第九章 遗传重组机制.doc

第九章 遗传重组机制教学目的：了解遗传重组的概念、过程和机制。教学重点：接合、转化、转导和转座。课时分配：3学时。 遗传重组的概念：细胞之间或DNA分子之间核苷酸片段的交换或者转移。 遗传重组的类型： 同源重组 同源染色体间或同源序列之间某区段的交换。包括真核生生物同源区段的交换，细菌同源区段的交换 位点专一性重组 供体DNA仅整合在受体DNA的某一位点的重组。如噬菌体仅能重组在E.coli的生物素操纵子与半乳糖操纵子之间 转座重组 一些DNA片段或噬菌体DNA能在大肠杆菌的质粒间、DNA间来回转移的重组 异常重组 指一些非法交换、不对等交换现象.如末端连接和链的滑动类型需同源序列需RecA蛋白需序列特异性的酶同源+位点特异性+转座异常？1 同源重组 1.1 同源重组的分子机制最常见的同源重组的分子机制为Holliday模型，其过程如下： a 联会 同源的非姊妹染色单 体间联会形成联会复合体b 酶切 内切酶在DNA分子 上各切开一条单链c/d 交换重接 e 形成交联桥结构f 分支迁移g 形成Holliday结构h/i分子构型变化，分子绕交 联桥旋转180度 j Holliday中间体拆分 图9-1 Holliday模型1.2 遗传重组的酶学机制在遗传重组过程中，尤其在同源重组中需要recA蛋白和recBC蛋白，recA蛋白又叫重组酶、重组蛋白、X蛋白、依赖于ATP的酶。recA蛋白由E.coli自身编码，该基因位于58分钟处，1058bp，此蛋白有353个氨基酸组成其主要作用是促进同源DNA联会，促进DNA分子间单链交换形成交联桥和Chi结构，此酶有多种特性。 recBC蛋白：在同源重组中具有核酸酶的作用、切断Holliday中中间体完成重组。此酶又叫外切核酸酶。在同源重组过程中，例如在细菌的接合、转化、转导过程中都有此酶起作用。图9-2 遗传重组的酶学机制1.3 真核生物的遗传重组真核生物遗传重组的机制和过程了解的不清楚，目前知道的联会复合体结构是遗传重组的结果，两个DNA分子在形成联会复合体前是如何接触的，还没有更多的了解。但是，在一些真菌，如红色面包霉的非正常的子囊饱子的排列（5：3，6：2）等情况的出现与异源双链的形成与Holliday模型中的异源双链的形成和修复有关系，发生重组修复完全孢子排列正常，不正常修复则出现基因转换，它包括染色单体转换和半染色单体转换基因转换：gene conversion 子囊菌的四分体中出现的基因不规则分离的现象： 无重组时规则分离， 4 : 4 有重组无修复时不规则分离，3:2:1:2 半染色单体转换 有重组修复不完全时不规则分离，3:5 半染色单体转换 有重组修复完全时不规则分离，2:6 染色单体转换1.4 细菌的同源重组 （1）细菌接合过程中的重组 F或Hfr 细菌环状DNA的两条链中的一条解开从5开始，单链进入F细胞，进入的单链在细胞中进行复制，然后以双链形式与 F-的基因组联会，以链置换的形式单链插入F-图9-3 子囊菌孢子形成过程中的基因转换（1）无重组；（2）有重组但无修复，有丝分裂分离；（3）一条异源双链被修复出现3:5的分离比例；（4）两条异源双链按同一方向进行矫正，出现2:6的分离比例。的基因组。 （2）细菌转化过程中的遗传重组 供体DNA以双链形式感染受体细胞与受体DNA联会 DNA的一条单链侵入受体的DNA中与其中的一条连汇合位置被取代的部分的受体单链被降解 DNA聚合酶、联接酶作用产生部分杂合双链 通过复制产生稳定的转化子 （3）转导过程中的遗传重组 由噬菌体携带的双链DNA进入受体细胞 DNA以双链形式与受体DNA联会 局部单链侵入，取代受体的DNA片段 全部侵入两次双链交换，产生重组 1.5 噬菌体之间的交换重组 噬菌体之间的重组属于同源重组，两个不同基因型的噬菌体的DNA首先联会，受体DNA的一条链出现切口，供体DNA的一条部分降解，供体的一条链侵入受体中形成分支 DNA，分支移位，最后形成插入式重组体和交换式重组体。2 位点专一性重组 2.1 附着位点噬菌体attP位点的结构 (POP) 235bp P O P E.coli的attB位点结构 (BOB) att 位点 gal B O B bio 4bp GCTTTTTTATACTAA 4bp 2.2 噬菌体整合的分子机制 （1）联会 噬菌体进入E.coli中自动成为环状结构，以此环状结构参自身的attP区与E.coli的attB区互补联会。 （2）酶的结合 整合酶：(Int)噬菌体的int基因编码一种DNA结合蛋白，此酶对POP有强的亲和力，对BOB也有合力，具有拓扑异构酶的活性，即可以DNA切断再连起来。整合寄主因子：(I H F)由E.coli编码的一种结合蛋蛋白，对attP位点有强的亲和力。Int .IHF二者结合在供体和受体DNA的互补处。 （3）酶切 整合酶在一条链的+4位，另一条链的-2位切开attB和attP，形成参差不齐的5单链末端，5-OH 3-P。 （4）重接 切开后瞬间DNA分子发生旋转，又在整合酶作用下使断口处连起来。重新连接时断头与断头之间发生错接导致噬菌体整合到E.coli的基因组。 在Int.IHF作用下完成整合作用，但在切离时除Int. IHF参与，还需噬菌体编码的切除酶（Xis)，在整合过程中没有DNA的分解也没有。图9-4 噬菌体整合过程的分子机制3 异常重组 不需要DNA同源序列或彼此同源性很小，重组蛋白、转座酶的重组，是最原始的重组途径，也是基因组进化的重要途径。这种途径可能和癌症发生、遗传性疾病、基因组进化有关，重组的结果导致移码、缺失、倒位、融合、DNA的扩增 4 转座 转座：遗传因子改变自身位置的行为 转座因子：Transposable element 可移动位置的遗传因子的总称 转座子：Transposon 转座因子的一种类型 4.1 转座的类型、机制和遗传效应 （1）转座的类型 复制型转座 供体上的转座子被复制，转座后供体上仍存在转座子，需转座酶、解离酶 非复制型转座 供体上的转座子先释放出来、然后转到受体后供体上不再存在转座子，只需转座酶供体被破坏或被修复 保守型转座 供体上的转座子不释放，供体与受体接触，然后转座子转到受体中图9-5 三种转座类型 （2）转座的机制 切开 供体含有Tn3转座子，其转座酶可以识别受体质粒上的靶序列，在靶序列两侧各一条单链上切一切口，转座酶还可以识别自身两边的反向重复序列并在3端切开 连接 供体与受体结合成为共联体，使供体切下IS或Tn3反向重复序列末端和受体粘性末端以共价键齐头相连，形成两个缺口 复制 由DNA聚合酶修补复制补上缺口，由连接酶连接，使在IS两端形成两个正向重复序列 重组 在特定位点进行重组，结果共联体分成两部分，一部分含有原有的转座子，一部分插入了转座子位置上出现转座子、新位置上的转座子两侧出现正向重复序 （3）转座的遗传效应 A、引起插入突变，如果在操纵子上游则引起极性突变 B、插入位上出现新基因 C、增加同源序列的整合， D、准确切离引起回复突变 E、不准确切离引起染色体畸变 F、改变染色体结构，转入后促使染色体缺失、倒位 G、调节某一基因的活动 H、转座子可带入新的基因引起变异，利于进化 4.2 真核生物的转座因子 （1）玉米的AcDs系统 指玉米细胞中可移动位置的两个相互作用的因子构成的系统。Ac：激活因子、Ds：解离因子、C为有色基因，位于玉米的9号染色体上，只要C存在即为有色破坏了C基因即为无色，Ds基因也位于9号染色体上，它可以移动位置到C基因的近旁或插入C基因中，破坏C的作用，它还可从C基因中或近旁再脱离出来，而使C基因又恢复活性，因此，Ds基因叫做：跳跃基因。但是，Ds基因的活动受位于 号染色体上的Ac基因的控制，Ac基因形成一种扩散物质作用于Ds基因，转位、脱离的来回循环形成了玉米的斑点。 图9-6 Ac-Ds转座元件结构示意图右边示Ac及Ds元件的单链DNA末端反向重复配对所形成的茎环结构，这种结构可能对转座有意义图9-7 玉米转座因子对胚乳颜色的影响 （2）酵母的Ty成分 指与非重复序列相间而散在分布的重复DNA序列 Ty成分长6.3Kb，长末端重复2个，增强子1个，开放阅读框2个，可以转录成1个mRNA，形成2种蛋白质。每个细胞中可有30-35个。 逆转录的DNA才开始转座，此现象叫做返座：指有RNA介导的转座作用。返座子：retroposons 被返座的遗传因子 （3）果蝇的转座子 P因子的发现：在黑腹果蝇中有P、M两个品系，当P雌P雄、 M雌M雄、P雌M雄、杂交时 F1代均为正 常，但是当P雄M雌杂交，F1代却为杂种劣育表现发育不全、分离比异常、减数分裂异常、染色体畸变、高突变率等。进一步研究发现此 雄性果蝇品系体细胞中有导致杂种劣育的因子P因子 F1劣育的原因：因为在 F1的生殖细胞中的 P因子能编码转座酶,使P因子转座,频繁转座使生殖腺细胞中的许多基因失活,DNA重排,下代生殖障碍劣育。为什麽M雄、M雌品系为正常呢？ 因为此二品系中不存在P因子为什麽P雄、P雌为正常呢？ 因为二者的细胞质内存在转座阻碍蛋白，使转座不能发生。 P P P M M M 正常 正常 正常 核中有P因子， 核中有P因子， 核中无P因子，质中有转座阻碍蛋白 质中有转座阻碍蛋白 质中无转座阻碍蛋白 P M F1劣育 核中有P因子，质中无转座阻碍蛋白导致频繁转座 此外，果蝇还有Copia 412 279 Tip FB 等因子。 4.3原核生物的转座因子 （1）插入序列 (Inserted sequence IS)插入序列本身没有任何表型效应，只带有与转座有关的转座酶基因，是一类较小的转座因子，可以从染色体的一个位置转到另一个位置，可以从质粒转到染色体上，在E.coli的染色体上和质粒上都有插入序列，通过这些同源序列的间的重组，F质粒插入染色体上形成Hfr菌株。 插入序列有IS1、 IS2、IS 3 IS 11 等十余种，长度在7685700bp之间，共同特征是都有一个转座酶基因，两端有两个反向重复序列，在细胞中的拷贝数不等。图9-8 插入序列大小在2086（Tn1681）205000（Tn4）之间，两端有顺向或反向重复序列，这些重复序列有些就是IS（复合型转座子），有些不是IS（称TnA族）。两端反向重复序列与转座功能密切相关。如Tn3:有两个反向重复序列，一个转座酶基因tnpA，一个氨卞青霉素抗性基因ampr，一个阻遏蛋白基因tnpR。 （2）转座子 (transposon Tn ) 是一类较大的、除了含有与转座有关的基因外，还含有抗要基因以及其它基因的转座因子。因此，又叫复合转座子。Tn有许多种类型，表示为：Tn1、Tn2、Tn3等。 （3）转座噬菌体 是能插入大肠杆菌DNA上的任何位置的一类温和噬菌体。又叫Mu噬菌体、增变噬菌体，（mutator phage).游离的mu噬菌体与插入的Mu噬菌体在结构上一样，两端无粘性末端，插入基因引起基因突变，整合方式与噬菌体不同，因此，化入转座因子。37000 bp的线形DNA分子（4）转座因子的遗传学效应 引起插入突变、插入位置上出现新的基因、造成插入位置上出现受体的少数核苷酸对的重复等。 5 反转座和反转座子 从DNA DNA的过程叫转座 从DNA RNA DNA的过程叫反转座、返座 在转座过程中来回转移的因子叫转座子或转座因子。在反转座程中来回转移的因子叫反转座子或返座子。 5.1病毒类反转座子 （1）反转录病毒 R：正向重复序列 gag：外壳蛋白基因 Pol：反转录酶基因， 整合酶基因 Env：表面蛋白基因 U5，U3：特有序列反转录病毒为单链RNA基因组，称为正链病毒。它的生活周期必须经过类似于转座的过程，使双链 DNA插入宿主基因组。 从RNA反转录成的单链DNA叫负链DNA，以此负链DN