【毕业学位论文】（Word原稿）催化合成茶氨酸的菌株筛选与重组菌的构建生物技术硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 催化合成茶氨酸的菌株筛选与 重组菌的构建 of as a of of as a of I 摘 要 茶氨酸（ 1950年首次从绿茶中分离得到的，是茶叶中的特征氨基酸，也是茶叶的呈味物质之一，具有很好的生理功能和商业价值 。其制备研究是目前茶学研究中的一个热点。由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸，成本高昂；化学合成茶氨酸工艺较复杂；组织培养合成茶氨酸产量低。开展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理论意义和实践价值。本论文针对茶氨酸的微生物发酵法制备技术，开展了菌株筛选和工程菌构建两方面工作，将生物技术运用到天然产物制备技术中。本论文通过比较不同微生物催化 盐酸乙胺合成茶氨酸的能力大小，对微生物进行了筛选，明确了 9 种微生物催化合成茶氨酸的能力；通过基因克隆技术构建了重组菌，优化了重组菌催化合成茶氨酸的条件，重 组菌株酶活达到出发菌株的 15 倍，茶氨酸产量达到 。主要研究结果如下： 1、对 9 种微生物催化 现它们催化合成茶氨酸的能力都很低。茶氨酸的最大生成量仅为 。 2、以培养好的 菌液为模板进行 应，将扩增出的 连接构建重组质粒 重组质粒建重组菌。重组菌株经 2诱导后， 酶活性检测，重组菌株每克湿菌体的酶活达到 右，约是出发菌株 15 倍。 3、本实验优化了 重组菌催化 组菌经 37培养 2h 左右，然后再加 2诱导表达 4h 收集菌体。 1含 谷氨酰胺、 酸乙胺、 70mg/体、 30培养 4 小时， 茶氨酸 的 最大 生成 量为 ，即每克湿菌体可催 化合成茶氨酸的量为 420g/L。 化率为 氨酰胺（ 乙胺合成茶氨酸 的量为 ， 本实验中的 是 茶氨酸 产量有所提高。 本实验构建的重组菌具有较好的催化 L谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力，可以尝试用其进行发酵生产茶氨酸 小试 实验，可以尝试将本实验构建的重组质粒转化到不同表达载体系统中，以寻找更适合 实验对于微生物发酵法工业化生产茶氨酸等方面的工作具有较 好的指导作用和实际价值。 关键词： 筛选，茶氨酸， 重组菌 ， 催化合成 950， is of of It of is a t is to a of is of by is of is In we to of In of of as a of it of is We a of of is 5 as 1、 of as a of It a of of is 2、 We by 2 g of is .0 it is 5 3、 of 7 h， 2 h ml 70mg/ml 0 h of ，g 20g/L as to by as to 0% a of as a of be be to of a of 录 第一章 绪论 . 1 氨酸研究的历史与现状 . 1 氨酸体内生物合成途径 . 2 氨酸的生理功能研究与开发利用前景 . 3 . 6 取分离技术 . 6 学合成技术 . 6 织培养技术 . 7 生物发酵技术 . 8 氨酸测定方法 . 9 第二章 实验设计方案 . 10 验目的 . 10 实验的主要内容 . 11 种微生物催化合成茶氨酸能力的测定 . 11 . 11 . 11 组菌催化合成茶氨酸反应条件优化 . 11 术路线 . 11 种微生物催化合成茶氨酸能力的测定 . 11 达 . 11 组菌催化合成茶氨酸反应条件优化 . 12 第三章 9 种微生物催化合成茶氨酸能力的测定 . 13 料和试剂 . 13 验方法 . 14 微生物生长曲线制作方法 . 14 体收集方法 . 15 化合成茶氨酸反应方法 . 15 氨酸测定方法 . 15 果与分析 . 16 微生物生长曲线制作 . 16 氨酸标样 . 19 种微生物催化合成茶氨酸能力测定 . 20 结 . 21 第四章 大肠杆菌 . 22 料和试剂 . 22 验方法 . 24 物的设计与合成 . 24 菌液为模板进行 . 25 . 25 的片断和载体双酶切 . 25 低融点胶电泳回收酶切的目的片断和载体 并进行产物纯化 . 26 接反应 . 26 . 27 接产物转化感受态细胞 . 27 法小批量抽提质粒 . 27 酸电泳 . 28 组质粒的双酶切验证 . 28 组质粒的 . 28 因序列测定 . 29 果与分析 . 29 . 29 . 29 组质粒的双酶切验证 . 31 组质粒的 . 32 因序列测定 . 32 结 . 34 第五章 . 35 料和试剂 . 35 验方法 . 36 组菌生长曲线制作方法 . 36 同诱导剂浓度优化实验 . 36 同诱导温度优化实验 . 37 达产物 . 37 . 37 果与分析 . 38 组菌生长曲线制作 . 38 同诱导剂浓度优化实验结果 . 39 同诱导温度优化实验结果 . 39 达产物 . 40 . 41 结 . 41 第六章 重组菌催化合成茶氨酸反应条件优化 . 42 料和试剂 . 42 验方法 . 42 同菌量优化实验 . 42 化实验 . 42 . 42 同反应时间优 化实验 . 43 照处理 . 43 果与分析 . 43 同菌量优化实验结果 . 43 同 化实验结果 . 44 同底物浓度优化实验结果 . 45 同反应时间优化实验结果 . 46 照处理结果 . 47 结 . 47 V 第七章 讨论与总结 . 49 参考文献 . 51 致 谢 . 54 作者简历 . 55 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 卞青霉素 苷三磷酸 基 对 化乙锭 二胺四乙酸 效液相色谱法 丙基硫代 B 培养基 克隆位点 密度 合酶链式反应 ,N,N,N,N,N,N,中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 氨酸研究的历史与现状 茶氨酸（ 茶叶中的特征氨基酸，也是茶叶的呈味物质之一。它是 1950年由日本酒户弥二郎从玉露茶新梢中发现的，并命 名为茶氨酸 （ 酒户弥二郎 1950） 。到目前为止，在其它植物中很少有发现茶氨酸的报道，除了在蕈、茶梅、蘑菇、油茶、红山茶中已检测出微量存在外，在其它植物中尚未发现。茶氨酸是茶树中含量最高的游离氨基酸，在茶树的新梢芽叶中， 70%左右的游离氨基酸是茶氨酸。在茶鲜叶中，一般茶氨酸的含量占干重的 1% 2%，有些名特优茶含量可超过 2%。在茶汤中，茶氨酸的浸出率可达 80%，对绿茶有重要作用 （ 宛晓春 2003） 。近年对茶叶保健成分的研究中，茶氨酸是比较引人注目的一个化合物，它的许多生理作用被发现后，合成及提取茶氨酸也成了广 泛关注的研究课题。 茶氨酸属酰胺类化合物 ,化学命名为： 结构式如图 子式为： 子量为 然界存在的茶氨酸均为 品为白色针状结晶，熔点 217 218（分解）。 +易溶于水，而不溶于无水乙醇和乙醚，且溶解性随温度升高而增大。水溶液成微酸性，具有焦糖的香味和类似味精的鲜爽味，味觉阀值 经 6的盐酸水解后生成 茚三酮反应成紫色。与碱式碳酸铜反应生成淡紫色柱状铜盐 （ 陈椽 1983） 。茶氨酸的性质较稳定。将茶氨酸溶液煮沸5将茶氨酸溶于 5下储放 12 个月，茶氨酸含量不变。因此在通常的食品加工、杀菌过程中，茶氨酸的性质不会发生变化。 图 氨酸结构式 of 5作为茶叶的特征氨基酸，茶氨酸几乎存在于茶树的所有器官和组织中。经大量研究表明，茶氨酸在茶树的根部形成，然后向新梢积聚，因而茶树新梢中茶氨酸含量最高，老叶、根部、茎部也有少量分布，而果皮、子叶中含量最少。茶氨酸的形成 是茶树储存氮的手段之一，这是因为茶氨酸被茶氨酸水解酶水解为谷氨酸和乙胺，乙胺在胺氧化酶的作用下产生氨和乙醛，氨可作为氮源供茶树的幼龄组织生长，因此茶氨酸是茶树幼芽光合作用开始前有机碳骨架合成的起始物，而且也是茶树中多酚类物质的重要前体 （ 张 莹等 2003） 。茶氨酸在茶树中的积累与光照、温度和合成前体密切相关。研究发现当温度为 25，黑暗条件下，在培养基中加入盐酸乙胺能明显增加茶中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 氨酸的积累。 1992年我国学者李荣林等对茶树新梢中茶氨酸的分布情况及其在不同季节、不同品种和不同栽培条件下含量的变化作了较全面的研究 （ 李荣林 1992） 发现，随着茶树叶片成熟度的增加，茶氨酸的含量逐渐降低，因此茶氨酸可作为茶鲜叶嫩度的化学指标之一；茶氨酸在新梢中的含量随季节的不同存在显着的差异，其在春茶新梢中的含量是在夏茶中的 4倍，是在秋茶中的 7倍；环境对茶氨酸含量也有较大的影响，土壤的 利于茶氨酸的积累，而氨态氮的存在和遮荫环境有利于茶氨酸的积累；茶叶制作过程不同，其茶中茶氨酸的含量也有明显变化。绿茶制造过程中由于谷氨酸的转化使茶氨酸的含量呈增加趋势；黄茶、青茶、黑茶制造过程中谷氨酸的变化不明显，茶氨酸呈减少趋势；白茶制造 过程中茶氨酸变化的特点是长时间的萎凋中蛋白质分解，谷氨酸增多并向茶氨酸转化，因此茶氨酸开始表现为增加趋势直至干燥才有所减少；而红茶发酵过程茶氨酸变化复杂，有增有减，总趋势是减少。 1997年钟俊辉等研究了不同培养条件、不同碳源和不同环境对茶愈伤组织培养及其茶氨酸的积累的影响，发现激素 和 6时对茶氨酸积累最有利；而培养基中碳源不同，愈伤组织的增长速率及其茶氨酸的含量的差异并不显着，但当用不同浓度的蔗糖作为碳源时发现，随着蔗糖浓度的增加茶氨酸的积累呈上 升趋势 （ 钟俊辉等 1997） 。 1997年齐桂年等研究表明，不同工艺杀青对氨基酸组分含量有一定的影响，其氨基酸总量和茶氨酸含量均为蒸汽杀青锅炒杀青滚筒杀青，并且提出可通过工艺技术对茶叶中茶氨酸和其它氨基酸的含量进行调控 （ 齐桂年等 1997） 。 虽然人们普遍认为茶氨酸可作为评价绿茶质量的重要标志之一，但对红茶茶氨酸的含量与其品质的相关性问题有着不同的看法。 7种茶的茶氨酸含量进行分析时发现，某些红茶中茶氨酸的含量并不比绿茶和乌龙茶低，有的红茶 (如中国的云南茶 )中茶氨酸的含量甚至还高于某些绿茶 （ H et 997） 。赵和涛等在研究茶氨酸的生化特性时测定了我国六大茶类中茶氨酸的含量，结果发现以白茶中茶氨酸的含量最高，为 00次是绿茶和黄茶，在 100茶相对绿茶低一点，为 100g；青茶为 100g；含量最低的是黑茶，只有 100 g，这可能是由于其加工过程中特有的渥堆作用导致了茶氨酸大量损失 (赵和涛 1994)。因此也有学者认为茶氨酸的含量也可 作为红茶品质的重要评价因子之一。 氨酸体内生物合成途径 茶氨酸在茶树根部由茶氨酸合成酶催化谷氨酸和乙胺反应合成，然后通过枝干送至叶部，并积累在叶中。芽与第一叶中含量最高，往下逐渐降低。在光照射下茶氨酸会分解为谷氨酸和乙胺。谷氨酸成为氮源，乙胺氧化后被用于合成儿茶素 (如图 这个分解代谢在蔽光条件下受到抑制。因此遮荫栽培的茶叶中茶氨酸含量较高。 相反则是多酚类含量高 (杨贤强 1982，村松敬一郎1991)。 日本的玉露、碾茶 (抹茶原料 )的栽培就是采用遮荫法以提高茶叶中茶氨酸含量。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 图 氨酸在茶树体内代谢途径 in 树中茶氨酸合成产前体是谷氨酸和乙胺，这一点己用 14C 示踪的方法得到了证实 （ 1974，竹尾忠一 1981） 。乙胺是由丙氨酸脱羧而来 （ 1974） 。丙氨酸和谷氨酸虽然广泛存在于各种动植物体内，但却只有茶树才具有大量合成茶氨酸的能力。这是因为茶树体内具有 胺连接酶 又称茶氨酸合成酶 )，该酶催化如下反应： 乙胺 + 茶氨酸 +酸。该酶己被 K 证实对谷氨酸、乙胺和 有较高的特异亲和力，且仅为茶树所特有， 但该酶在体外极易失活 （ 1965） 。茶氨酸体内合成过程中另一重要的酶是丙氨酸脱羧酶 (， 它催化丙氨酸脱羧形成乙胺，在体外的稳定性比茶氨酸合成酶要高得多。 茶氨酸的生理功能研究与开发利用前景 从 茶氨酸自发现以来，一直是被作为茶叶的主要品质成分广 为研究。近几年来，茶氨酸具有的一些特殊生理功能不断地被发现和研究，特别是其具有的药用功能成为研究的热点。茶氨酸的主要生理功能有： （ 1）降血压作用。 等报道了茶氨酸对先天性高血压患者具有降压作用 （ 1998a） 。血压是通过人体的中枢及末梢神经系统的递质儿茶酚胺和 5 等通过实验证明，服用茶氨酸后 5增加了 5鼠体内的 5给自发 性高血压老鼠注射不同剂量的茶氨酸时，血压也呈下降趋势，并且下降的程度与注射的剂量呈正比关系，但茶氨酸对血压正常的大鼠没有降血压作用 （ 1998b） 。 （ 2）增强抗肿瘤药物的疗效。近期的研究表明茶氨酸本身虽无抗肿瘤活动，却能提高多种抗肿瘤药物的疗效。抗癌药毒杀素（ 茶氨酸配合应用时，可抑制 将茶氨酸与抗癌药阿霉（ 时使用时，增强了阿霉素抗癌的功效，茶氨