肝脏谷丙转氨酶活力测定 - 河北科技大学大.doc

实验教学教案首页本次实验项目：肝脏谷丙转氨酶活力测定本次实验课时：验证性4学时教学要求： 1掌握实验原理，了解转氨酶的性质及临床意义 2. 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法重 点：实验原理、转氨酶的转氨基作用。 教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。讲授内容及时间分配：课堂讲授1相关知识 0.1 学时2实验目的 0.1 学时3实验原理 0.3 学时4实验操作 0.2 学时实验教学肝脏谷丙转氨酶活力测定实验的操作技术 3 学时参考资料生物化学实验肝脏谷丙转氨酶活力测定（验证性）相关知识酶的提纯基本操作程序及基本原则酶的活力单位（IU）的定义及酶活力的测定（酶的定量测定）测定酶活力一般经如下几个步骤选择适宜的一定浓度的底物。确定酶促反应的条件。优化条件将一定量的酶液和底物溶液混合，确定反应时间（因要测定酶促反应初速度） 。反应到一定时间后取出反应液终止反应。测定产物的生成量。计算酶活力、酶的比活力。酶的比活力表示酶纯度的指标n 每单位酶蛋白所含的活力单位数。 对固体酶：比活力活力单位/mg酶蛋白 对液体酶：比活力活力单位/ml酶液n 比活力越大，酶的活力越大，含酶量或有活性的酶量越多。总活力、纯化倍数和回收率酶活力测定方法不同酶选用不同的方法氨基酸转氨基作用、联合脱氨基作用谷丙转氨酶及临床意义: 查肝功为什么要抽血化验转氨酶指数呢？谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST，GOT）是人体内糖和蛋白质互相转变所需的酶，人再生体内分布广泛。ALT的分布以肝中最高，主要存在于肝细胞浆中，AST存在于肝细胞浆和线粒体内。其次是肾、心、骨骼肌、脾等。AST的分布则以心肌最高，其次为肝、骨骼肌、肾脏等。谷丙转氨酶为细胞内酶，血清中活性很低，各组织器官中以心和肝的活性最高。当某种原因使细胞膜通过性，转氨酶可大量释放入血液，血清中转氨酶活性。抽血化验若转氨酶比正常水平偏高则有可能肝组织受损破裂，肝细胞的转氨酶进入血液。（结合乙肝抗原等指标进一步确定是什么原因引起的）常作为疾病诊断、观察疗效和预后的指标： 急性肝炎：S-GPT、S-GOT 心肌梗塞：S-GOT一、实验目的了解转氨酶的性质及临床意义掌握谷丙转氨酶活力的测定方法二、实验原理联合脱氨基作用是大多数氨基酸的主要代谢方式，通过转氨基作用与谷氨酸氧化脱氨基作用偶联而完成。丙氨酸及酮戊二酸为谷丙转氨酶的作用底物，利用内源性（肝细胞已有的）磷酸吡哆醛作辅酶，在一定条件下及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定酶活力。丙酮酸能与2,4二硝基苯肼结合，生成丙酸2,4二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收光谱的峰为439530nm，可用于测定丙酮酸的含量。酮戊二酸也能与2,4二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱为与丙酸2,4二硝基苯腙的吸光度有差别，在520nm波长比色时，丙酮酸2,4二硝基苯腙吸光度高出3倍。在520nm处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与酮戊二酸的摩尔比基本上呈线性关系，故可以测定谷丙转氨酶的活力。谷丙转氨酶（简称GPT、ALT,在血清中的正常值是5(0)40U/L以内）催化反应：丙氨酸 + -酮戊二酸丙酮酸 谷氨酸丙氨酸GTP丙酮酸CH3CH3三、实验器材、试剂、材料(一)材料新鲜猪肝脏（二）器材722型分光光度计、剪刀、吸管、玻璃均浆器（三）试剂标准丙酮酸溶液（ml相当于500ug）；准确称取纯化丙酮酸钠62.5mg，溶于100ml 0.5mol/LH2SO4中，临用前配制。谷丙转氨酶底物；称取L-丙氨酸0.90g及-酮戊二酸29.2mg，先溶于pH7.4 0.1mol/L磷酸缓冲液中，然后用mol/LNaOH调至pH7.4，再用pH7.4 0.1mol/L磷酸缓冲液稀释至100ml，贮藏于冰箱内，可保存一周。0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）；称取13.97g K2HPO4和2.69g KH2PO4溶于1000ml蒸馏水中。0.02%2,4二硝基苯肼；称取2,4二硝基苯肼20mg溶于少量mol/L HCl中，加热溶解后，用mol/L HCl稀释到100ml。0.4mol/LNaOH溶液 生理盐水四、实验操作步聚准备工作：打开水浴锅恒温37度；722E型分光光度计通电预热。1.肝匀浆制备（每四组做1份，共用）将鸡肝脏用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.25g，剪成小块，置于玻璃匀浆管内（或小研砵中），加入2.25ml预冷的pH7.40.1%mol/L磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆。吸取肝匀浆0.1ml于另一试管中，加入预冷的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）4.9ml摇匀，为稀释肝匀浆（稀释50倍）。2. 谷丙转氨酶活力测定（每组做1份）取试管4支按下表加液测定管标准管对照管空白管谷丙转氨酶底物/ml0.50.5-混匀后，37水浴准确保温5分钟稀释肝匀浆/ml0.1-0.1-标准丙酮酸-0.1-水-0.1混匀后，37水浴准确保温30分钟2,4二硝基苯肼/ml0.50.50.50.5谷丙转氨酶底物/ml-0.50.5混匀后，37水浴准确保温30分钟0.4mol/LNaOH5.05.05.05.0静止10分钟A520谷丙转氨酶活力单位：规定酶在37与底物作用30min后，能产生2.5ug的丙酮酸为一个谷丙转氨酶活力单位。五、实验结果与讨论1. 谷丙转氨酶活力计算基础：规定酶在37与底物作用30min后，能产生2.5ug的丙酮酸者为一个谷丙转氨酶活力单位。2. 测定管对照管的吸光度值，与标准管相比算出其相当于丙酮酸含量。3. 根据公式计算：（注意稀释倍数，理解公式）每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位：每克肝脏谷丙氨酶的活力单位。4计算出比活力比活力活力单位/ml酶液六、注意事项分析（列表）各管与计算实验结果（OD值）相关的物质成