基因工程载体.doc

第三章 基因工程载体 体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种主要类型的载体：1.质粒载体 2.噬菌体载体3.柯斯质粒（cosmid）载体基因工程对载体的要求 （1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。 （3）有一段多克隆位点。 外源DNA插入其中不影响载体的复制。 （4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。第一节 质粒(plasmid)载体 质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。(一)质粒的构形 环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型： 共价闭合环形DNA（cccDNA） 开环DNA（open circular,ocDNA） 线形DNA（linear,lDNA） （二）质粒的转移性 指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程的安全要求。非接合型质粒： 带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。符合基因工程的安全要求。R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。Col质粒：细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。 Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。 某些非接合型质粒（Col E1）在接合型质粒的存在和协助下也能DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定。（三）质粒的复制类型1.严紧型质粒（stringent plasmid）低拷贝数 ，有13份的拷贝；（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）2.松弛型质粒（relaxed plasmid）高拷贝数，10200份拷贝。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型） 松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的控制，因此，当用蛋白质合成抑制剂氯霉素（Cml）处理寄主细胞，使大肠杆菌染色体DNA复制受阻时，松弛型质粒DNA仍可继续扩增（氯霉素抗性质粒例外）。而严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格限制，其拷贝数不能通过用氯霉素来增加，对于有剂量限制的基因克隆需要使用低拷贝数的质粒载体。高拷贝数的质粒载体 Col E1、pMB1派生质粒, 而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数10003000个！ 适合大量增殖克隆基因或需要表达大量的基因产物。 低拷贝数的质粒载体 pSC101派生的载体, pLG338、pLG339、pHSG415等,不适合大量扩增DNA用。 但当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。 大多数的质粒载体都有一个来源于pMB1质粒的复制子，而且使用抗菌素抗性记号，主要有： 四环素抗性（Tetr） 氨苄青霉素抗性（Ampr） 链霉素抗性（Strr） 卡那霉素抗性（Kanr） 氯霉素抗性（Cmlr） 抗菌素抗性记号具有便于操作，易于选择等优点。（四）质粒的不亲和性： 实验观察表明，同一个大肠杆菌细胞中，在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒一般是不能够同时共存的，其中必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这种现象就是质粒的不亲和性。两种质粒彼此之间互不相容，这样的质粒属于同一个不亲和群，而彼此能够共存的质粒则属于不同的不亲和群。 质粒的不亲和性，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白，其浓度是与质粒的拷贝数成正比的。当同一细胞中两种不相容质粒的拷贝数不相等时，高拷贝数的质粒对复制抑制剂的敏感性较低拷贝数的质粒要差一些，于是在抑制剂浓度达到可抑制低拷贝质粒复制的水平时，高拷贝的质粒仍可继续复制，从而最终使低拷贝质粒从混合细胞中消失。 因此，如果同一个细胞中含有两种相容的质粒，由于它们的复制机理不同，每种质粒所产生的阻遏蛋白质都不会影响另一种质粒的复制，两种质粒都保持着自己正常的拷贝数，而与另一种质粒毫不相关。相反，如果同一个细胞含有的是两种不相容的质粒，它们的复制机理相同，各自产生的阻遏蛋白质不仅调节自身的复制，而且也会调节另一种与之共存的不相容质粒的复制。 这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数比其单独感染状态下的正常拷贝数减少许多。其原因是在这种情况下，每一种质粒的复制速率和拷贝数控制，都是由一对不相容质粒产生的阻遏蛋白质总浓度联合调控的。天然质粒载体：1.pSC101:第一个成功地用于克隆实验的大肠杆菌质粒载体(克隆非洲爪蟾)。 严紧型质粒, 12个拷贝 不能用氯霉素扩增2.ColE1：松弛型质粒，大小6.3kb，可用氯霉素扩增，其拷贝数可达10003000。二、理想质粒载体的条件 具有复制起点 这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，可使繁殖后的细胞维持一定的质粒拷贝数。一般情况下，一个质粒只含有一个复制起点，构成一个独立的复制子。 带有两种抗菌素抗性基因 且抗性基因内有若干单一的酶切位点，那么当该位点插入外源DNA时，就会导致此抗性基因失活，从而便于筛选重组体。 具有若干限制酶单一识别位点 这样既可以有选择地供带有不同末端的外源DNA定点插入，又可方便地将外源DNA片段回收。载体上的多克隆位点（MCS）即具有该功能。 却失mob基因 这样质粒就不会从一个细胞转移到另一个细胞，即能转化但不扩散。 较小的分子量和较高的拷贝数 小分子量的质粒易于操作，更能抵抗机械剪切力的切割，可容纳外源DNA片段也更长（不超过15kb），且可有效地转化给受体细胞；小分子量的质粒往往属于松弛型质粒，在细胞中拷贝数较高，扩增后回收率高。最后，低分子量的质粒载体，相应地对限制酶具有多重识别位点的机率降低。三、质粒载体的构建 对天然质粒加以人工改造的内容：u删除一些非必要区段及对宿主有不良影响的区段，削减载体分子量，使载体具有更大的容纳外源片段的能力；v加上易于选择或检测的标记；w限制性内切酶酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体中的特定位置；x加上一些调控元件，有利于克隆基因的表达；y安全性改造，限定载体的宿主范围。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括三种共同的组成部分，即复制基因、选择性记号和克隆位点。 四、常用的质粒载体类型（一）克隆质粒载体 1.pBR322：F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工构建（BR，not bacterial resistence）1.元件来源 复制起点 ori pMB1系列（来源于Col E1）的高拷贝型复制起点 Ampr基因 pSP2124质粒的Ampr基因 Tetr基因 pSC101的Tetr基因。 pBR322质粒的优点： 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞在Amp或Tet中都死亡。 获得载体的寄主细胞在Amp或Tet其中之一中死亡。 分子小，克隆能力大 载体越小越好。10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。 高拷贝数 氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy 安全 失去了转移蛋白基因mob （mobilization），不能通过接合转移。2.pUC系列 选择标记 Ampicillin 抗性和 lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。 蓝白斑选择原理： Xgal （5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside lacZ的肽互补 受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽）， 不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 。 pUC质粒载体上的lacZ 编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体，分解Xgal，产生蓝色物质。 受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a 互补的插入失活 pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补 IPTG的诱导作用 IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZ肽都表达。从而互补。 但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生肽！ pUC系列载体的优点：（1）更小的分子量和更高的拷贝数。如pUC8为2750bp，pUC18为2686bp，不经过氯霉素扩增，拷贝数即可达500 700拷贝。（2）选择方便。Xgal显色、抗菌素双重直接选择。（3）具有多克隆位点MCS区段。可以使两种不同粘性末端的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUC质粒载体上。克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。(二)表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。（三）穿梭质粒载体（shuttle plasmid vectors）：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 由于真核细胞基因的表达调控要比原核细胞基因复杂得多，所以用于真核细胞的克隆和表达载体大多是穿梭载体。穿梭载体的优点 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。 第二节 噬菌体载体一、噬菌体的生物学特性 噬菌体是一类细菌病毒（Bacteriophage）。噬菌体的DNA 分子中除了复制起点外，还有编码外壳蛋白质的基因。噬菌体大多数由二十面体头部和中空的尾部组成，在头部的蛋白质外壳中含有DNA。最常见的是双链线性DNA，此外还有双链环形DNA、单链环形DNA和单链线性DNA等多种形式。 噬菌体的感染效率极高，只要有一个噬菌体颗粒感染了一个细菌细胞之后，便可迅速地形成数百个子代噬菌体颗粒，如此重复四次感染周期，一个噬菌体颗粒便能够使数十亿个的细菌细胞致死。 噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期两种类型。只具有溶菌生长周期的噬菌体叫烈性噬菌体(virulent phage)。只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体叫温和噬菌体(temperate phage)。具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫做溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA叫做原噬菌体(prophage)。 作为细菌寄生物的噬菌体，它可以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生命，但一旦脱离了寄主细胞就既不能生长也不能复制。尽管大多数的噬菌体都具有编码多种蛋白质的基因，可实际上所有已知的噬菌体都是在寄主细胞内，利用寄主细胞的核糖体，合成蛋白质的因子、各种氨基酸及产能体系，进行生长和生殖的。这种对于寄主细胞的依赖性，是噬菌体最具特色的一种生物学特性。 噬菌体的DNA既可以以线性存在，又可以环状形式存在。因为在噬菌体线性DNA分子的两端各有一个12bp组成的天然黏性末端，当 DNA被注入寄主细胞后，便会迅速地通过黏性末端的互补作用形成双链环形。成环后的黏性末端部位叫做cos位点。噬菌体还有以下一些优点：（1）人们对其生物学特性及遗传学背景都有深刻的研究，因而在设计噬菌体载体时，有把握判断基因组中可删除的区段和可利用的特点；（2）噬菌体较质粒载体的寄主范围要窄得多，因此作为基因克隆载体自然也就更加安全；（3）DNA的两个5，端具有12bp完全互补的粘性末端，可用来构建柯斯质粒（cosmid），这对构建真核基因组片段的基因文库是特别有用的载体。 野生型的噬菌体DNA，分子量大，对常用的核酸内切限制酶具有过多的酶切位点（如5个EcoR限制位点，7个Hind限制位点），没有选择标记，而且具有感染性，显然它本不适于用作基因克隆的载体，因此有必要将噬菌体的非必要（J基因到N基因）区段和多余的酶切位点进行删除，以便改造成适用的克隆载体。 野生型的噬菌体DNA，分子量大，对常用的核酸内切限制酶具有过多的酶切位点（如5个EcoR限制位点，7个Hind限制位点），没有选择标记，而且具有感染性，显然它本不适于用作基因克隆的载体，因此有必要将噬菌体的非必要（J基因到N基因）区段和多余的酶切位点进行删除，以便改造成适用的克隆载体。噬菌体的改造： 删除约占总DNA长度1/3的非必要区段，减小分子量；通过体内突变，消减酶切位点数，在非必要区保留某些限制酶1-2个切口，以便外源DNA片段的插入或取代；添加选择标记基因；通过某些基因的无义突变将它改造成安全载体，以利于生物学防护。 三、常用的噬菌体载体（1）插入型载体（insertion vectors）：可插入长度10kb的外源DNA。当外源DNA插入到载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即插入失活效应。根据插入失活效应的特异性，插入型的载体又分免疫功能失活和大肠杆菌-半乳糖苷酶失活两种亚型。 （a）免疫功能失活型： 插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。选择标记： 插入导致载体不能合成阻遏物， 载体不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。 无外源DNA插入的载体感染受体菌形成浑浊的噬菌斑。（2） 置换型载体（substitution voctors）：两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于DNA的非必要区两侧。可插入长度约为20kb的外源DNA。在可取代的区段中带有lacZ基因的相应序列时，重组体亦可用-半乳糖苷酶失活法进行筛选。Spi正选择取代型载体：改良的噬菌体载体还有一个特点，在它们其中心限制片段上具有噬菌体的red和gam两个基因。野生型的噬菌体，不能够在P2噬菌体溶源性细菌中生长，其表型为Spi+。如果噬菌体丧失了red和gam基因，噬菌体突变体则获得了Spi的表型，能够在噬菌体P2溶源性的大肠杆菌细胞中生长并形成噬菌斑。在应用具有red和gam基因的置换型载体作基因克隆时，可以按照Spi特性来选择重组体，Spi表型为我们提供了一种正选择标记。噬菌体作为载体的优点：1. 基因组中有1/3的非必要区，可以被置换，改造后的载体克隆片段可达20kb，而质粒载体仅有几个kb。2. 用噬菌体DNA作为载体，即使不进行体外包装，转染的频率也比质粒转化的效率高，包装后效率更高。3. 可通过溶源化反应整合到寄主染色体上，当不需要外源基因大量表达时，可让它以溶源性存在，若要表达，可通过诱导进入裂解途径，释放出大量的噬菌体，得到的重组DNA的拷贝数就更多。噬菌体作为载体的不足：1.需要包装，其操作比较麻烦，包装率又不稳定，购买包装蛋白的费用高；2.没有质粒的用途广泛。（1）大小 46kb（2）组成 DNA： cos序列和控制包装的 的序列。 pBR322:质粒的复制子 抗药性基因 几个限制性酶的单一位点（3）cosmid vector的特点具有噬菌体的特性： 在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌）。 克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。具有质粒载体的特性： 大多带有pMB1或Col E1的复制子，能象质粒一样复制。方便的选择： 有抗菌素抗性基因和插入失活的克隆位点。高容量的克隆能力： 45kb （最少不能低于30kb）。 51kb-5kb=45kb 包装限制作用（4）cosmid克隆的一般过程 用特定的核酸内切酶消化真核生物DNA。 用同样的内切酶消化cosmid载体。 连接 产物中将有一定比例的分子是两端各有一个cos位点、长 度40kb左右的真核DNA与载体的连接物。 Ter体系识别并切割 切割合适长度的杂种DNA连接物，并包装入噬菌体头部。 感染大肠杆菌 注入到细菌体内的杂种DNA分子环化，并按质粒的方式 复制。“多联体”复制： 噬菌体的生命周期中，会产生数百个DNA通过cos位点连接的“多联体”分子。Ter体系： 在包装的时候， 噬菌体具有位点特异的末端酶（terminase）体系（Ter体系），识别cos位点，把多联体切成单个DNA长度。 两个cos位点之间，必须保持3845kb的DNA，Ter体系才能识别。（5）cosmid载体克隆的缺点cosmid分子之间的自我连接。外源DNA片段之间的连接并插入载体。 为解决这一问题，可采用pJB8的一种特殊克隆方案。该载体在BamH识别位点的两侧各有一个EcoR识别位点，若在BamH位点克隆了外源DNA片段，可通过EcoR的切割作用，将外源片段重新删除下来。（6）cosmid载体的改良 Ish-Horowice-Burke改良方案pJB8 cosmid载体1