甜瓜病害鉴定：甜瓜根腐病.doc

甜瓜病害鉴定：甜瓜根腐病 Melon Fusarium root rot（注：原内容本来自，在其管理员的要求下，已删除） 洋香瓜黑点根腐病菌的生态与防治蔡竹固 童伯开 陈瑞祥国立嘉义技术学院植物保护系前言引起洋香瓜黑点根腐病(Monosprascus root rot/vine decline)的病原是一种子囊菌，学名为Monosporascus cannonballus Pollack & Uecker。在1970年，Troutman和Matejka从美国亚利桑那州的洋香瓜病株分离到一种未鉴定真菌，能够造成侧根的腐败，病根散生许多黑色圆形小点。到了1974年，Pollack和Uecker报告从亚利桑那州Troutman和Matejka所提供分离自洋香瓜的病原菌被鉴定为M. cannonballus，且报告这是一个子囊菌新种，此后文献乃采用本学名。在美国、利比亚、以色列、日本、韩国、西班牙等国家，都已报导发生本病害，本病已是全球瓜类产区之新兴重要病害。1994年, 蔡及童报告本病在台湾的洋香瓜田发生，且鉴定病原为M. cannonballus。1994-1995年，在台湾南部瓜田调查萎凋病发生情形, 盐埔、鹿草、佳里、东山及澎湖等洋香瓜产区，都可采集到黑点根腐病株。观察其根系呈水浸状褐变枯死，细根脱落，在枯死的根上散生着许多小黑点(病原菌的子囊壳)。发病率在27.5-58%之间，0-66%的病根上，可观察到形成子囊壳。在台湾，其它零星发生而能够造成萎凋病征的病原有蔓割病(Fusarium oxysporum f. sp. melonis)、炭腐病(Macrophomina phaseolina)、黑腐病(Lasiodiplodia theobromae)、细菌性软腐病(Erwinia carotovora subsp. carotovora)、蔓枯病(Didymella bryoniae)。一些病毒种类也能够造成洋香瓜的萎凋问题。根据美国植物病理学会最近出版的瓜类作物病害概要一书，土壤传播性病原真菌引起的瓜类病害即多达 9种。可见洋香瓜之萎凋或败藤，是一种多病因的病害。国内学者专家在行政院农委会的经费补助下，已就此问题做一系列的研究工作，希望能够找出有效的解决方法。本文仅就洋香瓜黑点根腐病菌的生态与防治简要叙述，供瓜类作物产业之参考。病征及田间诊断本病的地上部病征, 在果实肥大期从下位叶开始黄化，中午时呈现萎凋。收获前或收获期间，病势进展加剧，严重者表现立枯，或急性萎凋(图一)。在瓜园内的病株分布是连续的，为块状发生。以高浓度接种源进行人工接种，本菌也会为害瓜类幼苗阶段，但在田间尚未发现幼苗发病的情形。洋香瓜黑点根腐病病株所表现的病征，在根部主要包括主根和侧根的褐化和坏疽、维管束褐化，坏疽斑散生(图二)，常出现于根分支处(junctions)或幼根尖端，将植株自土壤中拔起时，罹病根系大都脱落；在枯死的根上散生着许多小黑点之子囊壳(图三)；但地上部的维管束只于近地面几公分内出现褐化和皮层上散生褐至红色病斑。地上部表现藤枯(vine decline)病征，主要乃植株逐渐黄化，基部老叶焦枯、而当植株接近成熟时，会在新叶出现焦枯。在洋香瓜开始黄化，基部老叶焦枯，中午时呈现萎凋，病势进展加剧而表现急性萎凋时，将植株自土壤中拔起时，罹病根系往往只出现坏疽斑散生情形，尚未产生小黑点之子囊壳。可将病根用塑料待装着保湿，促进形成子囊壳，有助于病害之正确诊断。本病与其它洋香瓜败藤病害(vine decline diseases)的区别乃在于病根上存在有黑色子囊壳，且在地上部的维管束不出现褐色，病蔓上没有病斑(lesions)。其子囊壳埋生于病根，所以不大会和M. phaseolina的小而不规则形菌核或其它病害种类混肴。病原菌的分离方法维管束褐变的病根，以0.5%次氯酸钠浸渍1-2分钟，无菌水漂洗后，放在灭菌的滤纸上吸干，再切取细片放在W.A.(Water agar)平板，放在25，待菌丝长出时，切取菌丝尖端，移入PDA斜面。并且可在病原菌分离培养基中多加1g( a.i.)ml的免赖得(benomyl)。土栖性真菌如镰孢属(Fusarium)、疫霉属(Phytophthora)、腐霉属(Pythium)、丝核菌属(Rhizoctonia)等菌类在分离过程中常会出现。将黑点根腐病株之根系做真菌分离时, 黑点根腐病菌的分离率为9.5-85.5%。同时可分离到Fusarium oxysporum、Fusarium solani、Rizoctonia solani、Phytophthora sp.、Pythium sp.、Alternaria sp.等菌类(图四)。而Lovic等人(1993)报告在Monosporasus的ITS序列，可用来发展成为属专一性探针(genus-specific probes)。病 原 菌本菌在病根组织上形成的子囊壳大小300-400m(图五)，子囊初呈棍棒状，后呈卵形，60-80 X 40-50m，子囊内有 1个子囊孢子(图六)，子囊孢子球形，未成熟时无色或褐色，成熟时呈黑色，直径30-50m，而本菌不产生无性孢子。在本省分离之MC-E3菌株， 每个子囊壳内，含有11-61个子囊孢子。在PDA平板上，菌落的气生菌丝少。初呈白色，后转灰色、暗灰色，一个月后可形成黑色子囊壳，每平方公分培养基上，可形成19-25个子囊壳，在20-35都有子囊壳形成。从本省分离的五株菌株在PDA平板上经过三天培养之后，都显示30最适合菌丝生长，25和35次之。Martyn等人指出本菌子囊孢子含有一有色的外壁孢子周壁(epispore)及一厚而透明的内壁，后者约占直径的15-20，其比重为1.23-1.28。本省五株菌株的子囊孢子之发芽率均在0.3%之下(图七)；此与Martyn et al.将6月龄子囊孢子经45处理10分钟，但其发芽率仍少于0.05的结果相同。关于子囊孢子发芽的机制，有待深入研究。寄 主 范 围本菌是一种蚀根菌(root-pruning fungi)，能够感染洋香瓜、香瓜外，也感染西瓜、冬瓜、胡瓜。植松及赤山(1987)在79月种植44种甜瓜品种、8种非瓜类作物的19品种，测定对黑点根腐病菌的感受性，结果甜瓜品种都根部褐变，形成子囊壳，80品种萎凋。西瓜、瓠、冬瓜、胡瓜都是根部褐化而萎凋。苦瓜、南瓜则一部分品种会出现根部褐化及形成子囊壳，所以本菌可以广泛感染葫芦科作物。本病原除为害瓜类之外，对辣椒、甜椒、茄子、西红柿等作物的幼苗亦有病原性，可抑制茎、根生长，且降低出土率(2)。此外，亦可感染菜豆、玉米、高梁和甜菜，且有33-70的分离率。Monosporascus spp.也被发现或分离自非瓜类作物，包括土牛膝(Achyranthes aspera L.)、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)、红三叶草(Trifolium pratense L.)、小麦(Triticum sp.)和胡麻(Sesamum indicum L.)。接 种 方 法1.接种源的制作：直径9 cm培养皿内PDA培养25日菌落, 已形成了子囊壳，连同培养基将菌落细细切碎。或将病原菌培养在砂/燕麦麸培养基(sand/oat hull medium), 这培养基含有3L砂、275g干燕麦麸和450ml蒸馏水。将其充分混合后装入灭菌袋中，连续灭菌 3次。每袋中接种10ml的本菌菌丝悬浮液, 此悬浮液乃以在PDA培养510天的菌丝体加入75ml无菌水研磨。经过在30培养3540天之后，定量其中的子囊孢子和营养菌丝体cfu(colony-forming unit)数量。在本省，以砂/米糠培养基(sand/rice bran medium)或稻壳/米糠培养基(rice chaff/rice bran medium)培养本菌，也很适合。2.温室试验: 采3-L黑色塑料盆，蒸气灭菌(steam-pasteurized)砂和介质perlite(4:1, V/V)事先混合，每盆加入25或50cc的接种源，在盆顶下5-6cm加入接种源，然后再填入4-5 cm的介质。对照组和接种组的差别在，加入等量的灭菌燕麦麸。试验植株每盆加入250 ml的营养液，营养液配方为Peters 20:20:20 2gL，MgSO47H2O 0.25gL和Micronutrients (Stem) 0.01gL 。虫害的防治，每5-7天喷药一次。8-9周之后洗去盆土，调查根系的主根和侧根的罹病度区分为0(健康)-4(严重病斑或坏疽)间共有 9个等级。接种和对照组的根系，以10-20倍解剖显微镜调查子囊壳数目，调查每株主蔓长度和根系及顶部(tops)的干重量。3.微区试验: 微区(0.61.00.6m)事先熏蒸处理。每区接种源的加入，先移去3-5cm表土，撒入300g接种源(=280g 干重)和240c.c.的Osmocote 14:14:14缓效性肥料，充分混合后，再放回表土。每区播入5-10种子，10-20天后，留下 3株。表面滴灌，按需要喷洒农药。9周后调查藤枯程度(无、轻微、中度和严重)。病 害 环尚未有针对本菌的选择性培养基。所以对于本病害的管理，有待发展出侦测和定量土壤中接种源的方法。以蔗糖梯度离心分离土壤线虫的方法，可以用诸于本菌子囊孢子的定量。在实验室内，每一土壤样品先经过4-mm筛子，取20g 土壤混合200 ml的自来水，以磁石旋转搅拌8-10min，再以75和38m的冶金用筛(metallurgical sieves)过滤，滤在38m筛子的物质将之洗入50ml离心管，且以2,000g离心4 min。上层液慢慢倒出，将沈降物再悬浮于50蔗糖溶液，在2,000g下离心2min。将悬浮或漂浮的子囊孢子或其它物质倒入一小筛子(直径8cm，38m)，且洗入一干净的离心管。将沈降物再第二次蔗糖萃取去收回第一次萃取时漏失的子囊孢子。第二次萃取得到的悬浮液倒入第一次萃取液中，且存放于 5。以一长方形塑料皿，在解剖显微镜25-30倍，侧光及底光下计量。笔者将田间洋香瓜黑点根腐病株之根系放置阳台上，定期采样做真菌分离时，1.5个月后，无法再分离到黑点根腐病菌。将人工培养病土放置阳台上，定期采土样种植洋香瓜香兰品种之幼苗，再从其根系做真菌分离时，10个月后，无法再分离到黑点根腐病菌。Mertely等人以蔗糖梯度离心分离法定量土壤中接种源，发现M. cannonballus的子囊孢子主要存在于畦内，土壤深度1020cm处；子囊孢子在连作、塑料布畦面覆盖、点滴灌溉的瓜田之数量，较轮作、未覆盖、沟灌的瓜田为少。Stanghellini等人指出M. cannonballus的子囊孢子均匀地分布于洋香瓜田区，平均每公克土壤中含有6个以内之子囊孢子数。甚至于未曾种过瓜类的田区，也含有该菌子囊孢子，因此，子囊孢子被认为是黑点根腐病的初次接种源。发 病 生 态Reuveni等人(1983)以温度处理试验植株, 以30/20的发病率较25/20为高。每天喷洒灌溉的发病指数较诸每3 天喷洒1 次者为低。可能由于水份降低土温或增加有效水分，不利于发病。夏作7-9月(27-37)较春作24月(2430)容易发病。如利比亚、以色列、美国亚利桑那州等炎热半干旱(semiarid)的环境较适合本病害的发生。近年来，本省洋香瓜采用隧道式塑料布室栽培，为充份利用设施，乃采取连作之周年栽培，可能因而造成本病害之严重发生。病 害 防 治Miller等人(1992)以土壤熏蒸剂布生Busan 1020(methan-sodium)、Telone (二氯丙烷1,3-dichloropropene77.9氯化苦Chloropicrin 16.5) 、TeloneC17(1,3-dichloropropene94)等处理之后可以增加瓜蔓长度、增加产量。Reuveni等人(1983)以溴化甲烷(Methyl bromide)的处理效果较诸布生(methan sodium)、二溴乙烷(EDB)、二溴乙烷(EDB)氯化苦(Chloropicin)、太阳能处理者防治效果为佳。笔者选取平克座(penconazole)、依灭列(imazalil)、待克利(difenoconazole)及三得芬(tridemorph)测试对于黑点根腐病菌菌丝生长之抑制效果，以平克座对菌丝生长的半抑制浓度较高(1.5g/ml以上)，而其它药剂对二菌株菌丝生长的半抑制浓度在0.75g/ml以下。MC-E3菌株对于克收欣、依普座及三得芬的感受性较MC-RC菌株为敏感。杀菌剂对盆栽洋香瓜黑点根腐病之防治试验结果显示，50克收欣水分散性粒剂1000倍稀释液对本病有良好防治效果，而12依普座水悬剂及24.9待克利乳剂1000倍稀释液灌注后，造成植株药害。在美国，Miller和Martyn(1996)报告采用杀菌剂ICIA 5504以滴灌施药(drip irrigation application)，能够减轻洋香瓜黑点根腐病之发病且提高产量，而滴灌施药的防治效果较叶面施药(foliar application)为佳。ICIA 5504和50克收欣水分散性粒剂都属于甲氧基丙烯酸(methoxyacrylate)系化合物，对本病有良好防治效果，且不会造成药害问题；可提供本省洋香瓜产业之田间用药之参考。西瓜、洋香瓜、胡瓜和瓠较为感病的，而矮南瓜、南瓜和butternut(C. moschata)较为耐病。不同洋香瓜品种和品系，对于本病的感病性有所差异，其中以PI12411 Tam Dew Improved、Cruiser、Durango、PI 12411、Laredo等较为耐病。而洋香瓜对于本病害的抗病或耐病育种仍在田间试验阶段。笔者将本省洋香瓜各品种幼苗出土率、茎长、根长、茎干重及根干重之抑制率合计后算其平均值，得知本省目前的洋香瓜经济栽培品种大都属于感病品种，因此育成能够对黑点根腐病有抗病性或耐病的品种，乃今后必需加紧努力的目标。对减轻本病损失的建议近年来，本病在台湾有相当高的发病率。在文献上记载了许多甜瓜藤枯或萎凋的病害, 彼此间容易误诊。正确地诊断田间所发生的病害，鉴定其病原, 到底何种病害较为重要？有正确的病害诊断，才能够有确实而有效的病害防治计划。您可以请教推广人员、植物病理学家、农药商驻区代表或农药贩卖业者。避免连作，采用耐病性品种及综合防治法之确立等，都有助于本病害的防治。建立一个良好的防治叶部病害(譬如白粉病、露菌病)和虫害(譬如蚜虫、叶潜蝇 )实施计划，以免植株衰弱，诱使萎凋及败藤病害容易发生。定期的灌溉，避免土壤过湿，尤其在接近果实成熟期时, 应做好土壤水份管理。如果灌溉后接着又下雨，往往会损害到植株和果实。因此, 雨季前后的病虫害防治, 一点也马虎不得。一旦发现土壤中病原菌密度很高时，不要再种植瓜类。35年的轮作可以减少损失，最好和水田轮作。因为本菌是一种嗜热菌(thermophilic fungi)，所以土壤以太阳能热处理的防治效果不佳。种植前，进行土壤熏蒸可以减低植株矮化及增加果实产量，但未见本省瓜农采用。甲氧基丙烯酸(methoxyacrylate)系化合物，对本病有良好防治效果，且不会造成药害问题。本省目前的洋香瓜经济栽培品种大都属于感病品种，因此育成能够对黑点根腐病有抗病性或耐病的品种，乃刻不容缓的工作。笔者在PDA平板上，探讨有机肥料(B3,高雄市优业企业公司)对于本菌菌丝生长的影响，发现其有抑制菌丝生长的现象(图八)。进行灌注B3之100倍稀释液对于洋香瓜黑点根腐病防治效果之田间试验，结果显示B3虽然无法减少植株萎凋及根系罹病指数达显著水平，但能显著增加根干重及蔓长。Lovic等人报告本菌的菌株按其接种在洋香瓜Magnum 45品种上的发病程度，可区分为毒性的(virulent)和低毒性的(hypovirulent)，前者为野生型且不带有dsRNA，后者则带有dsRNA。经由基因组DNA(genomic DNA)比较，弱毒性菌株较强毒性菌株多带有14个低分子量dsRNA。在本省之弱毒性菌株是否有此dsRNA，有待研究。该dsRNA的大小在1.7至15 kb之间，且具有发展为生物防治剂(biocontrol agents)之潜力。狭义的生物防治法(biological con