流式细胞仪检测HLA-B27及其临床意义

流式细胞仪检测 HLA B27 及其临床意义 摘要 目的通过流式细胞术对人体外周血 HLA B27 的检测 来评价 HLA B27 辅助临床诊断强直性脊柱炎 AS 的应用价值 方法 56 例强直性脊柱炎患者和 51 例 健康体检者 用荧光标记的抗 HLA B27 CD3 单克隆抗体与 其外周血 以 EDTA K2 抗凝 特异性结合 用流式细胞仪 检测其荧光强度来反映细胞表面 HLA B27 抗原的表达 结 果从流式细胞术检测显示 56 例 AS 患者中 HLA B27 阳 性 51 例 阳性率为 91 1 51 例健康体检者中 HLA B27 阳性 3 例 阳性率为 5 9 两者存在显著性差异 P 0 01 结论 AS 患者 HLA B27 阳性率明显高于正常人 所以检测 HLA B27 对强直性脊柱炎的诊断与鉴别诊断有着 重要的意义 关键词 流式细胞仪 强直性脊柱炎 HLA B27B27 是 HLA B27 位点上的一个重要的等位基因 其与许多疾病 具有相关性 尤其是强直性脊柱炎 而且这种相关是迄今 为止已知的 HLA 与疾病的关联中最强和最典型的 目前 检测 HLA B27 的主要方法有补体依赖性微量淋巴细胞毒试 验 玫瑰花法 ELISA 法 流式细胞术 PCR 法等 其中 以标准的 NIH 微量细胞毒法最为常用 这种方法操作简便 且准确性尚可 但是受细胞纯度 补体差异 单抗效价及 HLA 高度多态性的影响 易出现漏诊或假阳性 错判 误判 1 现在我们用荧光标记的单克隆抗体与人类白细胞表面 抗原 HLA B27 结合 用流式细胞仪来检测其细胞表面的 HLA B27 表达 现报告如下 1 资料与方法 1 1 一般资料 1 1 1 标本来源 107 例该院骨科门诊及住院确诊为 AS 的患者和健康体检者 其中经临床检查和影像学检查符合 AS 的患者 56 例 男 38 例 女 18 例 年龄 18 77 岁 健 康体检者 51 例 男 27 例 女 24 例 年龄 23 82 岁 取上 述人员静脉血 2ml EDTA K2 抗凝 1 1 2 试剂美国 Becton Dickinson 公司 HLA B27 kit HLA B27 FITC Clone GS145 2 IgG1 kappa CD3 PE CloneSK7 IgG1 kappa HLA B27 Calibration Bead 溶 血剂 Lysing solution 1ys S 批号为 340183 洗涤液及鞘液 用 Coulter Isoton II 血细胞稀释液 批号为 8546733 1 1 3 仪器美国 Beckman CoulterEPICSXL MCL 型流式 细胞仪 1 2 方法 1 2 1 标本处理取 HLA B27 FITC CD3 PE 荧光抗体 30ul 全血样本 50ul 加入流式专用试管底部 混匀 置于 室温避光 15min 加 10 倍稀释后的溶血剂 2ml 混匀 避 光 15min 1500r min 离心 5min 弃上清液后用 0 01N PBS 洗涤两次 上机测定 1 2 2 检测与结果判断 流式细胞仪校正使用 Beckman Coulter 公司的 FLOW CHECK 校准光路 样本检测 取标 准荧光微球 1 滴 Calibration Bead 用 1ml 蒸馏水稀释 测 到一标准峰 分析已经处理好的样本 选取以 CD3 PE 标记 的淋巴细胞 并检测这群细胞 HLA B27 的中间荧光强度 Mdx 若中间荧光强度大于标准微球峰荧光强度即为阳性 反之则为阴性 2 结果 HLA B27 在强直性脊炎患者 AS 和健康体检者中检 测结果如下 临床诊断 AS 患者例数 56 例 阳性例数 51 例 阳性率为 91 1 健康体检者 例数 51 例 阳性例 数 3 例 阳性率为 5 9 从上述结果可以看出 AS 患者 HLA B27 的阳性率高于 健康体检者的阳性率 3 讨论 强直性脊椎炎 ankylosing spondylitis AS 是一种慢性 进行性和炎性疾病 主要累及骶骼关节 脊柱 脊柱软组 织及四肢关节 主要症状是腰 骶及下肢关节疼痛 晚期 患者脊柱僵硬呈板状 活动受限 HLA B27 与 AS 发病呈 高度相关 其相关性为目前已知的 HLA 与疾病关系中关联 性最强和最典型的一种 2 有研究表明 HLA B27 检测可 提高 X 线诊断 AS 的阳性率 对 AS 早期尤其是 X 线表现 不典型时具有良好的临床应用价值 3 本实验结果提示 AS 患者 HLA B27 阳性率显著高于正 常人阳性率 但 HLA B27 阳性不能诊断随机选择患者是否 患有 AS 因为非 AS 患者也有 3 7 的阳性率 但当临 床症状体征及影像学检查怀疑有 AS 时 HLA B27 阳性可作 为诊断指标 如某患者诊断 AS 的可能性为 50 若患者 阳性 则诊断 AS 的概率提高到 95 左右 若该患者 HLA B27 阴性 则患 AS 的概率降至 3 左右 AS 患者的临床 症状与类风湿性关节炎有相似之处 因此对确诊为类风湿 性关节炎的患者要进行 B27 的检测 以免漏诊 少儿患者 因骶髂关节骨后未闭合 也给炎症程度的判断造成困难 所以 AS 从发病到明确诊断往往需几年时间 而 B27 检测 可以弥补上述不足 因此 B27 检测可作为 AS 的筛选方法 过去使用的血清学方法存在许多不足 要求用血量大 需无菌分离淋巴细胞 而且分离的淋巴细胞要有足够的活 性 所用抗血清为多克隆抗体 特异性较差 实验不易标 准化 分析所需时间较长 判断通过记数死亡的淋巴细胞 的方法 常含主观人为因素影响 本实验应用流式细胞术 根据直接荧光染色的原理 通过双色直接免疫荧光单克隆 抗体试剂抗 HLA B27 FITC CD3 PE 与成人外周血淋巴细 胞特异性结合 使细胞具有一定的荧光强度 这种荧光强 度可被流式细胞仪测得 从而判断 HLA B27 抗原阳性或阴 性 同时可以根据荧光强弱的大小来进行判断 HLA B27 的 表达情况 具有快速 简单 特异性高的优点 参考文献 1 李维 府伟灵 流式细胞术检测 98 例献血者外周血 HLA B27 的临床意义 J 第三军医大学学报第 25