QIAGEN中提DNA中文操作手册.docx

质粒DNA中提方法（QIAfilter midi kit 25）适用于100 微克的高质粒或粘粒 DNA，使用 QIAfilter注射器样元件代替常规离心法以清除细菌裂解物。低拷贝质粒，加入氯霉素放大后应视为高拷贝。为质粒选择适当的培养体系。在开始之前的注意事项如果是低拷贝，最好增加裂解buffer的用量，以提高裂解效率，裂解缓冲卷，从而 增加DNA 产量。可选： 删除样品的步骤用符号表示为监测分析凝胶 （见第 34 页） 的过程。加入buffer P3后，样品不再需要冰浴。在开始之前做的东西把提供的RNase A 添加到buffer P1 中。一瓶RNase A (使用之前简要地离心）加入一瓶buffer P1 ，终浓度为 100 ug/ml。检查buffer P2 是否由于低温存储产生SDS沉淀。如有必要， 37 C下使SDS溶解。.在 4 C预冷buffer P3。可选：使用前将提供的 LyseBlue 试剂添加到buffer P1 混合。每个buffer P1 瓶加入一小瓶 LyseBlue （在使用之前简要离心）， 达到 1: 1000 稀释。LyseBlue 可以提供视觉识别从而防止常见处理错误，如细胞裂解导致效率低下和不完全沉淀的 SDS、 基因组 DNA污染、 细胞碎片等。过程1. 摇菌：新鲜划线的选择性平板（接种含有适当的选择性抗生素）挑一个单菌落放入2-5 ml LB 培养基中。在 37 C 摇菌约8 h （约 300 rpm）。 使用4倍体系容积的试管或锥形瓶。2. 稀释选择性 LB 培养基 1/500 -1/1000。若为高拷贝质粒，接种到25 毫升或 100 毫升的介质具有 2550 l 或 100 200 l 起始培养液。若为低拷贝质粒，接种 50 100 毫升或 250 毫升的介质具有 100 200 l 或 250-500 l 起始培养基。在 37 C 摇晃 12 16 h（约 300 rpm）。 使用烧瓶或其他容器至少 4 倍于培养液体系。培养液细菌密度应该达到约 3-4 x 109 个/毫升3. 收获细菌：6000 x g、 4 C离心 15 分钟。弃上清4. 加入 4 毫升或 10 毫升buffer P1。 为保证高效裂解，重要的是要使用是足够大，以允许完全混合裂解缓冲的容器。确保RNArase A 已被添加到buffer P1。如果 LyseBlue 试剂已添加到buffer P1，使用之前大力摇晃buffer，以确保 LyseBlue 粒子完全悬浮。细菌向上和向下翻转直到没有细菌块凝结。5. 添加 4 毫升 或 10 毫升buffer P2，通过大力翻转反应管管 4 6 次，彻底混合，在室温 （15-25 C）反应 5min。不要剧烈震荡，这将导致基因组DNA的污染。裂解物出现粘性。不允许裂解反应持续超过 5 分钟。在使用后，buffer P2 的瓶子应立即关闭以避免空气中CO2中和NaOH。如果 LyseBlue 已添加到buffer P1 ，buffer P2 加入后将会变成蓝色细胞悬浮液。翻转后应为蓝色均匀悬浮。如果无色区域或褐色细胞块是仍然可见，继续翻转直至达到均匀蓝色。在反应时间准备 QIAfilter Cartridge（桶管）：将盖子拧到QIAfilter Cartridge喷嘴上。将 QIAfilter Cartridge放在一个方便的架子上。6. 添加 4 毫升或 10 毫升冷buffer P3，立即通过翻转倒置4 6次彻底地混合直接转到步骤 7。不做冰浴（与标准中提不同）。冰冻的buffer P3增强反应效率。buffer P3使蓬松的白色裂解产物变得不那么粘。沉淀的材料包含基因组 DNA、 蛋白质、 细胞碎片和 KDS。裂解物应彻底混合确保钾十二烷基硫酸盐沉淀。如果混合物仍会出现粘稠，需要更多翻转混合。如果已使用了 LyseBlue 试剂，混合直到所有蓝色的痕迹都消失。7. 反应物全部倒入QIAfilter Cartridge。在室温下 (15-25 C) 静置10 分钟。不要插入柱塞! 重要： 这 10 分钟孵化在室温是必不可少的。含蛋白质、 基因组 DNA 和洗涤剂沉淀将浮于上层。这可确保过滤时无堵塞。如果 10 分钟后沉淀没有漂浮到顶部，仔细用无菌吸管头吸取下面的沉淀。8. 竖直放置 QIAGEN-tip 100 或 QIAGEN-tip 500，加入 4 毫升或 10 毫升 QBT buffer，使其自由流空。 9. 移除QIAfilter Cartridge喷嘴处的盖子。轻轻地插入柱塞到 QIAfilter Midi 或 QIAfilter Maxi Cartridge，挤出裂解产物到。直到所有的裂解产物的通过 QIAfilter Cartridge，不要用太大的力量。大约可以得到 10 毫升和 25 毫升的裂解产物。取240 l或120 l裂解物为并保存分析凝胶（示例 1）确定增长和裂解条件是否最优。10. 让裂解产物自由流下QIAGEN-tip取240 l或120 l流出的液体取样和保存为分析凝胶 （示例 2） 以确定DNA绑定到QIAGEN树脂的效率。11. 加入QIAGEN-tip 2 x 10 毫升或 2 x 30 毫升的buffer QC（洗两次）。 第一次洗足以将所有的污染物和大部分的质粒 DNA洗下。第二次要洗的东西是实验过程中产生的大量碳水化合物。删除400 l或240 l联合的洗分数从取样和分析凝胶 （示例 3） 保存。12. 洗脱 DNA：加入 5 毫升或 15毫升buffer QF。 收集管（未提供）可以使用15ml或 50ml离心管。不推荐使用聚碳酸酯离心管。注意： 为DNA长度大于 45 50 kb，预热洗脱缓冲液至 65 C 可能有助于增加产量。取100 l或60 l样品的做分析凝胶 （示例 4） 并保存。13. 通过添加 3.5 毫升或 10.5 毫升（0.7体积） 室温的异丙醇的沉淀 DNA 。混合并立即在15,000 x g、4 C离心30min。弃上清。 样品在室温下以尽量减少盐沉淀。异丙醇松散地附加到管的一侧，去除上清液时应谨慎。14. 洗 DNA 颗粒：加入 2 毫升或 5 毫升室温 70%的乙醇，在 15,000 x g 离心10分钟，不干扰颗粒的前提下倒上清。 70%的乙醇可以移除沉淀中的盐和置换出异丙醇，使 DNA 更容易再溶解。15. 风干颗粒 510 分钟，用适当体积的buffer（一般用200ul的去离子水）再溶解DNA（例如，TE buffer，pH 8.0 或 10 mM TrisCl，pH 8.5）。 琼脂糖凝胶分析我们建议在纯化过程中取样和保存 (样品 1 4)。如果质粒 DNA 的产量低或质量差，可以分析的琼脂糖凝胶电泳来确定在哪一阶段的分离纯化过程发生问题。琼脂糖凝胶的分离纯化过程的分析DNA 产量和质量的琼脂糖凝胶电泳，可以很容易分析。低产量和质量可以由若干不同的因素造成。要确定在该过程的哪一阶段出现问题，请从的分离纯化过程中提取样品 (见下文和表 4)，进行琼脂糖凝胶电泳分析。图 3 的质粒纯化过程的琼脂糖凝胶分析。琼脂糖凝胶分析L : 正常的裂解液含有超螺旋和开放的圆形质粒 DNA 和 退化RNA （示例 1） 。F ：质粒 DNA被绑定到 QIAGEN-tip 树脂，过滤液只包含退化的 RNA（示例 2）。W1 ： 第一次洗，不会影响DNA，白色阴影为剩余的退化RNA （示例 3）。 W2 ： 第二次洗，可确保完全清除 RNA 和其他污染物（示例 3）。E ： 不包含任何其他污染物的纯质粒 DNA 的体系 (示例 4)。M ： DNA maker1 5泳道说明了一些可能会在准备工作产生的不正常的结果。1 : 超螺旋 （下部带） 和开环结构 (上部带)。这种形式可能由于buffer p2 长期裂解菌体产生的DNA组污染。2 ： 一些宿主菌株上的类病毒形式的超螺旋质粒 DNA （pTZ19），不要误认为是基因组 DNA。类病毒质粒 DNA 很容易与基因组 DNA 由简单限制消化区分： 线性化质粒样品显示类病毒条带将产生单个定义的条带表示线性化质粒单体 （见 3）。3 ： 用EcoRI限制消化与后的线性化形式的质粒 pTZ19.4 ： 包含细菌的染色体 DNA，可能受污