3.2.1）操作，作下级的稀释与吸样。操作时必须充分混匀，减少误差。3.3 倾注琼脂与培养Q/药品微生物限度检验规程 页号：4/213.3.1 先将营养琼脂融化 置45oC水浴中，当各级供试液注入平皿后，将琼脂倾注入平皿，每皿约15ml，随即转动平皿使样液与琼脂充分混匀（混匀时切勿将培养基溅到皿及皿盖），置水平台上放置凝固。3.3.2 琼脂凝固后，平板倒置于3035oC培养452小时。4. 菌落计数4.1 用肉眼直接平板背面计数标记，或在菌落计数器上点计，然后用510倍放大镜检查，有无遗漏。菌落重叠以可分辩数计。4.2 平板上有片状菌落或花斑样菌落蔓延，或受到污染，该平板无效。4.3 计算各稀释级平均菌落数，同一稀释级平均值为平板平均落菌数，若平板间菌落数相差一倍以上，该稀释级不宜采用。（平均数15个除外）。5. 菌落数报告规则一般选平均数在30300之间的稀释级，作为菌数计算依据。5.1 若有一个稀释级的菌落平均数在30300时，以该稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。5.2 若有2个相邻稀释级平均数在30300时，先计算两级菌数的比值，比值2时，以两级平均数报告菌数；当比值2时，以低稀释平均平板菌落数乘以稀释倍数为报告菌数。5.3 若各稀释级平均在300以上，按最高稀释级以稀释倍数报告菌数；各级平均菌落数均小于30时，按最低稀释级以稀释倍数报告菌数。5.4 若各稀释级平均数均不在30300间，以最接近30或300的稀释级平均数乘以稀释倍数为报告菌数。5.5若各稀释级的菌落数在10个以下或无菌生长报告菌数为10个。6. 报告数书写6.1 菌落数在100个以内，按实测数报告。6.2 菌落数大于100时，取两位有效数字，第三位数按数字修约规则处理。Q/药品微生物限度检验规程 页号：5/21霉菌和酵母菌数测定1. 培养基、试剂1.1无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2）。1.2 无菌生理盐水。1.3 YPD琼脂培养基。1.4 虎红琼脂培养基。2. 检验程序图解供试液1：1000供试液1：100供试液1：10供试品1ml1ml1ml平皿2个平皿2个平皿2个倾注虎红琼脂2528oC722hr培 养菌落计数报 告Q/药品微生物限度检验规程 页号：6/213. 操作步骤3.1 供试液的制备与稀释，按细菌数测定项下方法进行。稀释级一般采用2级，每级分别取1ml于2个灭菌平皿内。3.2 各级稀释液注入平皿后，应该立刻将融化并冷至45oC左右的虎红琼脂培养液基约15ml倾注平皿内摇匀。3.3 凝固后，置2528oC培养箱内，培养722小时，如有可疑可标记后适当延长培养时间。4. 菌落计数方法4.1 霉菌菌落形态，具有放射状或树枝分枝的菌丝，初形成多无色透明，有明显折光性。成熟时多数有各种颜色孢子。4.2 酵母菌落形态，多数为园形凸起，边缘整齐，表面光洁湿润，呈不透明乳脂状，乳白色或粉红色，少数表面粗糙或皱褶。有时菌落周围呈细分枝状。琼脂内菌落，可呈铁饼形、三角形或多角形。4.3 菌落计数，一般在平板背面用肉眼直接点数，若有根霉或毛霉蔓延，应从平板背面观察霉菌生长中心点或蔓延区域计数。若液体制剂应计霉菌和酵母菌落总数。5. 菌数报告规则5.1 选菌落数在30100之间的稀释级平板计数，以平均数乘以稀释级数报告菌落数。5.2 两个稀释级平均菌落均在30100之间，当两级比值2时，以两级平均值为报告菌落数；比值2时，按低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为报告数。5.3 各稀释级平均数均不足30时，以最低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为报告菌数。6. 菌数报告的书写6.1 固体及半固体制剂报告霉菌，液体制剂报告霉菌和酵母菌总数。6.2 菌数报告的书写参照细菌数测定。Q/药品微生物限度检验规程 页号：7/216.3 不得按计数规则报告的情况。6.3.1 空白对照平板有菌生长，表面培养基已被污染。6.3.2 各稀释级平板上生长的菌落数不符合10倍递增稀释规律，菌数显示混乱。6.3.3 同一稀释级的两个平板上生长的菌落数均在15个以上，但菌数相差一倍以上。6.3.4 菌落蔓延生长覆盖整个平板无法计数。大肠杆菌检验法1培养基、试剂1. 1无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2）或无菌生理盐水1.2胆盐乳糖培养基1.3MUG培养基1.4靛基质试液1.5曙红亚甲蓝琼脂1.6 麦康凯琼脂。1.7 蛋白胨水培养基1.8 磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基1.9 甲基红指示液1.10 -萘酚乙醇溶液1.11 40%氢氧化钾1.12 枸椽酸盐培养基1.13 革兰氏染色液2 对照用菌液 大肠杆菌CMCC(B)44102营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36土1培养1824h后，用0.9无菌氯化钠溶液稀释至1：10，使对照菌加入量含菌50100个(一般用量为o.1m1).3检验程序图解Q/药品微生物限度检验规程 页号：8/21供试品供试液胆盐乳糖培养基361oC1824小时培养物MUG培养基524小时361oC MUG阳性MUG阴性靛基质阴性靛基质阳性靛基质阴性靛基质阳性检出大肠杆菌供试液胆盐乳糖培养物未检出大肠杆菌曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板361oC 1824小时23个可疑菌落无菌落生长枸椽酸盐利用试验革兰氏染色菌检靛基质试验甲基红试验试验VP（I）（M）未检出大肠杆菌Q/药品微生物限度检验规程 页号：9/214. 操作步骤4.1 增菌培养取胆盐培养基3份，每份各100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50-100个，作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。培养18-24小时，阴性对照应无菌生长，取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种至5mlMUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察，阳性对照管呈现荧光，MUG阳性，供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性；无荧光MUG阴性，然后加数滴靛基质试液于MUG 管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试液本色，为阴性。4.2 分离培养如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板培养18-24小时。4.3 如上述供试液培养物的分离平板有菌落生长，即挑选2-3可疑菌落作、-、试验及革兰染色。5. 结果报告 完全符合下面结果，判定为检出大肠杆菌。5.1 染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌。5.2 乳糖发酵管产酸产气，或产酸不产气。5.3 INViC试验反应为+-或-+-。沙门氏菌检验法1. 培养基、试剂1.1无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2）或无菌生理盐水1.2 普通肉汤培养基1.3四硫磺酸盐增菌液1.4胆盐硫乳（DHL）琼脂1.5伊红美蓝（EMB）琼脂Q/药品微生物限度检验规程 页号：10/211.6三糖铁（TST）琼脂1.7蛋白胨水培养基1.8尿素琼脂培养基1.9氰化钾培养基1.10赖氨酸脱羚酶培养基1.11糖发酵培养基1.12半固体肉汤琼脂1.13沙门氏菌属AF“O”多价血清1.14革兰氏染色液1.15柯凡克试剂2检验程序图解四硫磺酸盐增菌液营养肉汤TST琼脂斜面供试品供试液DHL琼脂平板ENB琼脂平板氰化钾试验赖氨酸脱羧酶试验每 尿素酶试验靛基质试验半固体肉汤琼脂革兰氏染色镜检血清学试验报 告3. 操作步骤3.1 增菌培养 取供试液10ml加到100ml普通肉汤内混匀，于361oCQ/药品微生物限度检验规程 页号：11/21培养1824小时，取1ml加入含10ml四硫磺酸盐增菌液的试管内，再于361oC培养242小时，若增菌液变浊，表明有菌生长，需进行下一步分离。3.2 分离培养 轻微振动增菌培养液，用接种环沾取12环，分别接种于DHL和EMB琼脂平板，于361oC培养242小时，检查有无沙门氏菌落，其菌落特征见下表：培养基菌落特征DHL琼脂无色至浅橙色，半透明，多数菌落中心带黑色或几乎全黑色ENB琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润 由于药物影响可能出现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙，也应注意挑选。3.3 筛选试验 以接种针沾取23个疑似菌落中心部位，划线接种于TST琼脂斜面并穿刺底层，于361oC培养242小时观察，若斜面呈红色，底层呈黄色，硫化氢阳性（底层黑色）或阴性（无黑色），应作沙门氏菌疑似菌进一步鉴定，对有疑问的菌珠，可补作乳糖，蔗糖发酵及氧化酶试验。3.4 革兰氏染色镜检 取沙门氏疑似菌，涂片作革兰氏染色，镜检沙门氏菌为革兰氏阴性菌。3.5 生化反应3.5.1 靛基质试验 用接种环沾取少量培养物，接种至蛋白胨水培养基中，照大肠杆菌检验法操作，沙门氏菌为阴性。3.5.2 尿素酶试验 用接种环沾取培养物，划线接种于尿素酶培养基，于361oC培养24小时，若斜面不变色，为沙门氏菌。3.5.3 氰化钾试验 用接种环分别沾取一环疑似菌株的肉汤培养液，接种于氰化钾培养基和对照培养基内接种后，即以橡胶塞塞紧，于361oC培养2448小时，若对照管有菌生长，试验管无菌生长为沙门菌反应。3.5.4 赖氨酸脱羧酶试验，用接种环沾取少量培养物，接种在赖氨酸脱Q/药品微生物限度检验规程 页号：12/21羧酶培养基中，同时接种对照培养基，于361oC培养2448小时，若对照管黄色，试验管呈紫色为沙氏门菌反应。沙氏门菌生化反应初步鉴别序号硫化氢靛基质尿素酶氰化钾赖氢酸脱羧酶可能菌属1+-+沙门氏菌属2+-+沙门氏菌属（少见）爱德华菌属3-+沙门氏菌属、埃希氏菌属、甲型副伤寒沙门氏菌属-埃希氏菌属，志贺氏菌属以上反应可能是沙门氏菌，反应序号1为沙门氏菌属典型反应，序号2应补作甘露醇和山梨醇发酵试验，两者为阳性则为沙门氏菌，序号3应排出TST斜面产酸菌株，若动力试验阳性，需进一步鉴定。3.6 动力检查 用接种针沾取培养物，穿刺接种半固体肉汤琼脂管，于361oC培养24小时，若培养基无混浊蔓延现象，在室温保留23天再观察，沙门氏菌除少数例外，均能运动，有动力表现。3.7 血清学试验 用接种沾取沙门氏菌管AF“O”多价血23环，涂干净洁载玻片，再挑取疑似菌的TST斜面培养物少许与血清混合，将载玻前后侧动，在暗背景下观察：凡与血清出现凝聚者，应以生理盐水与同一菌株培养物作对照试验，对照无凝聚才可确定为阳性反应，不与血清出现凝聚时，应以接种环取上述斜面培养物，置23ml生理盐水的试管中，制成浓菌悬液于100oC水浴中保温30分钟待冷，再将此菌悬液与沙门氏菌属AF“O”多价血清作凝聚试验。如不出现凝聚则为阴性反应。1. 结果报告及处理 凡疑似菌株培养物的生化试验及血清学试验结果按下表报告结果：Q/药品微生物限度检验规程 页号：13/21序号血清凝集试验(AF“O”)生化反应报告及处理意见凝集反应100oC30分钟凝集反应生理盐水对照1+-符合检出沙门氏菌2-+-符合检出沙门氏菌3-不符合未检出沙门氏菌4+-不符合进一步鉴定5-+-不符合进一步鉴定6-符合进一步鉴定铜绿假单胞菌检查法1试液、指示液1.1 0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液 1.2 1%盐酸二甲基对苯二胺试液 1.3 盐酸试液 1.4 氯仿 2 培养基 2.1 营养肉汤培养基 2.2 胆盐乳糖(BL)培养基 2.3 营养琼脂培养基 2.4 溴代十六烷基三甲胺 2.5 绿脓菌素测定用培养基(PDP琼脂) 2.6 明胶培养基 2.7 硝酸盐胨水培养基3 对照用菌液铜绿假单胞菌CMCC(B)10104营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36土1培养1824h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1：10，使对照菌加入量含菌50100个(一般用量为o1m1)。4检验程序图解:Q/药品微生物限度检验规程 页号：14/21供试品供试液胆盐乳糖增菌液十六烷三甲基溴化铵平板普通肉汤琼脂斜面革兰氏染色镜检氧化酶试验绿脓菌素试验报告报告报告明胶液化试验硝酸盐还原产气试验42生长试验3613611824小时1824小时3611824小时阴性阳性阴性5 增菌培养 取胆盐乳糖培养基3瓶，每瓶100ml，2瓶分别加入1：10供试液10ml(相当于供试品1g或1ml)，其中一瓶加入对照菌50l00个作为阳性对照。第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于36 1培养1824h(必要时可延至48h)。阳性对照应生长良好，阴性对照菌应无菌生长6 分离培养 轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取12环培养液(如有菌膜应挑取之)，划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂药品微生物限度检验规程 页号：15/21平板，于36培养1824h。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、圆形或无定形、边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色。当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试晶平板无菌落生长或无疑似菌落生长，可报告1g或lml供试晶未检出铜绿假单胞菌。7 纯培养 供试品分离平板生长5 所述典型菌落或呈疑似菌落时，以接种针轻轻接触单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取23个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养，作以下检查。7.1 革兰染色镜检7.1.1 革兰染色(见大肠杆菌检验法)7.1.2 镜检 铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列。7.2 生化试验7.2.1 氧化酶试验 取一小块白色洁净的滤纸置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸上，随即滴加1滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30s内纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应.7.2.2 绿脓菌素试验 取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定用培养基(PDP)斜面上，36土1培养24h后，观察斜面有无色素，如有色素，在试管内加氯仿35ml，以无菌玻棒搅碎培养基并充分振摇。使培养物中的色素完全萃取在氯仿液内。静置片刻，待氯仿分层，用吸管将氯仿移至另一试管中，加入盐酸试液(1mol1)约lml，振摇后静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色、即为阳性反应，无粉红色出现为阴性反应。如培养基斜面无色素产生，应于室温培养12天再按上法试验。凡经再次检验，绿脓菌素试验仍为阴性者应继续以下试验。16/217.2.3 硝酸盐还原产气试验 以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物接种于硝酸盐胨水培养基中，置36土1C培养24h，观察结果。如果在培养基内的小倒管中有气体产生，即为阳性反应，表明该培养物能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。小倒管内无气泡者为阴性反应。7.2.4 41生长试验 以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物于0.9%无菌氯化钠液中，制成菌悬液。然后将菌悬液划线接种于营养琼脂斜面上，立即置4l的恒温水浴箱内，务使整个斜面浸没在水浴中，培养2448h，斜面如有菌苔生长者为阳性反应；无菌苔生长为阴性反应。7.2.5 明胶液化试验 以接种针沾取营养琼脂斜面培养物少许，穿刺接种于明胶培养基中，穿刺深度应接近培养基的底部，于36士1C培养24h。取出放人冰箱内1030min。如培养基呈溶液状，即为明胶液化试验阳性反应；如明胶呈凝固状，为阴性反应。8 结果报告8.1 供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告1g或lml供试品检出铜绿假单胞菌。8.2 供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培养物，绿脓菌素试验阴性时，其硝酸盐还原产气试验、41，C生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，亦报告1g或lml供试品检出铜绿假单胞菌。8.3 凡与7.1与7.2结果不符时报告1R或lml供试品未检出铜绿假单胞菌。Q/药品微生物限度检验规程 页号：17/21金黄色葡萄球菌检查法1试液、指示液 1.1 0.9%无菌氯化钠溶液或无菌磷酸盐缓冲液(pH7，2) 1.2 革兰染色液1.3 无菌枸橼酸钠氯化钠溶液 1.4 兔(或人)血浆 1.5 1酚磺酞指示液 2 培养基 2.1 营养肉汤培养基 2.2 营养琼脂培养基2.3 亚碲酸盐肉汤培养基 2.4 卵黄氯化钠琼脂培养基 2.5 甘露醇氯化钠琼脂培养基， 2.6 血琼脂培养基 供试品供试液普通肉汤琼脂斜面血浆凝固酶报告36136136124小时2448小时24小时卵黄高盐琼脂或甘露醇高盐亚碲酸钠肉汤或北沙参胨水或普通肉汤革兰氏染色、镜检3 检验程序图解:药品微生物限度检验规程 页号：18/214 对照用菌液取金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003营养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基中，36土1培养1824h，用0.9%无菌氯化钠溶液，按10倍递增稀释至1：10，对照菌加入量为50100个.5 增菌培养 取营养肉汤(或亚碲酸钠肉汤)培养基3瓶，每瓶100ml，2瓶分别加入10ml供试液，其中1瓶加入50100个对照菌作为阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液(pH7.2)作为阴性对照，置36土1培养1824h(必要时可延至48h)。阴性对照应无菌生长。6 分离培养 将上述供试品增菌培养液及阳性对照增菌液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置36土l培养2472h.当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于表1所列特征，可报告为1g或lml供试品未检出金黄色葡萄球菌。当供试品分离平板生长菌落与表1所列特征相似的典型形态，应挑取该菌落作纯培养，对非典型形态的菌落，可增加血琼脂平板分离鉴别。表1 金黄色葡萄球菌在三种选择性培养基上菌落形态特征培养基菌落形态特征卵黄氯化纳琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有分解卵磷脂后产生的乳浊圈，菌落直径12mm甘露醇氯化纳琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有黄色环，菌落直径0.71mm血琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有溶解红细胞后产生的透明溶血环，菌落直径较大，24mm7 纯培养 当供试品分离乎板生长菌落与表1所列菌落特征相似或疑似时，应选取23个以上菌落，分别用接种针，轻轻沾取菌落药品微生物限度检验规程 页号：19/21中心表面培养物，接种于营养琼脂斜面上，于36土1培养1824h，取其培养物作革兰染色、镜检及血浆凝固酶试验。7.1革兰染色、镜检7.1.1 革兰染色(见大肠杆菌检查法6.6)。7.1.2 镜检 金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，无芽孢，一般不产生荚膜。排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。7.2 血浆凝固酶试验取无菌试管(10X100mm)3支，各加入血浆-无菌水(1:1)0.5ml，1支加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml，其余2支作对照管：1支加入金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对照；另一支加人营养肉汤或0.9无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。三管同时置36士1水浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h。检查时，轻轻将试管倾斜，(动作勿大)仔细观察，阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应；不凝固为阴性反应。8 结果判断 当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验呈阳性结果，供试品培养物按下列情况报告或处理：8.1 革兰阳性球菌，血浆凝固酶试验阳性反应者，报告1g或lm供试品检出金黄色葡萄球菌。8.2 革兰染色镜检不是革兰阳性球菌，或血浆凝固酶试验阴性反应，报告1R或lml供试品未检出金黄色葡萄球菌。8.3 阴性对照有菌生长或阳性对照试验呈阴性结果，试验结果无效。备注 血浆制备 以无菌注射器吸取灭菌的含5枸橼酸钠的0.9氯化钠溶液1ml