九龙江水大肠杆菌群测定的实验报告1.doc

九龙江水大肠杆菌群的测定林淑丽（漳州师范学院10级生物系食品科学与工程 101304116）摘要：本文通过多管发酵法、革兰氏染色法两种不同的方法测定九龙江水大肠杆菌群数量。初步掌握多管发酵法及革兰氏染色法。了解大肠杆菌在饮水中的重要性和革兰氏染色原理在细菌分类鉴定的重要性。关键词：多管发酵法 大肠杆菌 九龙江水 革兰氏阴性 无芽孢杆菌 THE DETERMINATION OF COLIFORM BACTERIA WHICH IN THE JIULONG RIVERLin Shuli(10Food science and engineering in Biology department, Zhangzhou Normal University 101304116)Abstract: this article through multiple tube fermentation and grams staining method two different methods to determine the Kowloon river escherichia coli group of quantity. Preliminary grasp tube fermentation and grams staining method. Understand the importance of e. coli in drinking water and gram stain principle in the importance of bacteria classification and identification. Keywords: much tube fermentation; E. Coli; the water of Jiulong River; gram-negative; sporeless bacterium大肠杆菌（学名：Escherichia coli，通常简写为E. coli）)是生活在温血动物（包括鸟类和哺乳动物）大肠中的重要细菌种类，对食物正常消化具有重要作用。技术上，大肠菌群被定义为一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，可利用乳糖在48小时内35之下产生气体的杆菌。在水净化和污水处理领域，大肠杆菌很早就被选作水污染程度的指示性物种，标志着有多少人类粪便存在于水中，其测量标准为大肠菌群指数。故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。大肠杆菌也常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。1 材料与方法 1.1 试验菌株培养与培养基的制备1.1.1 试验菌株 大肠杆菌1.1.2 培养基的配制与培养条件 本实验所用培养基采用乳糖胆盐蛋白胨培养基和伊红美蓝琼脂培基， 培养温度：37 ，培养时间：1- 2天，常压空气下培养。1.2 操作步骤1.21 多管发酵 1. 水样的采集： 用高温灭菌过的试剂瓶到九龙江取水，将瓶子连瓶盖一起伸到10-15 厘米的深处打开瓶塞，等水满后盖上盖子后从水中取出。运送水样时应避免玻璃瓶摇动，水样溢出后又流回瓶中，从而增加污染。 2. 水样的稀释：将灭菌的三根小试管标上1、2、3的记号，各装4.5ml的无菌。充分振荡水样，从中吸取0.5ml于1号试管中，充分振荡既得1：10的稀释液。同理配置2,3号试管1：100，1：1000的稀释液。3. 水源水的检查 (1) 初步发酵试验:有50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵瓶中，加入50ml水样（轻度污染水的测定);在1支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨的大发酵管中，加入10ml水样（轻、中度污染水的测定各一支）。 (2) 从原水样、1：10，1：100，1：1000的稀释液各吸取1ml于四支经过灭菌的 装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨中。（每吸取一次，吸头都要换一次） (3) 将上述溶液混匀后，于36摄氏度培养24h，24h未产气的继续培养至48h。记 录其稀释液的产气管数（如图表一），进行复发酵试验。 (4) 平板分离:经24h 培养后，将产酸产气及48h 产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于 伊红美蓝琼脂平板上，再于37下培养18-24h,将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。 （5）复发酵试验: 经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阳性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖胆盐蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1-3个，37培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表，即得大肠菌群数。 1.22 革兰氏染色 1. 制片（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中间加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，制成很薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：让涂片在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）注意：要用活跃生产期的幼培养物做革兰氏染色；涂片用的载玻片要洁净无油污迹，否则影响涂片。挑菌量应少些，涂片宜薄，过厚重叠的菌体则不易观察清楚。2. 初染（1）结晶紫色染色：将玻片置于干净的培养皿上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1-2分钟。（2）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。3. 媒染（1）用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟。（2）水洗：用水洗去碘液。4.脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性细菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性细菌。而脱色时间过短，革兰氏阴性细菌则会被误认为是革兰氏阳性细菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄、脱色时玻片晃动的程度等因素的影响。脱色时间一般约20-30s。5. 复染（1）用番红复染约2分钟。（2）水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。（3）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。6镜检镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。2 结果与分析 2.1 稀释液产气管数 （表一)浓度现象10110-110-210-3是否产气是是是是是颜 色黄色黄色黄色黄色黄色2.2 大肠菌群检数表1：大肠菌群检数表(严重污染水)接种水样量/ml每升水样中大肠菌群数备注10.10.010.001238000据大肠菌群检数表可知：每升水样中大肠杆菌群数为23000，故得九龙江水属于严重污染水。2.2油镜下观察到的菌体在显微镜下观察到的大肠杆菌的形态杆形，红色。3总结与讨论（1） 通过这次实验，我们学习了测定水源大肠杆菌的数量的两种方法，多管发酵法和革 兰氏染色法。并且初步掌握了其原理及操作方法。（2） 在多管发酵的初发酵中水样接种于发酵管内，24h 内小套管中有气泡形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在量少的情况下，也可能延迟48h 后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做平板发酵和复发酵试验，才能确定是否是大肠菌群。48h 后仍不产气的为阴性结果