MALDITOF质谱技术分析与鉴定病原细菌研究.doc

微生物学通报MMAR 20, 2009, 36(3): 416426 2009 by Institute of Microbiology, CAS研究快报MALDI-TOF 质谱技术分析与鉴定病原细菌研究其布勒哈斯 1,2田世民 2*邹明强 2贺银凤 1(1. 内蒙古农业大学 内蒙古 呼和浩特艳 2赵贵明 2陈010018)(2. 中国检验检疫科学研究院 北京 100123)摘 要: 基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术分析供试细菌并获得其蛋白质 图 谱 , 确定了与 质 谱 分析有关的最 佳 培 养 条 件 和 样 品 前 处理方法 , 建立 了 应 用 MALDI-TOF-MS 鉴定细菌的方法。通过对供试的不同细菌属、种和亚种的 12 株植物病原细菌全 细胞分析后的质谱图结果表明, 根据特异性或不同的质量离子峰, MALDI-TOF-MS 能进行在细菌 属、种、亚种和菌株水平上的区分和鉴定。该方法准确、灵敏度高, 且分析过程简单快速, 具有 广泛的开发和应用意义。关键词: MALDI-TOF MS, 细菌, 质量指纹图谱, 鉴定Analysis and Identification of Pathogenic Bacteria byMALDI-TOF Mass SpectrometryQibulehasi1,2TIAN Shi-Min2*ZOU Ming-Qiang2HE Yin-Feng1CHEN Yan2ZHAO Gui-Ming2(1. Inner Mongolian Agricultural University, Hohhot, Inner Mongolia 010018, China) (2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)Abstract: Based on Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS), protein mass spectrometric profiles for bacteria were obtained, method for analysis of the bacteria was developed, and culture conditions and pre-treatments for bacteria samples were optimized. Results from analysis of twelve plant pathogenic bacteria of different genus, species and subspecies, and comparison of the protein mass spectrometric profiles showed that, MALDI-TOF-MS was able to identify the plant bacteria at the different levels of bacterial strains. This analytical method has the advantages of simple process, high sensitivity and accuracy, showing the useful significances.Keywords: MALDI-TOF-MS, Bacteria, Mass finger-printing, Identification基质 辅助激 光解析 电离 飞行时 间质 谱 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)是近些年发展起来 的用于微生 物(细菌、酵母菌和真菌等 )快速区分和鉴定的一项新技术, 其基本原理为：将微生物样品与等量的基质溶液混合或分别点加在样品板上, 溶 剂挥发后形成样品与基质的共结晶; 利用激光作为 能量来源辐射结晶体, 基质从激光中吸收能量使样基金项目：国家“十一五”科技支撑计划项目(No. 2006BAK10B09); 中国检科院基本科研基金项目(No. 2007JK011)* 通讯作者：Tel/Fax: 86-10-85747382;: 收稿日期：2008-10-22; 接受日期：2008-12-11品解吸,子电离,sepedonicus 引起的马铃薯环腐病和 Clavibacter mi-chiganensis subsp. insidiosus 引起的苜蓿萎蔫病, 均 已经被列入 2007 年重新修订的对外检疫性有害生 物名录(农业部公告第 862 号)。Clavibacter fangii 引起小麦细菌性枯苗病, 是 1987 年刘庆都等发现和鉴基质与样品之间发生电荷转移使得样品分经过飞 行时间检测器, 将检 测到 的离 子峰为纵坐标, 离子质荷比(m/z)为横坐 标, 形成质量图谱; 通过软件分析比较, 筛选并确定出特异性(指纹)图谱, 从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴 定 1 。 MALDI-TOF-MS 适合对生物 活 性 物 质的快 速、大规模、高通量筛选, 已经成为临床诊断、环境监测和微生物分类研究或者食品加工质量控制中 的重要方法。该技术的优点是待测组分中的杂质(如 较高浓度的盐、非挥发性成分以及去垢剂)不影响目标物质的测定, 且信息直观、操作简单、快速准确等2。通常情况下, 菌体形态学观察、生理生化反应、 酶联免疫吸附和 PCR 方法等用于对细菌的鉴定和检 验 , 但是 , 这 些 方 法通常操作复 杂 , 如需 要进行革 兰氏染色、氧化酶试验或者制备抗体、选择 PCR 引 物等, 而且有时难以达到对细菌种、菌株水平上的 鉴定。因此, 也需要一种快速、准确地鉴定细菌微 生物的新技术。基质辅助激光解析电离飞行时间质 谱具有以上优点而能满足快速鉴定的需要。刘海洪 等 综 述 了 质 谱 鉴 定 细 菌 及 分 析 成 分 和 方 法 , MALDI-TOF-MS 能够完 成细菌多种成分的分析 , 包括蛋白质、脂类、脂多糖、多肽及其它能被离子 化的分子3。由于这些成分具有种、属特征或与其 分类位置密切相关, 可作为细菌分类的指标或生物 标记物标识某一类或某种细菌的存在。目前, 以蛋 白质为靶标分子, 利用 MALDI-TOF-MS 鉴定食品 和医学微生物的报道较多, 例如：埃希氏菌大肠杆 菌 O157:H7、金黄色葡萄球菌和李斯特菌等的检测 和鉴定研究；质谱仪器公司也先后推出了配套的谱 图分析软件(如 BioTyper、Mascope 等), 一些食品微 生物的标准质量指纹图谱数据库正在建设中49。本研究采用 MALDI-TOF-MS 对重要植物病原 细菌的鉴定进行研究, 为进一步开展植物病原细菌 的鉴定检验及相关数据库的建立提供科学依据。在 我国, Pseudomonas syringae 引起的玉米细菌性褐斑 病和 Erwinia carotovora 引起的玉米细菌性茎腐病发 生较为普遍; Acidovorax avenae 引起的玉米细菌性 叶疫病于 2004 年在南京首次报道; Erwinia (Pantoea) stewartii subsp. stewarii 是引起玉米细菌性枯萎病、 Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis 引起的 玉米细菌性萎蔫病、Clavibacter michiganensis subsp.10定的我国小麦上的一种新病害。随着我国从国外引进植物种子数量的增加, 和国内商业化制种的迅 速发展而导致种子的大规模异地调运, 对这些病原细菌的准确、快速的检验鉴定的要求也愈来愈重要。1材料与方法1.1材料1.1.1试剂和仪器：本 研究所用 的 标准品胰 岛 素(Insulin)、溶剂乙腈、甲酸和三氟乙酸(TFA)均购于Sigma 公司 , 色谱纯 ; 基质 - 氰基 -4- 羟 基肉桂酸 (-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA) 购自 于美 国 ABI 公司; 营养肉汤琼脂培养基(NBY)、普通营养琼脂培养基(NA)、luria bertani(LB) 培养基购自北 京陆桥技术有限责任公司; 质谱仪为美国 ABI 公司的 MALDI-TOF/TOF 4700。1.1.2供试菌株和培养方法：本研究所用的供试细菌的编号、名称、来源见表 1。供试的标准菌株首先从冷冻干燥保存管转移到营养肉汤培养基上活化, 在斜面上转接培养后 4C 下保存备用。选棒杆菌属 密执安种(Clavibacter michiganensis)下的 3 个亚种IQCC11、IQCC15 和 IQCC16 为模式菌株, 设取不 同培养条件(3 种培养基：NBY、NA 和 LB, 3 种培养 温度：24C、28C 和 32C, 3 种培养时间：24 h、48 h 和 72 h)。研究观察培养条件对 MALDI-TOFMS1.2分析结果的影响。基质溶液的配制基质溶剂为：水-乙腈(1：1, V/V), 每毫升基质溶剂中加 0.1 L 三氟乙酸(TFA)和 10 mg -氰基-4-羟基肉桂酸, 经超声波溶解后形成基质饱和溶液。 此溶液在20C 冰箱可保存 1 个月。1.3样品处理方法1.3.1直接分析法：培养好的细菌, 用无菌牙签挑取单个 菌落 , 涂在样品板上 , 室温下晾干后覆盖 0.5 L 基质溶液, 晾干进板后进行质谱分析。1.3.2单一溶剂处理：用无菌牙签挑取 1 mg5 mg细菌放入 1.5 mL E-cups 管里, 先用 0.2% 的 TFA 洗2 次, 均在 10000 r/min 下离心 2 min 后, 弃上清, 沉微生物学通报4182009, Vol.36, No.3表 1 供试菌株Bacterial strains of analyzedTable 1菌株编号No. of strains菌株名Name of strains菌株来源Source of strainsIQCC 3Acidovorax avenae subsp. avenaeChina General Microbiological Culture Collection CenterIQCC 11IQCC 8IQCC 16Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensisClavibacter michiganensis subsp. sepedonicusClavibacter michiganensis subsp. tessellariusAmerican Type Culture Collection CenterThe Institute of Plant Protection Chinese Academy of Agricultural SciencesAmerican Type Culture Collection CenterIQCC 5Xanthomonas campestris pv. holcicolaAmerican Type Culture Collection Center淀菌体上加 50 L 0.2% 的 TFA, 10000 r/min 下离心2 min 后上清液转移到新 E-cups 管中备用。1.3.3混合溶剂处理：用无菌牙签挑取 1 mg5 mg细菌放入 1.5 mL E-cups 管里, 加 300 L 纯水混匀,再加入 900 L 无水乙醇混匀, 在 10000 r/min 下离心2 min 并弃掉上清液 , 然后 , 向 E-cups 管中加入 分析的质量图谱间没有发现明显的差异, 且 2000 D以下和 15000 D 以上 未 获得有效 的 离子峰 (结果 略)。观察还发现在 NBY 培养基上细菌生长较快, 所以, 选定 NBY、28C 培养 24 h 作为供试细菌的最佳培养条件。在最佳条件下对以上 3 个模式菌株进 行质谱分析、单一溶剂处理后和混合溶剂处理后的 分析结果表明, 混合溶剂处理后的细菌质量图谱的 离子峰最多、信噪比高。2.2 MALDI-TOF 分析结果2.2.1 棒杆菌属细菌的 MALDI-TOF 分析结果：棒杆菌属(Clavibacter)6 个病原细菌的 MALDI- TOF 分 析 结 果如图 1 和表 2 所示 , 它们 之间分别 有10 到 30 个不等的离子峰, 直接对比其质量图谱很容 易发现不同细菌菌株间的差异。表中所列 6 个细 菌菌株的蛋白质质量图谱比较结果如下：对比棒杆 菌属 6 个菌株的指纹图谱信息, 未发现属级别上共 同的特征性离子峰。图谱 a、b、c 和 f 的比较结果显示, 棒杆菌属密 执安种(Clavibacter michiganensis)下的 4 个亚种有 一个共同的离子峰, m/z 为 2884, 可作为棒杆菌密 执安种的生物标记物。4 个菌株间还分别有 2 到 15 个不同的亚种特征峰。进一步比较图谱 e 和 f 发现, 棒 杆菌属密执 安种 in si di o s us 亚种的 标准菌 株 IQCC15 和分离菌株 IQCC6 有 9 个共同的离子峰,50 L 70%甲酸和 50 L 纯乙腈, 同上离心,取上清液转移到新 E-cups 管中备用。1.4点样最后,取 0.5 L 处理好的上清液点加在 MALDI TOF专用 的样品 板上 , 在室 温条件 下自 然晾干 ( 约需 3 min), 其上滴加 0.5 L 基质溶液覆盖,备用, 每个样品重复 3 个孔。1.5质谱分析同法晾干后采用氮激光源, 波长为 337nm, 线性阳离子检测模式; 加速电压为 15000 V; 延迟时间为 300 ns;激光强度为 2500; 每个样品点设激光随机射击 40 个 点、每次射击 50 次, m/z 采集范围为 1000 D20000 D。为了保证在 1000 D20000 D 范围内蛋白质质荷比 的准确性 , 用胰岛素 (m/z 为 5734) 进行内部校 准 ,校正后获得的质荷比误差小于 6。采用仪器配置的Data Explorer 4.0 软件对质谱图进行基线改正和默 认平滑处理。每样品 3 个重复的蛋白质谱图叠加处理后作为样品的质谱图。2结果与分析2.1细菌培养条件和样品处理方法的规范化三个模式菌株在三种不同培养条件下的蛋白质m/z 分别为 2884、4352、4775、5085、5201、5732、6291、6482 和 6713, 而图谱 e 有 14 个离子峰, 图谱f 有 19 个离子峰。由此可看出, MALDI-TOF-MS/wswxtbcnIQCC 1Erwinia carotovora subsp. carotovoraThe Institute of Plant Protection Chinese Academy of Agricultural SciencesIQCC 10IQCC 2Erwinia (Pantoea) stewartii subsp. stewartiiPseudomonas syringae pv. syringaeIsolated from NanjingThe Institute of Plant Protection Chinese Academy of Agricultural SciencesIQCC 4Xanthomonas campestris pv. holcicolaIsolated from ShanghaiIQCC 9IQCC 6Clavibacte fangiiClavibacter michiganensis subsp. insidiosumChina General Microbiological Culture Collection CenterIsolated from NanjingIQCC 15Clavibacter michiganensis subsp. insidiosumAmerican Type Culture Collection Center微生物学通报4202009, Vol.36, No.3图 1 棒杆菌属 6 个菌株的质量图谱Fig. 1 Mass spectrometric profiles of six species of genus ClavibacterNote: a: IQCC11; b: IQCC8; c: IQCC16; d: IQCC9; e: IQCC6 ; f: IQCC15.表 2 棒杆菌属 6 个菌株的 MALDI-TOF-MS 分析结果Peaks obtained from the analysis of six species of genus Clavibacter with MALDI-TOF-MSTable 2insidiosum IQCC 6m/zIntensitym/zIntensitym/zIntensitym/zIntensitym/zIntensitym/zIntensity212822.83218011.7922152.162216260936.1111.76260727263.544.642867288313.017.342869288317.9319.33288315.04288313.4428822.0129154.1130035.993030324612.2612.73348735363650381342689.0210.197.849.3617.3535352.8935494.12356522.9236405.0537657.94435212.8043521.864350449229.217.3846361.42472841.46/wswxtbcnC. m. subsp. ne- C. m. subsp. sepe- C. m. subsp. tessel-braskensis IQCC 11 donicus IQCC 8 larius IQCC 16 C. fangii IQCC 9C. m. subsp.insidiosum IQCC 15Avg. Avg.C. m. subsp.Avg. Avg. Avg. Avg. Avg. Avg. Avg. Avg.Avg. Avg.续表C. m. subsp. nebraskensis IQCC 11C. m. subsp. sepedonicus IQCC 8C. m. subsp. tessellarius IQCC 16C. m. subsp. insidiosum IQCC 6C. m. subsp. insidiosum IQCC 15C. fangiiIQCC 9Avg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.Intensity479118.36477614.63478449143.338.8247791.49477516.2350848.08508115.87508552074.262.605082520117.978.64521814.3352085243528354105532100.5028.566.4715.717.9557325764579798.0089.9035.61574289.675735575498.7735.115732576310.1432.6457265756580787.2382.5416.76583519.40582318.89604961496193629137.5414.6612.5610.23611618.69628063509.6814.8962972.79644364828.6827.9764889.01648219.3564896.3666183.43671211.9267214.13671313.7568239.876918705511.3648.177063710024.2023.9570947129724095.9922.144.897068711910.8897.757225728625.3050.627239726945.0134.71749812.7575366.5875264.52751615.5384893.91860687299235957414.2814.1010.8594.7485713.6685588965929495396.287.075.6634.558994929395385.967.6915.55930795533.9529.4295535.5495529816998814.4941.623.44993010042103926.095.816.641005910408104425.0726.7515.251039210.57微生物学通报4222009, Vol.36, No.3能区分鉴定同一属内不同种的细菌、同一种内的不同亚种和同一亚种内的不同菌株。2.2.2玉米病原菌的 MALDI-TOF 分析结果：6 个 玉米病原细菌的 MALDI-TOF 分析结果如图 2 和表3 所示。图谱 a 与图 谱 b 的比较 结果显示, 欧文氏菌 属 ( Erwini a ) 不 同种的 菌株 间没有 发 现 共同的 离子峰。/wswxtbcn图 2六个玉米病原菌的质量图谱Fig. 2 Mass spectrometric profiles of six species of corn pathogenic bacteriaNote: a: IQCC1; b: IQCC10; c: IQCC2; d: IQCC3; e: IQCC4; f: IQCC5.表 3 玉米病原菌的 MALDI-TOF-MS 分析结果Table 3 Peaks obtained from the analysis of corn pathogenic bacteria with MALDI-TOF-MSE. c. subsp. caroto- vora IQCC 1E. s. subsp.stewarii IQCC 10P. s. subsp.syringae IQCC 2A. a. subsp.avenae IQCC 3X. c. subsp. holci- cola IQCC 4X. c. subsp. holci- cola IQCC 5Avg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.Intensity217011.43219213.59218213.68221414.7922142.05246110.1326083.33260693.23260499.82266021.8926424.0827029.5428029.0427932.5428284.30291210.2729455.0430894.9330826.7231165.4931225.9133539.08331124.91358716.5336078.3936254.7336464.97368567.67363614.31370711.8837454.31386726.3840263.81微生物学通报4242009, Vol.36, No.3续表Avg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.IntensityAvg.m/zAvg.Intensity4171423031.7612.52432943436.934.6143092.7543027.55434836.17440013.45439713.15449410.7547158.784716477712.2325.45471347746.2712.92475914.58480213.54490925.7451655.315214100.0052027.32520116.3951986.19526024.8652776.6753135.89539245.7854006.67552317.4655226.19581541.17581348.3658753.51586814.1558637.9261224.1661536234639228.0828.3511.1864126.82647414.6764728.41669799.45661127.7466668.6166644.846749677416.8110.446821687327.027.25681010.6669355.75706710.0371495.73716354.73715919.4171356.277203726044.0897.327200725810.5145.1972448.9872922.77728335.24735992.16731237.5777501.5877261.2177453.77833765.25870011.0288033.4688917.0389805.26934395085.4121.7953983.82953659.03959141.12958912.4596151.0896734.549655970421.7214.91983298641.581.2598097.37/wswxtbcnE. c. subsp. caroto- E. s. subsp. stewarii P. s. subsp. syringae A. a. subsp. avenae vora IQCC 1 IQCC 10 IQCC 2 IQCC 3X. c. subsp. holci- cola IQCC 5X. c. subsp. holci- cola IQCC 4图谱 a 有 19 个离子峰, 图谱 b 有 10 个离子峰, 这些特征离子峰可作为同属不同种间的区分依据。图谱e 与图谱 f 比较显示, 黄单胞菌属(Xanthomonas)两个 菌株间有 15 个共同的离子峰, m/z 为 2214、2606、4400、4716、4774、5201、5523、5815、5868、6472、6664、 7203、7260、 9539、9591, 可作为目标菌株 的生物标记物, 也显示出标准菌株 IQCC5 和分离菌 株 IQCC4 间的相似性很大。图谱 e 有 12 个特征离子峰 m/z 分别为 2660、2912、3607、3635、4802、6810、7159、7312、8700、8891、9655 和 9704; 图 谱 f 有 2 个特征离子峰 m/z 分别为 2642、6935; 可作为鉴别菌株来源的依据。菌株 IQCC5 和 IQCC4 重复性 10 次 MALDI-TOF分析的质 荷比数据进 一步 利 用 Matlab R-2007a(Matlab Com., USA)软件进行主成分分析的结果图3 所示, 两个菌株间的差异明显, 10 次重复实验结果 的稳定性和一致性也很好。将对快速、准确鉴定植物病原细菌及其来源具有重要意义。通过本研究 发现 , 样品 处理方法 对 MALDI- TOF 质谱分析结果有一定影响。经过分析比较单一 溶剂和组合溶剂处理的细菌质量图谱后, 组合溶剂处理后分析得到的图谱提供的信息量多、离子峰的 个数和强度均较好, 从而确定出较好的试验结果。这可能是由于组合溶剂处理过程中, 水能够洗掉培 养基中水溶性杂质, 乙醇能洗掉培养基中的其它类 杂质 , 因 此 不 同培 养基 对细菌 质 量 图谱的 影响 较小。此外, 甲酸能够保护分析物质、避免分解、并 有利于获得稳定的结果。本研究中, 供试细菌的同属不同种间有明显差 异 , 而没有发现属级 上的特 征性离子 峰 , 这与 Mazzeo 等报道的食源型耶尔森氏菌的 MALDI-TOF11分析结果相 一致 。本 研究 还进行 了标准 菌株 IQCC5 和分离菌株 IQCC4 质谱鉴定的比较研究, 结 果显示 2 个菌株之间不仅具有很大的相似性, 而且 还有明显的差异。所以, 在应用 MALDI-TOF 进行 未知的分离菌株的分类和鉴定上将具有很大的应用 前景。本文着重研究建立了应用 MALDI-TOF 技术区 分鉴 定 植物 病原细菌的 方法 , 但是 , 鉴于 目前菌种 来源 的限 制 , 下一 步将基于已建立的 MALDI-TOF 分析方法进行更多供试细菌菌株的鉴定检验的研究, 为植物及食品中致病菌的质量指纹图谱数据库的建 立奠定基础和作用。参 考 文 献1Fenselau C, Demirev PA. Characterization of intact mi- croorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spec- trometry Reviews, 2001, 20(4): 157171.吴多加, 李凤琴 . 在食品微生物 检测和鉴定应用的一种质谱新技术. 中华预防医学杂志, 2005, 39(5): 361363. 刘海 洪 , 杜宗 敏 , 杨瑞 馥 . MALDI-TOF-MS 在细 菌检 测和鉴定中的应用. 微生物学免疫学进展, 2003, 31(2):4753.Phan-Thanh L, Mahouin F. A proteomic approach to study the acid response in Listeria monocytogenes. Electropho- resis, 1999, 20(11): 22142224.Bernardo K, Pakulat N, Macht M, et al. Identification anddiscrimination of Staphylococcus aureus strains using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry. Proteomics, 2002, 2(6): 747753.图 3 黄单胞菌属两个菌株的 3 个主成分分数的三维散点分布图Fig. 3 Three-dimensional scatter plot of the Principal component analysis of two X. c. pv. holcicola strainsNote: a: IQCC 4; b: IQCC 5.23该研究结果初步表明, MALDI-TOF 质谱分析技术可进行不同属的细菌、同属内不同种的细菌、同 种内不同亚种和不同菌株间的区分和鉴定。43讨论5本研究通过对 12 种植物病原菌的 MALDI-TOF质谱分析结果表明, 细菌质量指纹图谱法可以进行 对不同细菌属、种、亚种和菌株的区分和鉴定, 这微生物学通报4262009, Vol.36, No.36Johanna EC, Faith AH. 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