胰蛋白酶抑制剂的研究进展.docx

胰蛋白酶抑制剂的研究进展谭竹钧 ,沈明才 ,张峰 ,胡华平(广东工业大学 轻工化工学院 ,广东 广州 510090 )摘要 : 胰蛋白酶抑制剂是对胰蛋白酶具有抑制作用的一类物质 . 综述了近几年来 ,用不同原料制备胰蛋白酶抑制剂的研究进展及临床应用 .关键词 : 胰蛋白酶抑制剂 ;基因工程 ;治疗疾病中图分类号 : TQ464. 7文献标识码 : A文章编号 : 100727162 ( 2007 ) 03 20006205胰蛋白酶抑制剂 ( T I)是对胰蛋白酶具有抑制作用的一类物质 . 最早是由 Kun itz从牛胰腺中提取的 胰蛋白酶抑制剂 ,现在发现在动物 、植物 、微生物中都广泛存在 ,并且不同来源的胰蛋白酶抑制剂具有不同的相对分子质量 、氨基酸组成 、氨基酸序列及分 子结构. 分子中的活性部位是赖氨酸 ,抑制作用主要 是与胰蛋白酶等酶的丝氨酸结合 ,使其失活 . 在临床 广泛用于治疗胰腺炎 、休克和脑外科 、手术止血等 . 胰蛋白酶抑制剂通过抑制激肽释放酶以及纤溶酶而 达到止血的目的 ,能显著减少手术中及手术后病人的出血 ,临床研究表明其副作用小 、安全性好 1 . 本 文对近几年胰蛋白酶抑制剂的制备研究及在医疗中的应用进行综述.使用 .王增禄等 3 设计胰脏多酶联产实验对胰蛋白酶 抑制剂进行了探讨 . 制备了 Tryp sin2Sep ha ro se 4B 亲和层析柱 ,采用硫酸铵 、三氯醋酸沉淀 ,离心 、色谱 、冷冻干燥等技术 ,对猪胰脏中胰蛋白酶抑制剂进行 分离纯化 ,用 1 kg胰脏制得 15 m g胰蛋白酶抑制剂 , 酶比活为 2 1089 103 k IU /m g蛋白 .Kish im u ra 等 4 在 太 平 洋 褶 柔 鱼 ( Toda ro2despacif icus)的肝脏中分离得到一种分子质量为 63103 u 的 T I,并研究了其稳定性 、氨基酸组成以及 抑制作用的特点等 ,发现该 T I对酸 、热稳定 ,能有效抑制胰蛋白酶 ,并可抑制肌原纤维自身的溶解 .J ung等 5 在鲣鱼 ( Ka tsuw onuspelam is) 的卵中提3取分离获得一种分子质量为 39 10 u 的 T I, 其在体内以二聚 体 的 形 式 存 在 , 在 pH 410 1010 有 活 性 ,当温度高于 40 时较大程度失活 ; 在不同金属离子如 K+ 、N a + 、M g2 + 、Ca2 + 存在时其活性增强 ,而Cu2 + 的存在却导致失活 .Jo lan ta Kowa lska 等 6 从成熟的 Cyc lan the ra p e2da ta 中提取了 CyPT I I2V II 7种新型的胰蛋白酶抑制 剂 ,它们包含 28 30 个氨基酸 , 分子质量 31031 103 31367 103 u,这 7种抑制剂都强烈抑制 -牛胰蛋白酶 ,而对牛糜蛋白酶抑制则很弱.112 从人尿中提取人尿胰蛋白酶抑制剂 ( HU T I) 是一种丝氨酸蛋 白酶抑制剂 ,表观分子质量为 67 103 u,等电点为 23. 它是一种糖蛋 白 , 糖 的质 量分 数 高达 20 % 30 %. 人尿中的抑肽酶不同于由牛肺 、胰提取的抑 肽酶 ,它对人体不产生抗原抗体反应 ,更适于临床 .1 胰蛋白酶抑制剂的制备1. 1 从动物脏器中提取牛肺胰蛋白酶抑制剂 (也称抑肽酶 ) 的分子质量为 612 103 u,是由 58个氨基酸残基组成的碱性 多肽. 它的一级结构和二级结构均已阐明 ,分子内有3 对二硫键 ,整个分子呈梨型 , 活性中心为赖氨酸 ,位于分子的顶端. 从分子质量看有两类 ,一类是分子 质量较大的 ;一类是分子质量较小的 .宋扬等 2 将化学改性与修饰壳聚糖体 ,共价偶 联配基牛胰蛋白酶 ,制成固定化酶为抑肽酶亲和吸附剂 ,直接对黄牛肺提取液一步层析纯化 ,再超滤脱盐 、浓缩 、去热原 ,冻干即抑肽酶. 抑肽酶比活 517 103 k IU /m g,收率 22 104 k IU / kg (牛肺 ) ;固定化酶 单位活力 21595 103 k IU / g (干 ) , 酶 活 性 回 收 率55 % , 非 特 异 性 吸 附 较 小 , 机 械 强 度 高 , 可 反 复收稿日期 : 2006 212 228基金项目 : 广东工业大学人才基金资助项目 ( 052056 ) ;广东省自然科学基金资助项目 ( 04010984 )作者简介 : 谭竹钧 ( 19552) ,男 ,教授 ,主要研究方向为生物化学制药 .第 3期谭竹钧 ,等 : 胰蛋白酶抑制剂的研究进展7T I、) . 对其性质研究表明 :两个组分均对胰蛋白酶有较强的抑制作用 ,对胰凝乳蛋白酶抑制作用较 弱 ,其中 TB T I2的抑制作用大 于 TB T I2, 两者 对胃蛋白酶 、木瓜蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶均无抑制 作用 . 用 SD S2聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 和 Sep hadexG2100凝胶层析分别对纯化产物进行分析得出 TB T I2和 TB T I2的近似分子质量分别为 1510 103 u和1810 103 u. TB T I2、都具有较高的热稳定性 ,在100 处理 10 m in后可保留 86 %左右的抑制活性. TB T I在酸性环境下较为稳定 ,在 pH 2. 0 条件下保 温 1 h,仍保留 75 %的抑制活性 . 用 L ineveae r2B u rk作图法得知 , 该抑制剂属竞争性抑制类型 , TB T I2 的 Ki值为 3159 10 - 7 mo l /L (以 BA PNA 为底物 ) ,对胰蛋白酶的摩尔抑制比为 1 114.康庄等 20 以菠菜种子为材料 , 经脱脂 、酸性溶 液抽提 、热变性 、硫酸铵分部沉淀得到胰蛋白酶抑制剂粗提物 ,再经离子交换 、亲和层析和凝胶过滤 ,分离得 到胰 蛋白 酶 抑制 剂 SO T I, 纯 化倍 数 为 57122 , SD S2PA GE测定其分子质量约为 22 103 u,等电聚焦测定其等 电 点 为 4102. SO T I具 有 较 高 的 热 稳 定 性 ,在 100 处理后仍然具有一定的抑制活性 .M i2H yun Kim 等 21 从 土 豆 茎 块 中 获 得 一 种 胰蛋白 酶 抑 制 剂 , 它 是 一 种 Po tide2G, 分 子 质 量 为51579 103 u 的抗菌性缩氨酸 ,能强烈抑制胰蛋白 酶 、糜蛋白酶 、木瓜蛋白酶 .目前提取 U T I的方法有综合使用三氯醋酸 、硫酸铵 、甲醇沉淀法 7 , 使用膨润土法 8 , 使用 D EA E- 纤维素法 9 ,使用固定化胰蛋白酶的方法 ,直至最 近使用的脱乙酞壳多糖以及硅酸镁的方法.范俊虎等 10 利用纯胰蛋白酶作为配体偶联于CNB r2Sep ha ro se4B 为亲和 载 体 , 在 不 同条 件下 洗 脱 亲和蛋白 ,可从粗品溶液中快速分离纯化具有胰蛋 白酶抑制活性的两种纯产物. 根据洗脱条件 ,可将有抑制活性的 20 103 和 40 103 u 蛋白质分离为两个单独组分或混合物 . 其中 20 103 u组分的抑制活 性回收率为 35 % ,抑制比活为 31387 103 k IU /m g;40 103 u组分的相应值分别为 53 %和 31116 103 k IU /m g. 混合物的抑制活性回收率和抑制比活分别 为 89 %和 31076 103 k IU /m g.孙爱龙等 11 用人尿胰蛋白酶抑制剂的粗品经 过超滤 ,离子交换层析和亲和层析三步纯化 ,获得人尿胰 蛋 白 酶 抑 制 剂 的 中 间 品 , 其 效 价 由 原 来 的10 IU /m g纯化 到 2 240 IU /m g, 比 活 为 2450 IU /m g蛋白质 ,活性回收率为 58 %.汪炬等 12 通过 ZnC l 胶体 沉 淀 和 乙 醇 沉 淀 相2结合的方法将人尿胰蛋白酶抑制剂和人尿激肽释放酶两者有效分离 ,得率高 、活性保留好 .1. 3 从植物中提取20 世纪 40 年代人们发现植物中含有蛋白酶抑 制剂 ,在植物贮藏器官 ,特别在种子中 ,其含量常常 高达总蛋白的 10 % 13 . 食物中植物胰蛋白酶如果没被除去或抑制 ,它在体内能与小肠液中胰蛋白酶 、糜 蛋白酶结合 ,生成无活性复合物 ,消耗和降解胰蛋白酶 ,导致肠道对蛋白质消化 、吸收及利用能力下降 .导致胰腺肿大和体内氨基酸代谢失调等疾病. 但也 有报导大豆中微量 胰蛋 白酶 抑制 剂 对于 糖尿 病 治疗 、调节胰岛素失调有一定效果 14 216 .陈星等 17 利用固定化胰蛋白酶分离纯化大豆 胰蛋白酶抑制剂可得到高纯度的大豆胰蛋白酶抑制 剂 . 研究结果表明 :大豆胰蛋白酶抑制剂通过各阶段纯化后其活性从 0195 k IU /mL 增高至 32515 k IU /mL ,纯化程度提高 32416 倍 ,得率 01033 % ; 电泳结果表 明 :利用固定化胰蛋白酶分离纯化的大豆胰蛋白酶抑制剂有单谱带 ,纯化效果明显 .忻骅等 18 从已发表的 Ti基因顺序设计了引物 ,通过 PCR 技术从大豆总 DNA 中扩增了 Tid基因的编 码序列 ,从而最终获得了 Ti蛋白一级结构的资料.张政等 19 采用凝胶层析及离子交换层析等方 法 ,从苦荞种子中分离出一组胰蛋白酶抑制剂 ( TB 22 胰蛋白酶抑制剂的基因工程研究随着分子生物学的发展 ,用基因工程的方法来 制备胰蛋白酶抑制剂已成为可能. 近年来 ,利用基因 工程的方法获得不同 T I的各种突变体 ,对其本身及 其与不同丝氨酸蛋白酶结合形成的复合物晶体结构 或溶液结构进行测定 ,从而对胰蛋白酶以及 T I中各 个部位在两者相互 作用 的 过程 中发 挥 的作 用进 行 判断 .高捷等 22 为实现抑肽酶的大量制备 ,按大肠杆 菌惯用密码子用人工方法合成抑肽酶结构基因 ,克 隆于 PUC18 的 EcoR 和 P st 位点 ,转入 Top10 大 肠杆菌 ( recA 2) 中 ,经测序证明序列正确. 表达体系 模拟抑肽酶的体内成熟过程 ,将其自身的 13 肽 p ro 序列融合于抑肽酶的 N 端 ,并在其间插入胰蛋白酶 识别位点. 该 融 合 蛋 白 在 使 用 PET211C 载 体 表 达 时 ,产物以包涵体形式存在于大肠杆菌中 ,表达量占 菌体总蛋白的 30 %以上 ,证明该肽段不影响抑肽酶 的正确折叠 ,还能帮助抑肽酶包涵体进行体外折叠 ,8广 东 工 业大 学 学 报第 24卷提高复性得率 . 复性后使用胰蛋白酶切割融合蛋白 ,可得天然构象的活性抑肽酶.秦新民等 23 从 3 个豇豆品种幼嫩叶片中分离 出核基因组 DNA ,参照已知的几种 Bowm an2B irk 型胰蛋白酶抑制剂基因序列 ,设计合成了 27 bp ,且含有 B amH I位点的寡核苷酸引物 ,分别以 3种豇豆核 基因组 DNA 为 模 板 , PCR 扩 增 , 均 得 到 长 度 约 为340 bp 的 DNA 片段. 产物 DNA 片段经 DNA 序列分 析 ,结果表明三者的碱基序列相同 ,与报道的胰蛋白酶抑制剂基因相比 ,同源性为 100 %和 9917 %.吕 玲 玲 等 24 通 过 根 癌 农 杆 菌 A grobac te rirm tiunefac ie rc s介导 ,将豇豆胰蛋白酶抑制剂 ( Cp T I)基因导入花椰菜无菌苗的下胚轴和子叶中 ,卡那霉素( Kan)的筛选质量浓度为 15 m g /L ,抑制农杆菌生 长的抗生素选用梭节青霉素 ( ca rbenc illin ) ,质量浓度为 500 m g /L. 对所获得的转基因植株进行 PCR 扩增 ,结果显示大多数为阳性 ; PCR 2Sou the rn 及 Sou th2e rn分子检测分析 ,结果证明 Cp T I基因已被整合到 花椰菜植株的基因组中. 转基因植株叶片的离体饲 虫初步试验结果表明 ,对鳞翅目害虫菜青虫的生长 发育有一定的抑制作用 .谢明 等 25 利 用 水 稻 偏 爱 密 码 子 设 计 引 物 , 经PCR 扩 增 , 从 我 国 水 稻 ( O ryza sa tiva ) 品 种“中 花 8号 ”中克隆到一个长 408 bp 的基因 . 序列测定和分 析表明 ,克隆到的是一个未见报道的新的水稻蛋白酶抑制剂基因 ,该基因编码了一个由 133 个氨基酸 组成 、具有重复双功能结构域和以抑制胰蛋白酶为 主的活性中心的包曼 2伯克 (Bowm an2B irk)型蛋白酶抑制剂 ,该基因推导的氨基酸序列与大麦 、小麦 、豆类等的某些蛋白酶抑制剂的氨基酸序列具有较高的 同源性 ,与该家族的水稻的一种胰蛋白酶抑制剂氨基酸全序列同源性高达 75 %.任启生等 26 通过化学合成和 PCR 结合法合成 了 ET I基因 ,经过序列分析后将其克隆到大肠杆菌表达载体质粒 p ET32 a中 ,并在大肠杆菌中进行诱导表达. 表达蛋白相对分子质量同理论值一致 ,生物活 性检测表明复性后的 ET I对胰蛋白酶及瑞替普酶具有特异抑制作用.凌敏华等 27 用 PCR 方法扩增一 特 异探 针 , 结 合传统的筛库方法 ,从天花粉 cDNA 基因库中筛选到含 TT I基 因的 克隆 , 经 序 列 测 定 , 得 到 了 TT I的cDNA 全序列 . 其读框编码区编码的是一个由 65 个 氨基酸组 成的 P re2P ro2TT I, P re 与 P ro 分 别含 有 24个和 14个氨基酸 . 由 cDNA 序列推论的氨基酸序列和已测定的氨基酸序列完全相同.应用基因工程技术可以对胰蛋白酶抑制剂的结 构和功能关系进行研究 ,这可能成为基于蛋白质空间结构合理设计药物的基础 ,有助于开展结构生物学的方法学研究 .3 胰蛋白酶抑制剂应用于治疗疾病抑肽酶 ( Ap ro tin in ) 是 一 类 丝 氨 酸 蛋 白 酶 抑 制 剂 ,其主要作用是 : 1 )抑制循环中纤溶酶 ,能显著减 少术后出血 ; 2 ) 阻止血小板激活 , 保护糖蛋白 b / a受体及止血功能 ; 3 ) 抑制中性白细胞激活和脱 颗粒 ,具有 抗炎 作 用 , 能 减 轻全 身炎 症 反应 综合 征( S IR S) ; 4 )抑制激肽释放酶的激肽形成和血管活性 效应 ,防止缺血再灌注损伤 ; 5 ) 减少补体激活 ,抑制C3 a和 C5 a 产生. 这些药理学的作用使它不仅广泛 用于体外循环 ( CPB ) 心脏手术 ,而且在非心脏手术中也得到广泛应用 .3. 1 在体外循环心脏手术中的应用术中及术后出血是体外循环手术中一个重要并 发症 ,长时间体外循环是导致心脏直视手术后渗血过多或出血的主要原因 . 抑肽酶是一种丝氨酸蛋白抑制剂 ,它能有效地抑制体外循环所致机体产生的 “炎性反应 ”, 抑制多种蛋白酶包括胰蛋白酶 、纤溶酶 、血管舒 缓素 , 激 肽及 补 体 系 统 28 230 . 同 时 , 它 能保护血小板免受激活损耗和血小板的黏附及聚集功 能 . 抑肽酶也是一种强有力的纤溶抑制剂 ,可防止纤溶激活 ,与保护血小板的作用相辅相成 ,在维护体外 循环期间正常的凝血机制起到重要的作用. 抑肽酶在心脏手术中的作用有 31 234 : 1 )抑制纤溶系统及保护血小板功能 ,可减少术后出血及库血用量 ,减少出 血和输血所引发的一系列并发症 . 2 ) 心脏直视手术致肺损伤 ,与血小板及中性粒细胞在肺内聚集 ,内皮 素 、血栓素等在其病理过程中起关键作用. 抑肽酶能通过干预这些因素 , 而达到保护肺功能的 目的 . 3 )保护心肌作用 . 4 )减少体外循环心脏直视手术所致 的机体炎性反应 .3. 2 治疗急性胰腺炎胰腺是个含有各种消化酶的重要消化器官 ,胰 腺所产生的消化酶 ,绝大多数是无活性的酶原或酶前体物质 ,这些物质被激活后才能发挥消化作用 ,胰蛋白酶是由胰腺产生的 ,它是重要的蛋白消化酶 ,一 般是被肠激酶所激活而产生消化和损害作用 . 酶被 激活和外溢可对组织产生消化和损害作用. 抑肽酶能明显地抑制激肽原的激活从而抑制蛋白酶 、纤维第 3期谭竹钧 ,等 : 胰蛋白酶抑制剂的研究进展9蛋白溶酶等作用 ,消除对组织的消化和损害作用 ,控制胰腺炎的进展 , 缓解临床症状. 刘寒 35 应用抑肽 酶制剂治疗急性水肿性胰腺炎 12 例 ,应用甲磺酸加贝酯 300 m g / d加入补液中 ,缓慢静滴 ,至病情改善时停药 ,结论为早期应用抑肽酶制剂对治疗急性胰 腺炎有效 ,其机制为抑肽酶可以抑制胰蛋白酶的合 成及胰腺的外分泌功能 . 申方等 36 应用尿蛋白酶抑制剂 (U T I)与善宁治疗 40 例急性重症胰腺炎 ,两组 疗效虽无明显差异 ,但乌司他丁组无 1例死亡 ,善宁组有 3 例死于多脏器功能障碍综合征. 这可能与乌司他丁能够有效稳定溶酶体膜 、清除氧自由基 、抑制 炎性递质的释放 ,并进而抑制全身炎性反应综合征的发生有关 .3. 3 在脑外科中的应用抑肽酶可以用于脑出血 、脑水肿 、脑肿瘤等的治 疗 . 李滨滨等 37 报 道 , 对 60 例 脑 肿 瘤 患 者 随 机 分组 ,每组 30例 . 试验组术前 12 h至术后 24 h内连续给药 ,抑肽酶剂量为 7 103 k IU / kg, 加入复方氯化 钠注射液中静滴 ,对照组单用等容量的复方氯化钠注射液. 结果 ,试验组出血和脑水肿明显减轻. 两组比较 , 手 术 出 血 量 和 脑 水 肿 均 有 明 显 差 异 ( P 0105 ) . 结论认为 ,围术期应用抑肽酶可明显减少脑 肿瘤手术出血及脑水肿 ,有较好的止血作用 . 孟令秋等 38 应用抑肽酶辅助治疗脑出血 、脑水肿 21 例 ,治 疗前后进行神经功能评分 ,测量水肿体积. 结果 ,入院后 1、2、3 周抑肽酶组神经功能评分高于对照组 ,水肿产生量少于对照组 . 王艳梅等 39 应用抑肽酶治 疗脑出血 、脑水肿 ,也取得较好的疗效. 结论为脑出血急性期加用抑肽酶 ,可以抑制脑水肿的形成 ,提高 脑出血患者神经评分 .参考文献 : 1 SYLV IE R , B ER T IL K. 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