实时定量逆转录聚合酶链反应检测大肠癌患者术前外周血 CK20 mRNA和CEA mRNA的临床意义.doc

实时定量逆转录聚合酶链反应检测大肠癌患者术前外周血 CK20 mRNA和CEA mRNA的临床意义首席医学网 2009年03月25日 09:52:22 Wednesday 73作者：周海茵，葛成华，王世伟，叶古祥，唐文贤，赵旭鸿，范珍妮作者单位：200090 上海，上海市杨浦区中心医院普外科（中心实验室） 【摘要】 目的 探讨大肠癌患者外周血CK20 mRNA和CEA mRNA的表达及其临床意义。方法 采用实时定量逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR）技术，对68例大肠癌患者及30例健康志愿者（对照组）术前外周血CK20 mRNA和CEA mRNA水平进行检测。结果 在对照组中CK20 mRNA和CEA mRNA 均无表达，而在大肠癌组中CK20 mRNA阳性表达率为45.6%，CEA mRNA阳性表达率为39.7%，二者联合检测阳性率为55.9%，较单项检测阳性率高（P0.05），二者的表达与性别、肿瘤部位和肿瘤分化程度无明显相关，与肿瘤临床分期、淋巴结转移和肝脏转移明显相关。结论 CK20 mRNA和CEA mRNA可作为大肠癌细胞血行播散的标志，联合检测有助于提高肿瘤微转移的检出率及判断预后。 【关键词】 大肠肿瘤；微转移；外周血Clinical significance of CK20 mRNA and CEA mRNA in peripheral blood of patients with colorectal cancer by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction ZHOU Hai-yin,GE Cheng-hua,WANG Shi-wei,YE Gu-xiang,TANG Wen-xian,ZHAO Xu-hong,FAN Zhen-ni.Department of General Surgery,The Central Hospital of Yangpu District,Shanghai 200090,China Abstract Objective To investigate the expression of CK20 mRNA and CEA mRNA in peripheral blood of patients with colorectal cancer and its clinical significance.Methods CK20 mRNA and CEA mRNA were detected in 68 patients with colorectal cancer before operation,30 health adults by QRT-PCR.Results CK20 mRNA and CEA mRNA were undetected in the control group,the positive rate of CK20 mRNA among colorectal cancer patients was 45.6%,and of CEA mRNA was 39.7%.The positive rate of combination detection was 55.9%.It was higher than the rate of detection alone.There was no statistically significant difference of positive rate between two detection methods.The expression of CK20 mRNA and CEA mRNA were not significantly correlated with sex of patients,the place of the tumor or differentiation level of cancer cells,but correlated with clinical stage,lymph nodes metastasis and liver metastasis.Conclusion CK20 mRNA and CEA mRNA were useful maker of blood dissemination of colorectal cancer cell and the positive rate of micrometastasis be maybe raised by combination detection.The expression of CK20 mRNA and CEA mRNA may be regarded as a reference indicator. Key words colorectal cancer;micrometastasis;peripheral blood 大肠癌是我国发病率较高的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年升高趋势，其术后复发及远处转移率达20%45%1。因此早期检测出循环癌细胞对判断肿瘤复发和转移及指导临床综合治疗有重要意义2。 1 对象与方法 1.1 研究对象 68例大肠癌患者选自2007年1月2008年3月在我院接受手术治疗并经病理确诊的患者，男39例，女29例，年龄2688岁，中位年龄65岁。临床分期：期6例，期24例，期27例，期11例。肿瘤分化程度：高分化腺癌26例，中分化28例，低分化11例，未分化3例。对照组30例健康志愿者来自同期我院健康职工。 1.2 仪器与试剂 定量PCR仪（美国生物应用公司ABI7500），Trizol试剂（上海闪晶分子生物科技公司），CK20 mRNA和CEA mRNA PCR试剂盒（上海达为科生物科技公司）。 1.3 RNA提取 采集对照组及大肠癌组患者术前肘静脉血5 ml（草酸钾抗凝），1 h内用淋巴细胞分离液分离有核细胞，将分离的有核细胞收集到1.5 ml离心管中，12 000 rpm离心5 min,弃上清，在沉淀中加入Trizol 500 l,混匀置室温10 min，加入氯仿200 l混匀，4 10 000 rpm离心5 min，吸取上层水相于1.5 ml离心管中，并加入2倍体积预冷异丙醇混匀，置-20 冰箱20 min，4 10 000 rpm离心10 min（以沉淀RNA）。弃上清，用预冷75%酒精（DEPC处理水配制）500 l漂洗一次，4 10 000 rpm离心10 min，弃上清，留沉淀，充分吸尽残留液，65 干式恒温器，干燥10 min，20 l DEPC处理水融解RNA,-80 保持待用。 1.4 逆转录反应制备cDNA 标本处理后的RNA 70 预变性5 min，迅速置于冰浴以防RNA复性，反应体系的配制方法：RT反应液18 l，M-MLV逆转录酶1 l，RN asin 1 l加入离心管中混匀，在每个反应管中加入20 l上述反应液，加入预变性的RNA 5 l，37 水浴60 min，95 预变性5 min，以灭活M-MLV逆转录酶。 1.5 PCR扩增反应 每管取PCR反应液43 l，Taq酶2 l加入总无菌离心管中混匀，每个反应管中加入45 l上述反应液，加入RT反应液5 l，95 预变性5 min，95 变性15 s，60 退火30 s，60 延伸30 s，共40个循环，最后72 延伸10 min；根据所获得的标准曲线得到各检测标本的浓度（copies/ml）。 1.6 结果判断 以RNA浓度1.0103 copies/ml为阳性，1.0103 copies/ml阴性3。 1.7 统计学处理 CK20 mRNA和CEA mRNA阳性率用百分率表示，采用EXCEL软件统计，率的比较用2检验，P0.05为差异有统计学意义，P0.01为差异有显著统计学意义。 2 结果 2.1 CK20 mRNA和CEA mRNA的表达 大肠癌组中CK20 mRNA阳性者的水平为（11 055.951 649.61）copies/ml，CEA mRNA阳性者的水平为（12 664.362 990.17）copies/ml。CK20 mRNA和CEA mRNA在各组中表达列于表1。表1显示大肠癌组CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性率分别为45.6%（31/68）和39.7%（27/68），对照组中CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性率均为0，大肠癌组CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性率之间差异无统计学意义（P0.05），CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性率在大肠癌组与对照组之间差异有显著统计学意义（P0.01）。表1 CK20 mRNA和CEA mRNA在各组中的表达 2.2 联合检测阳性率（至少一项阳性）与单项阳性比较 大肠癌组中联合检测阳性率55.9%（38/68）较CK20 mRNA 45.6%（31/68）与CEA mRNA 39.7%（27/68）单项检测的阳性率有明显升高，但与单项比较差异无统计学意义（P0.05）。 2.3 CK20 mRNA和CEA mRNA的表达与大肠癌临床病理因素的关系 表2显示CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性表达在患者性别、肿瘤部位及分化程度之间比较差异无统计学意义，CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性表达在肿瘤临床病理分期之间比较差异有统计学意义（P0.05），CEA mRNA的阳性表达在淋巴结是否转移的患者之间比较差异亦有统计学意义（P0.05），而CK20 mRNA的阳性表达在淋巴结是否转移的患者之间比较差异有显著的统计学意义（P0.01），CK20 mRNA和CEA mRNA在肝脏有无转移患者阳性表达的比较差异有显著的统计学意义（P0.01），可见肿瘤分期越晚，淋巴结和肝脏转移者其阳性表达率越高。表2 CK20 mRNA和CEA mRNA阳性表达与肿瘤临床病理因素的关系 3 讨论大肠癌的复发和转移与其他恶性实体肿瘤一样，以微转移为基础和前提，然而常规检测方法不能有效检测出微循环中的癌细胞和微转移灶，因此术前不能及时发现微转移，不利于肿瘤的正确分期及治疗方案的制定，术后不能及时发现复发及转移，以致不能更好地改善预后和延长生存期4。随着PCR技术的不断发展，实时定量PCR（QRT-PCR）技术能从106107个细胞中检出1个肿瘤细胞，该技术具有敏感性高、特异性强、简单快速的优点，使外周血肿瘤微转移的检测成为可能5。近年来细胞角蛋白家族成员作为检测微转移的指标备受关注6。细胞角蛋白是上皮细胞骨架的主要成分，表达于正常上皮细胞、上皮细胞原发性肿瘤及其转移肿瘤细胞。CK20具有组织特异性，其局限于胃肠上皮细胞，在正常骨髓、血液和淋巴结中均无表达，而几乎全部胃大肠肿瘤均明显表达，且侵袭、转移、扩散到其他器官时始终保持稳定7。CEA是一种特异性较高的肿瘤相关抗原，大约95%的大肠癌有CEA基因表达。因此根据CK20与CEA的分布特点使其成为特异的大肠癌的肿瘤标志物及微转移检测指标。Funaki等8、Xu等9利用RT-PCR技术检测大肠癌患者外周血微转移癌细胞，发现大肠癌复发和转移者CK20 mRNA均为阳性，并且随Dukes分期的进展CK20 mRNA的表达水平增加。钟平来等10发现直肠癌患者外周血CEA mRNA表达阳性率与远处转移有明显相关性，对术后的判断具有较高的可信度，本实验支持上述观点。本研究结果显示68例大肠癌患者外周血CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性表达率分别为45.6%和39.7%，显示微转移在近40%的大肠癌患者中存在，联合检测阳性率为55.9%，较单项为高，虽然差异没有统计学意义，但联合检测有助于提高检出率。同时本研究还显示，CK20 mRNA和CEA mRNA的阳性表达率均与肿瘤临床病理分期、淋巴结转移和肝脏转移相关，而与性别、肿瘤生长部位、肿瘤分化程度无明显相关，这表明肿瘤分期越晚，肿瘤释放入循环血中的癌细胞越多，CK20和CEA的表达阳性率越高，复发和转移的几率越大，预后越差，亦提示CK20 mRNA和CEA mRNA可以作为肿瘤细胞血行播散的独立标志物。因此尽早动态监测外周血中CK20 mRNA和CEA mRNA有助于早期发现微转移及微转移病灶的形成，对于肿瘤分期和恶性程度做出更精准的判断。CK20 mRNA和CEA mRNA在期患者中的阳性率阳性表达率较高，可将这两项指标用于大肠癌术前常规实验室检查，以利肿瘤的分期。对于术前检测出外周血CK20 mRNA和CEA mRNA高表达的大肠癌患者，应该可以认为循环血中存在癌细胞，我们提出可以在术前采用新辅助化疗方法抑制与杀灭微转移癌细胞，从而控制微转移及微转移灶的形成。【参考文献】 1 Yamaguchi K,Takagi Y,Aoki S,et al.Significant detection of circulating cancer cells in the blood by reverse transcriptase-poly-merase chain reaction during colorectal cancer resection.Ann Surg,2000,232:58-60.2 Raj GV,Moreno JG,Gomella LG.Utilization of polymerase chain reaction technology in the detectal of solid tumors.Cancer,1998,82（8）：1419-1442.3 丁昌平,张敏,韩芳,等.胃癌患者外周血中CK20 mRNA的检测及其临床意义.放射免疫学杂志,2007,20（1）:72-74.4 Feezor RJ,Copeland EM,Hochwald SN,et al.Significance of micrometastasis in colorectal cancer.Ann Surg Oncol,2002,9（10）:944-951.5 Miura M,Ichikawa Y,Tanaka K,et al.Real-time PCR（Taq Man PCR） quantfication of carcinoembryonic antigen（CEA） mRNA in the peripheral blood of colorectal cancer patients.Anticancer Res,2003,23（25）:1271-1275.6