基因工程的载体(一).ppt

第五讲基因工程的载体 vectorsforgeneengineering inmolecularbiology avectorisadnamoleculeusedasavehicletotransferforeigngeneticmaterialintoanothercell 载体 vector 是可以携带外源核酸进入宿主细胞 并能进行独立和稳定自我复制或表达的核酸分子 commontoallengineeredvectorsareanoriginofreplication amulticloningsite andaselectablemarker thevectoritselfisgenerallyadnasequencethatconsistsofaninsert transgene andalargersequencethatservesasthe backbone ofthevector thepurposeofavectorwhichtransfersgeneticinformationtoanothercellistypicallytoisolate multiply orexpresstheinsertinthetargetcell vectorscalledexpressionvectors expressionconstructs specificallyarefortheexpressionofthetransgeneinthetargetcell andgenerallyhaveapromotersequencethatdrivesexpressionofthetransgene simplervectorsareonlycapableofbeingreplicatedbutnottranslated theycanbereplicatedinatargetcellbutnotexpressed unlikeexpressionvectors simplervectorsareusedtoamplifytheirinsert 1 分子较小 可携带比较大的 片段 2 能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制 3 尽可能有多种限制酶切位点 但每一种限制酶又要有最少的切割位点 4 有适合的标记 易于筛选 5 从安全角度考虑 要求载体不能随便转移 仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制 6 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达 并且尽可能是高效的表达 作为基因工程的载体 一般应具备以下性能 thefourmajortypesofvectorsareplasmids bacteriophagesandotherviruses cosmids 粘粒 andartificialchromosomes 原核生物的克隆载体真核生物的克隆载体酵母及其他真菌的克隆载体高等植物的克隆载体昆虫的克隆载体哺乳动物的克隆载体 质粒 plasmid 噬菌体 bacteriophage 染色体 一 原核生物的克隆载体 1质粒 plasmid 1 1质粒的基本性质 basicfeatures 质粒是细胞中染色体外的一种能自我复制的环状双链dna分子 acircular double strandedunitofdnathatreplicateswithinacellindependentlyofthechromosomaldna plasmidsaremostoftenfoundinbacteriaandareusedinrecombinantdnaresearchtotransfergenesbetweencells 质粒不能利用染色体上的复制起点 因此 所有的质粒都至少含有一段可作为复制起点 originofreplication 的dna序列 也就是说质粒能够在细胞内独立于宿主细胞本身的复制周期而实现扩增 小一些的质粒可以利用宿主细胞本身的dna聚合酶来进行自我复制 而大一些的质粒本身携带有能够编码自身质粒复制所需的专一性酶的基因 还有一小类质粒还能够将自己插入到宿主细胞染色体中进行复制 这些质粒可以以整合形式稳定存在于细胞中很多代 但也会在某些阶段以独立的成分存在 具有这种性质的质粒又叫整合型质粒 游离型质粒或附加体 episome 质粒dna的构型 sc型共价闭合环形dna covalentlyclosedcircuardna cccdna oc型开环dna ocdna l型线性dna ldna oc型 sc型 l型 不同构型dna的移动速度次序为 scdna ldna ocdna 1 2质粒的大小和拷贝数 sizeandcopynumber 质粒的大小和拷贝数对于基因克隆来说尤为重要 质粒的大小范围从1 0到250kb不等 其中只有很小的一部分能够在克隆实验中得到应用 拷贝数指的是在通常情况下 一个细菌细胞中某种质粒的分子数 现在还不清楚控制拷贝数的因素 一般来说 一个作为克隆载体的质粒需要在细胞中以多拷贝的形式存在 这样才能够获得大量的重组dna分子 1 3质粒的接合性和相容性 conjugationandcompatibility 质粒可以分为两大类 结合性质粒 conjugativeplasmid 和非结合性质粒 non conjugativeplasmid 接合性质粒除了自主复制所必须的基因以外 还有一套能够促进细菌细胞间的有性结合和质粒转移的基因 这些转移基因存在于接合性质粒中 而在非接合性质粒中不存在 接合性质粒从一个细胞向其他细胞进行扩散的过程 在同一个细胞中能够发现不同种类的质粒 比如大肠杆菌细胞中可同时含有多达7种不同的质粒 这些不同的质粒为了能够共存于同一细胞中 必需能够相容 compatible 如果两个质粒不能够相互适应 不具备相容性 在没有选择压力的情况下 其中一个将很快从细胞中消失 因此 根据不同质粒间是否具备相容性 可以把它们划分成不同的不相容群体 incompatibilitygroup 质粒不相容性 同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象 称为质粒不相容性 不亲和性 1 4质粒的种类 1 致育质粒或称f质粒 fertilityplasmid 是第一个从大肠杆菌细胞中被发现的质粒 携带有负责接合转移的基因 tragenes 即编码形成性纤毛的基因和dna复制的基因 是e coli等细菌中决定性别的质粒 它是一个分子量为62 106da 94 5kb 约等于2 核染色体dna的小型cccdna 它能编码约94个中等大小的多肽 而其中有1 3的基因 tra区 与接合作用 conjugation 有关 根据质粒的主要特征可以把质粒分为以下5类 orit oriv tragenes32kb 100kb usedtoinitiatereplicationfortransfer usedtoinitiateplasmidreplication iselements insertionsequencesusedintransposition discreteregionthathastransfergenes tra trbloci 40genes originoftransfer fplasmid 2 耐药性质粒或称r质粒 resistance r plasmids 又称r因子 携带有能赋予宿主细菌对某一种或多种抗生素抗性的基因 如抗氯霉素 氨苄青霉素 r因子在细胞内的拷贝数可从1 2个到几十个 分属严紧型和松弛型复制控制 后者经氯霉素处理后 拷贝数甚至可达到2000 3000个 多数r因子是由相连的2个dna片段组成 其一称rtf质粒 resistancetransferfactor 抗性转移因子 它含有调节dna复制和拷贝数的基因及转移基因 rtf的分子量为11 106da 其二为抗性决定质粒 r determinant 大小不很固定 其上含有其他抗生素的抗性基因 例如抗青霉素 氯霉素 链霉素 卡那霉素和磺胺等基因 rtfconjugativeplasmidtransfergenesrdeterminantresistancegenestransposons 3 col质粒 colplasmids 又称大肠杆菌素质粒 赋于大肠杆菌产生大肠杆菌素 colicins 的能力 具有通过抑制复制 转录 转译或能量代谢等而专一地杀死其他肠道细菌的功能 其分子量约4 104 8 104da col因子可分两类 分别以colel和colib为代表 前者分子量小 无接合作用 是多拷贝的 后者分子量较大 它与f因子相似 具有通过接合作用转移的功能 属严紧型控制 只有1 2个拷贝 凡带col因子的菌株 由于质粒本身编码一种免疫蛋白 从而对大肠杆菌素有免疫作用 不受其伤害 4 降解质粒 degradativeplasmids 携带有分解或降解某种芳香族化合物为简单化合物或无机物的酶系基因的质粒 赋予宿主细胞降解某种芳香族化合物的能力 降解性质粒只在假单胞菌属 pseudomonas 中发现 这些质粒以其所分解的底物命名 例如有分解cam 樟脑 oct 辛烷 xyl 二甲苯 sal 水杨酸 mdl 扁桃酸 nap 萘 和tol 甲苯 质粒等 5 毒性质粒 virulenceplasmids 赋予宿主菌致病性 比如根瘤农杆菌中的ti质粒 能够在双子叶植物中诱导根瘤菌 即诱癌质粒 存在于根癌土壤杆菌 agrobacteriumtumefaciens 中 可引起许多双子叶植物的根癌 当细菌侵入植物细胞中后 把细菌的dna释放到植物细胞中 这时 含有复制基因的ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合 破坏控制细胞分裂的激素调节系统 从而使它转变成癌细胞 ti质粒长200kb 是一个大型质粒 当前 ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体 一些具有重要性状的外源基因可借dna重组技术设法插入到ti质粒中 并进一步使之整合到植物染色体上 以改变该植物的遗传性 达到培育植物优良品种的目的 ti质粒 tumorinducingplasmid 1 5细菌外其他生物体中的质粒 尽管质粒在细菌中广泛存在 但在其他生物体中却并不常见 人们在酿酒酵母菌株中观察到了2 m质粒 2 mcircle 2 m质粒的发现是非常幸运的 因为人们可以利用2 m质粒构建载体来转化酵母这种非常重要的生物 2 1质粒克隆载体的命名法 质粒命名第1个小写字母p表示质粒 plasmid 后面2个或3个大写字母表示构建该质粒的研究人员的姓名或实验室名称 最后的数字表示构建的一系列质粒的编号 pbr b r bolivarandrodriguez pbr322 puc uc universityofcalifornia puc18 19 pcr clevernameforavectorusedtoclonepcrproducts 2 质粒克隆载体 天然质粒 没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒 在大肠杆菌中 常见的可用于基因克隆的天然质粒有cole1 rsf2124和psc101等 但存在一定的局限性 2 2天然质粒 第一个用于基因克隆的天然质粒psc101 它含有一个ecori酶切位点 一个四环素抗性选择记号 tetr 插入外源片断后不影响其复制功能 但该质粒分子量较大 9263bp 拷贝数低 stanleyn cohen科恩 the sc standsforstanleycohen 2 3 1pbr322质粒 pbr322isaplasmidandforatimewasoneofthemostcommonlyusede colicloningvectors pbr322wasthefirstartificialplasmid createdin1977 itwasnamedeponymouslyafteritsmexicancreators pstandingforplasmid andbrforbolivarandrodriguez 2 3几种常见的质粒克隆载体 4361bp pbr322is4361basepairsinlengthandcontainsarepliconregion sourceplasmidpmb1 theamprgene encodingtheampicillinresistanceprotein sourceplasmidpse2124 andthetetrgene encodingthetetracyclineresistanceprotein sourceplasmidpsc101 theplasmidhasuniquerestrictionsitesformorethanfortyrestrictionenzymes 13ofthese40sitesliewithinthetetrgene thereare6keyrestrictionsitesinsidetheamprgene theoriginofreplicationororisiteinthisplasmidispmb1 acloserelativeofcole1 第一部分来源于pse2124的氨苄青霉素抗性基因 apr 第二部分来源于psc101质粒的四环素抗性基因 tcr 第三部分则来源于cole1的派生质粒pmb1的dna复制起点 ori pbr322的第一个优点在于它的大小 作为一个克隆载体 它应该小于10kb 否则在提纯的时候很容易导致dna断裂 pbr322本身只有4361bp 这就意味着我们很容易纯化它以及由它构建的重组体 即便添加上6kb的dna片段 pbr322的大小仍在可操作的范围内 pbr322的第二个优点是它有两个抗生素抗性基因 这两个抗药性基因都可以作为该质粒的筛选标志 而且每个抗性基因都拥有几个单酶切位点 这在克隆实验中特别有用 用psti puvi或scai酶切后插入dna会导致氨苄青霉素抗性基因失活 用bamhi和sali等限制性内切核酸酶酶切后插入dna会导致四环素抗性基因失活 有大量的限制性酶切位点可以用作插入失活 这意味着pbr322支持很多种不同的酶切片段的插入 第三个优点在于pbr322有相当多的拷贝数 通常在被转化过的大肠杆菌中有大约15个pbr322质粒分子 而且在蛋白质合成抑制剂 氯霉素 存在的情况下 通过质粒扩增 pbr322的拷贝数可以增加到1000 3000 这样 通过培养大肠杆菌就可以获得大量重组pbr322质粒分子 2 3 2pbr327 一个高拷贝数质粒 pbr327通过从pbr322中移去一个长1089bp的片段而构建 该片段的删除并没有损伤ampr和tetr这两个抗性基因 但改变了质粒的复制能力和结合能力 因此 pbr327与pbr322有两点重要不同 1 pbr327的拷贝数比pbr322更高 这表现在每个大肠杆菌细胞可以存在30 45个质粒分子 2 1089bp片段的删除 破坏了pbr322的结合能力 使它不能通过结合转移到另一个大肠杆菌细胞中去 这一点对生物防范很重要 2516 1427 puc也是一个来自于pbr322的质粒 它保留了后者的复制起点和ampr基因 但是 ampr基因的核苷酸序列被改变了 不再包含一些限制性单酶切位点 而所有这些位点被集中到puc所携带的lacz 基因上的一小段序列上 puc是一个系列 包括puc8 puc9 puc18 puc19 8与9表示mcs是正向和反向 其编号与mcs中限制位点数目有关 编号愈大 mcs中含有的限制位点数愈多 2 3 3puc alacselectionplasmid puc8所拥有的3个优点使它成为最受欢迎的大肠杆菌克隆载体之一 第一个优点的获得纯属偶然 人们在构建这个质粒时 在它的复制起点上产生了一个偶然的突变 使它在大肠杆菌中的拷贝数达到了500 700 这还是它在扩增以前的数目 这样我们就可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量的目的dna 第二个优点在于重组体的识别只需一步 仅仅需要把待筛选的大肠杆菌细胞铺到含有氨苄青霉素和x gal的琼脂培养基上 无论是pbr322还是pbr327 重组体的筛选都需要把菌落从一种抗生素培养基平移到另一种抗生素培养基上 一个用puc8作载体的克隆实验比选择pbr322和pbr327要节约一半的时间 第三个优点是puc8具有众多的单酶切位点 这使有两个不同粘性末端的dna片段可以直接被克隆 blue whitecolorscreening lacz functionalenzyme 半乳糖苷酶基因 lacz x gal 5 溴 4 氯 3 吲哚 d 半乳糖苷 是 半乳糖苷酶 galactosidase 的显色底物 在 半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物 异丙基硫 d 代半乳糖苷 2 3 4pgem3z 克隆dna的体外转录 pgem3z与puc8载体很相似 都含有ampr和lacz 基因 lacz 中有一个多酶切位点 两个质粒的大小也十分相似 它们之间的区别在于 pgem3z多了两个短片段 每个片段都含有一个启动子序列 募集rna聚合酶 外源dna在限制性酶切位点插入pgem3z载体 在限制性酶切位点的两边就分别存在着两个启动子序列 在体外被克隆的dna分子就可以指导rna的合成 产生的rna可用作杂交的探针 也可用于蛋白质的合成 或用于rna的加工过程 被pgem3z和其他同类载体所携带的启动子并不是大肠杆菌rna聚合酶识别的标准启动子 它们或被t7噬菌体编码的rna聚合酶专一性识别 或被sp6噬菌体编码的rna聚合酶专一性识别 之所以在体外转录系统中选择噬菌体的rna聚合酶 因为噬菌体的rna聚合酶的活性要比大肠杆菌的rna聚合酶的活性高的多 能够每分钟合成1 2 grna 2 4穿梭质粒载体 shuttleplasmidvector ashuttlevectorisavector usuallyaplasmid constructedsothatitcanpropagateintwodifferenthostspecies therefore dnainsertedintoashuttlevectorcanbetestedormanipulatedintwodifferentcelltypes themainadvantageofthesevectorsistheycanbemanipulatedine coliandthenusedinasystemwhichismoredifficultorslowertouse e g yeast o