总菌数测定1.doc

细菌总数的测定（1）培养计数法一、目的1.掌握从微生物群体中土壤和饲料等）获得纯种微生物的分离和培养技术。2.掌握无菌操作技术。二、材料和器皿1. 天平、取样工具、涂布棒(接种棒)。 2. 无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。 3. 无菌水。 4. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。三、实验操作步骤1、取样 将待测样品充分混匀，取少量，备用。2、 倒平板 熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。3、编号 取5支无菌空试管（15150mm）依次编号为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。4、分装无菌水 按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的各无菌空试管中。5. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡1020min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次、摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。 减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入， 勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。6、 培养及计数计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。计平皿中菌落数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀 释度的各平板平均菌落数。规律：不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数；当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。计数原则：选平均菌落数在30300之间者进行计算1.仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报 告之。2.若有2个稀释度的平均菌落数在30300之间时，则按两者的菌落总数之比来决 定，若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍 数报告之。4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，则以最接近300或30的平均菌 落数乘以稀释倍数报告之。6. 若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。7在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，然后乘以2作为整个平板的菌落数。7、 菌落总数报告方式菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为了缩短数字后面的零位，可用10的指数来表示。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。8. 计数 选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在30300之间的平皿，霉菌选菌落数在10100之间的平皿，最后换算成每克待测干样品所含菌数。 同一稀释度的平均菌落数稀释倍数每克样品含菌数 = 1样品含水量(2) 直接镜检法一、目的要求1、明确血球计数板计数的原理2、掌握测定细胞总数、活菌数百分率的技术二、实验原理镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成。每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。 血球计数扳的构造血球计数板计数网的分区和分格三、实验器材待测菌悬液，显微镜，血球计数板，载玻片，电吹风，盖玻片，接种环，0.1%吕氏美蓝染色液。四、方法步骤1、菌悬液的制备为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含5-10个为宜，可采用10倍系列稀释法。对于固体待测物，取10g放入盛有90ml无菌水的三角瓶中，充分震荡20分钟，使待测物与水充分混合，此为待测物10-1悬液，吸取1ml此悬液，置于9ml无菌水中，另用无菌吸管吹吸3次混匀，此为10-2悬液，以此类推。2、镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。如有污物，则需清洗，用点吹风吹干后才能进行计数。3、加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余菌液。样品要均匀充满计数室，不可有气泡。4、显微镜计数加样后静止5min，然后将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍物镜寻找计数室的位置，然后换成高倍物镜（40倍）进行计数。显微镜视野中的光线要暗一些，否则，不容易看清计数室的方格线。计数时，对位于线上的细菌，可采取只计数两条边的办法，即遵循查上不查下，查左不查右的原则。当芽体达到母细胞大小1/2时，即可计作两个细胞。细胞数（mL）=80小格内酵母菌细胞数/8040010000稀释倍数=4na106式中 n稀释倍数 A平均每个中格细胞数5、活菌数的测定 滴一滴0.1%吕氏美蓝液于载玻片中央，再用接种环取菌液