运用大鼠做实验的临床实验研究优秀论文 (28).doc

基于胶体金检测方法的蛋白芯片体系的建立作者：杨刚刚 王华 李小欣 陶东 王志平 作者单位：730030 甘肃兰州，兰州大学第二医院泌尿外科 （杨刚刚、王华），检验科（李小欣）；710077陕西西安， 西安联尔科技有限公司（陶东） 【摘要】 目的 构建一个检测尿液中HCG抗原的蛋白质芯片初级模型；方法 在硝酸纤维素膜上包被HCG单克隆抗体（抗-HCG），加尿样后，标本中HCG抗原(标准品)与硝酸纤维素膜的抗体特异结合，再加入胶体金标记的单克隆抗体（抗-HCG）,使其特异结合，完成对标本中抗原的染色。最后应用芯片扫描仪对光学信号的灰度值进行分析，从而绘制出标本中不同浓度的HCG对光学信号灰度值的标准曲线；结果 与现有方法相比，该方法将检测的最低浓度降至25 mIU/ml，具有良好的梯度、线性关系和重复性。结论 该方法是一种快速、简便、有较强操作性的检测HCG的方法。 【关键词】 免疫金染色；HCG；蛋白质芯片；双抗体夹心法； 光学信号灰度值Foundation of a Protein Chip System Based on Colloidal Gold Detection Yang Ganggang1, Wang Hua2, Li Xiaoxin3,et al. 1Department of Urology, the Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou, Gansu 730030 2Department of Ecsomatics, the Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou, Gansu 7300303Xian Lianer Technology Co., LTD, Xian, Shanxi 710077 【Abstract】Objective To design a platform of primary protein microarray model to detect the quantity of HCG in urine.Methods Double-antibody Sandwich was applied as the theory.The polyclonal antibody to HCG (Anti-HCG) was spotted onto the nitrocellulose. After the sample urine was added, the antigen and HCG in the urine were combined uniquely with the Anti-HCG on nitrocellulose. Then, another polyclonal antibody to HCG (Anti-HCG) labeled with colloidal gold was added and combined uniquely with the HCG. The process of the staining of the HCG in sample urine was finished. Finally, we used chip reader to analyze the intension of the staining (Immune Complex IC) spots, and protracted the standard curve of concentration of the HCG in urine sample to the intension of the staining IC spots.Results Better than other ways, this method could improve the detectable limit concentration from 50mIU/ml to 25mIU/ml, with nice gradient and linear relationship, and it could be repeated smoothly.Conclusion This method is simple, rapid and suitable for detection of HCG in urine sample. 【Key words】immun-gold staining; HCG; protein chip; double-antibody sandwich; intension of the staining IC spots Faulk和Taylor等1首次（1971年）将“胶体金标记”引入免疫化学创立了免疫金染色法(Immuno-Gold Staining IGS)。该标记物为纳米级金颗粒，具有良好的生物兼容性；金颗粒表面带有负电荷，因其静电的排斥力，故在水中能保持稳定，形成稳定的胶体2。该技术现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等3。免疫金染色法具有与酶联免疫吸附试验(ELISA) 相似的特异性和灵敏性,且快速简便,操作性强，检测结果可靠4。在当今的生物标记分析领域中，生命科学技术与与纳米技术的相互渗透与融合已发展为重要的前沿研究领域之一5。蛋白芯片将具有高度亲力和特异性的分子探针（例如单克隆抗体）点样在固相载体上，用于识别复杂样品（如血液、尿液等）中的目标多肽，再以胶体金标记的单克隆抗体（或者二抗）与样品中目标多抗特异结合后，用激光共聚焦扫描或CCD对信号的强度进行检测，从而判断样品中靶分子的数量。与传统的凝胶电泳、Westerblot及ELISA等相比, 蛋白芯片更为快捷、高效、并行、高通量69。与其他已问世的、抗原检测抗体的蛋白芯片不同的是，本研究所涉及的蛋白芯片是通过抗体检测抗原，更为直接、客观和特异性高。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 实验试剂 HCG单克隆抗体（CD280,购于杭州隆基生物科技有限公司）,HCG抗原(国家标准品的HCG，购于中国生物制品检定所)，稀释用尿样(健康男性尿液)，氯化钠（西安化学试剂厂），磷酸二氢钠（天津红岩化学试剂厂），磷酸氢钠（天津红岩化学试剂厂），吐温（TWeen20,西安化玻站试剂厂）,氯金酸(上海试剂一厂),氯甲硅烷 (西安化学试剂厂),氯仿(西安化学试剂厂),小牛血清白蛋白(AMRESCO.Ohio.USA),氢氧化钠(西安化学试剂厂),盐酸(西安化学试剂厂),去离子水(西安联尔科技有限公司)。 1.1.2 实验材料 硝酸纤维素膜（Whatman Schleicher&Schuell公司Protran硝酸纤维素膜），芯片阅读仪（BA-85 孔径0.45 m，西安联尔科技有限公司），单点盒（西安联尔科技有限公司），垫料（普通用卫生纸）。 1.2 反应体系的建立 1.2.1 磷酸缓冲液 TWeen-20(PBST):NaCl 9 g +Na2HPO412H2O 2.9 g+NaH2PO42H2O 0.2964 g+ 10% TWeen20 2 ml+去离子水998 ml，平衡至室温再应用；胶体金标记的HCG单克隆抗体（-HCG）10（由西安联尔科技有限公司制作提供），4 避光保存，配制好后至少平衡2 d再应用，用时稀释成1:3的稀释液；0.05 M pH7.4 0.2%BSATBST封闭液：Tris 2.42 g+NaCl 3.5 g+10%TWeen20 0.6 ml+0.8 gBSA+去离子水至300 ml，调整pH 7.4后，加去离子水至400 ml。 1.2.2 不同稀释浓度的标准品配置 将HCG标准品分别用阴性尿液稀释为300 mIU/ml、200 mIU/ml、100 mIU/ml、50 mIU/ml、25 mIU/ml、0 mIU/ml。 1.1.3 包被体系 将HCG以1%BSA稀释好，室温平衡30 min后，用微阵列打点机点样于硝酸纤维素膜上。质控点:羊抗鼠抗体以1%BSA 按体积比110稀释；HCG单克隆抗体（-HCG）:以1%BSA按体积比12稀释。 之后，待包被于硝酸纤维素膜上的样品干燥完全，24 h后，再用0.05M pH7.4 0.2%BSA-TBST 室温（约20 ）下封闭50 min,并制成斑点免疫滤渗试验单点盒。 2 方法 2.1 双抗体夹心法原理 在硝酸纤维素膜上包被用1%BSA稀释后的单克隆抗体（抗-HCG），加尿样后，标本中不同浓度的HCG抗原(标准品)与硝酸纤维素膜的抗体特异结合，再与加入胶体金标记的单克隆抗体（抗-HCG）特异结合，完成对标本中抗原-抗体复合物染色。最后应用芯片扫描仪对光学信号的灰度值进行分析，从而绘制出标本中不同浓度的HCG对光学信号灰度值的标准曲线。 2.2 具体操作步骤 加2滴PBST洗涤液，待完全渗入；加150 l待检尿样，待完全渗入；加1滴PBST洗涤液，待完全渗入；加5滴胶体金标记的抗-HCG单克隆抗体，渗完后90 s；加1滴PBST洗涤液，待完全渗入；芯片阅读仪扫描反应后的芯片，记录灰度值。 3 结果 HCG单克隆抗体（-HCG）：1%BSA=12的稀释比例的灰度值梯度差较好，且有较好的信噪比。此结果的相关性R2为0.9742，即抗原浓度与其灰度值之间有较好的线性关系。如表1及图1(见封4)、2、3所示。 表1 不同尿样浓度的灰度值比较（点样及胶体金稀释后15 d） 3 讨论 HCG由、两个亚基构成，亚基为其他垂体类激素所共有，只有亚基为HCG所特有。所以，本试验将HCG所特有的亚基的单克隆抗体包被于硝酸纤维素膜上。这样，它就可以特异性地与尿样中的HCG结合，而尿样中的其他抗原则被洗涤液冲洗掉。之后，再滴加胶体金标记的-HCG的单克隆抗体，从而完成胶体金对HCG的染色，再根据显色的灰度值判断HCG的定量检测。 目前较为常见的HCG检测方法为试纸条检测法，而胶体金标记法多用于免疫组化检测。所以，我们对此以硝酸纤维素膜作为固相载体，在此载体上点样单克隆抗体，利用抗原抗体特异性结合的原理，根据双抗体夹心法，对样品中抗原的浓度进行定量检测，由此构建一种全新检测抗原的技术。与传统的检测方法（如ELISA）相比，这一检测操作在时间及步骤上简化了很多，仅数分钟就能完成待检抗体的数量测定，而且仅需数步简单操作，不需要特殊大型仪器，为基层医疗机构开展疾病的筛查奠定了良好的基础。 与其他常见试剂盒不同的是，该技术为双抗体检测法定量检测样品中抗原的方法。我们对硝酸纤维素膜、洗涤液、点样抗体的包被条件、点样膜的封闭条件及实验具体操作步骤的最佳时机均予以了探索，最终得出以下结论：选用硝酸纤维素膜的孔径为0.45 M的Whatman Schleicher & Schuell 公司protran BA-85膜；洗涤液为PBST 0.02%；最佳包被条件为-HCG单克隆抗体1%BSA =12；封闭液为0.05M pH7.4 0.2%BSA-TBST封闭液；实验操作步骤要注意的是在胶体金渗完约2min再加滴洗涤液。该检测法最低的检测下限可达25 mIU/ml，明显优于文献报道的50 mIU/ml11。该方法是一种快速、简便、有较强操作性的检测HCG的方法,且结果可靠、直接。 经过多次反复实验,排除了多方面的干扰因素12,使整个技术及操作过程更简单、更优化、更完善,为该项技术在临床领域的应用奠定了基础；同时通过本研究,最后形成了一套抗体检测抗原、简易、快速、灵敏、可靠的早早孕诊断试剂盒；也为其他抗体检测抗原试剂盒提供了宝贵的经验，促进了直接检测抗原的蛋白芯片的问世。晋升网（）致力于成为医务工作者晋升职称心灵导师；是目前国内收录医学期刊、医学杂志最多最权威的医学学术平台；提供免费医学期刊在线阅读；网罗和甄选海量优秀医学论文检索，独立研发医学在线资源分享库和医学在线模拟考试库；整合刊类、标题、关键词检索及全文检索，并独家研发刊社管理和刊社加盟系统、在线投稿、在线查稿、在线阅读、远程审稿、在线下载等系统；聚刊社力量，建服务平台，让晋升网通过“专业”走入每一个医务人员的身边是我们不懈的追求目标。【参考文献】 1 Faulk W P,Taylor G M.An immSunocolloid method for the electron microscopeJ.Immunochemistry，1971,8(11):10811083.2 Slot J W.Sizing of protein A-colloidal gold probes for immunoelectron microscopeJ.J Cell Biol,1981,8(90):533536.3 顾大勇，鲁卫平，周元国.纳米级金颗粒在基因芯片检测技术中的研究进展J.国外医学(生物医学工程分册),2005,28(2):7580.4 曹锡坤,陶义训,韩松,等. 滴金免疫测定在检测血清甲胎蛋白中的应用J . 上海免疫学杂志,1991,11(3):154.5 Lin Z B, Su X G,Zhang J H ,et al.Application of Nanoparticles in Biochemical AnalysisJ.Chinese Journal of Analytical Chemistry,2002,30(2):237241.6 Mezzasoma L, Hamilton T B, Cristina M D ,et al.Antigen microarrays for serodiagnosis of