尼曼-匹克病B型的产前诊断.doc

尼曼-匹克病B型的产前诊断中华儿科杂志 1998年第5期第36卷 论著作者：张为民郭玉凤施惠平高淑英赵时敏孙念怙单位：100005 北京，中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院医学遗传室(张为民、郭玉凤、施惠平)；北京市计划生育技术指导所(高淑英)；中国协和医科大学北京协和医院(赵时敏、孙念怙)关键词：尼曼-皮克病；诊断；鞘磷脂磷酸二酯酶【摘要】目的对尼曼-匹克病B型进行产前诊断。方法应用成色底物2-己癸酰氨基-4-硝基苯磷酸胆碱，对4例尼曼-匹克病B型先证者及其父母进行了外周血白细胞中鞘磷脂酶的酶学分析,并对这4例先证者再妊娠的母亲进行了绒毛、羊水细胞中的酶学分析。结果先证者均有明显的鞘磷脂酶的缺乏,而父母的酶水平与正常有重叠。对2例先证者母亲孕早期绒毛、孕中期羊水进行酶学分析,结果与正常个体差异均无显著意义,另外2例仅于孕中期作了羊水细胞中的酶学分析,结果亦正常。随访4名先证者母亲所生新生儿表型正常。结论绒毛和羊水细胞中鞘磷脂酶分析可用于尼曼-匹克病的产前诊断。Prenatal diagnosis of type B Niemann-Pick diseaseZhang Weimin, Guo Yufeng, Shi Huiping, et al.Department of Medical Genetics, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100005【Abstract 】ObjectiveTo evaluate an enzymatic method for postnatal and prenatal diagnosis of type B Niemann-Pick disease (NPD).MethodsColorimetric substrate 2-hexadecanoylamino-4-nitrophenylphosphocholine (HNP) was used to measure acid sphingomyelinase (ASM) in peripheral leukocytes from 4 cases of type B NPD and their parents. The method was also used for chorionic villus samples and cultured amniocytes for prenatal diagnosis. ResultsThe activity of ASM in leukocytes of probands was all markedly deficient, but the activity of ASM of the parents had an overlap between the normal range. Prenatal diagnosis in 4 pregnancies at risk of type B NPD showed that 2 cases were diagnosed in the first trimester by using chorionic villus samples and also in the second trimester by cultured amniocytes and the ASM activities were within the nomal range. Another 2 cases were diagnosed only in the second trimester by cultured amniocytes and the results were also normal. All infants developed normally after &127;birth. ConclusionThe measurement of ASM in chorionic villus samples and cultured amniocytes may provide a reliable approach to prenatal diagnosis of NPD. 【Key words 】【Key words 】Niemann-pick diseaseDiagnosisSphingomyelin phosphodiesterase尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease,NPD)B型是由于酸性鞘磷脂酶缺乏所致的溶酶体贮积症,为常染色体隐性遗传病。B型常在儿童期因肝脾大而获诊断,大部分B型患者无神经系受累,并能存活至成年。骨髓检查可见大的泡沫样细胞,亦称Niemann-Pick细胞,是由于鞘磷脂及其他脂质沉积于单核巨噬细胞中所致。此病目前尚无有效的治疗方法,可通过酶活性测定进行病例诊断及产前诊断,从而达到优生的目的1。通过检测患者白细胞中鞘磷脂酶含量可以提供准确的生化指标。我们应用成色底物2-己癸酰氨基-4-硝基苯磷酸胆碱(2-hexadecanoylamino-4-nitrophenyl phosphocholine, HNP)建立了正常人群白细胞中该酶的活性检测手段,并对4例NPD B型患儿家系进行酶学分析,在此基础上,对4例高危孕妇再次妊娠时成功地进行了产前诊断。对象和方法一、对象1.先证者:4例NPD B型患儿,男2例,女2例,年龄17岁,均有肝脾肿大,无神经系统受累,骨髓检查可见泡沫样细胞。2.高危孕妇:4名,为4例先证者之母,均再次妊娠。二、材料1.试剂:底物:HNP，牛磺胆酸钠(Taurocholic acid T-4009),标准物：2-hydroxy-5-nitrohexadecananilide(HN),均为Sigma产品。2.白细胞的提取:抽取患者及父母新鲜抗凝血各5毫升,用右旋糖苷提取白细胞,-70保存备用2。3.羊水细胞和绒毛的提取:在两例高危孕妇孕早期10周取绒毛,又在孕中期20周取羊水;另两例高危孕妇仅于孕中期取羊水。绒毛标本在实验室中先经过认真挑选,去除非绒毛组织,可直接测酶活性或保存于-70备用。羊水抽取后接种于F10培养基中,羊水细胞经过大量增殖后,收获,-70保存备用3。4.酶反应体系:(1)底物工作浓度:将24 mmol/L HNP溶于pH 5.3的0.1 mol/L醋酸钠/0.1mol/L醋酸缓冲液中(每次使用时新鲜配制)。(2)标准设置:将0.1mol/L甘氨酸溶于0.1mol/L氢氧化钠中,调pH至10.4,用前将甘氨酸/氢氧化钠缓冲液与96%乙醇以12混合后即为制成甘氨酸-乙醇(Gly-EtOH)中止液。将标准物HN 1mmol/L溶于Gly-EtOH中止液中。白细胞标准:30 l HN标准液与570 l Gly/EtOH混合。绒毛、羊水细胞标准:30 l HN标准液与690 l Gly/EtOH混合。以Gly/EtOH为空白管,430 nm下测光密度A值(曾称吸光度OD值)。三、标本测定常规将白细胞、绒毛和羊水细胞超声粉碎成匀浆。在冰浴中先取匀浆480 l与1.5%牛磺胆酸钠240 l混合后,置冰浴中15分钟后,再取此混合匀浆150 l与150 l底物混合,空白管150 l水与150 l底物混合,37水浴中保温,反应结束后加300 l中止液,4下离心10 000 r/min,5分钟,于430 nm下测A值。白细胞反应时间为17小时,绒毛、羊水细胞反应时间为3小时。结果一、先证者白细胞中鞘磷脂酶活性值(表1)从表1中可见先证者鞘磷脂酶活性明显缺乏,父母的酶活性水平与正常人有重叠。二、高危孕妇的绒毛和羊水细胞中鞘磷脂酶活性值(表2)从表2中可以看出，测例1、例2高危孕妇孕早期绒毛鞘磷脂酶活性,结果与无关个体正常对照无明显差异,说明无此酶缺乏,继续妊娠,于孕中期取羊水,羊水细胞中酶活性亦正常,与早期检测结果相符。另两例高危孕妇仅作了孕中期羊水细胞中酶活性检测,结果也正常。4例高危孕妇所生新生儿出生后表型正常,其中两例经脐带血检测符合产前诊断结果。表1NPD B型先证者及其父母白细胞中鞘磷脂酶活性nmol*(17h)-1*mg-1*例次酶活性患儿父母正常对照18.137.020.053.8213.163.029.3101.7319.0102.948.040.2414.630.224.842.0注：*mg为每毫克蛋白；白细胞中鞘磷脂酶正常范围为40.2101.7表2高危孕妇绒毛及羊水细胞中鞘磷脂酶活性(nmol*h-1*mg-1*)例次绒毛羊水细胞孕妇正常对照孕妇正常对照155.022.736.432.7227.231.844.631.0325.829.9441.342.7注：*mg为每毫克蛋白；绒毛中鞘磷脂酶正常范围为22.431.8；羊水细胞中鞘磷脂酶正常范围29.943.7讨论NPD是溶酶体贮积症的一种,它分为A、B、C、D、E 5型,在临床上我们仅见到NPD B型患者,A、B两型均为酸性鞘磷脂酶缺乏,C、D、E型是酶不缺乏或少量缺乏,骨髓检查均可见泡沫样细胞。仅靠酶学分析很难区分A型与B型,因为在酶学检查时,虽然B型残余酶活性比A型高,但两者之间仍有重叠。而临床上A,B两型有着非常清晰的区别4。本研究中4例先证者均作骨髓检查可见泡沫样细胞,且无神经系统症状,结合鞘磷脂酶缺乏,从而确诊为NPD B型。鞘磷脂酶的检查对NPD B型患者的确诊具有特异性,而骨髓检查有泡沫样细胞不仅在NPD中可见,GM1-神经节苷脂贮积症等脂类代谢异常的疾病亦可见,故酶学分析才能作出准确诊断。在检测NPD B型先证者时,从检测结果可以看出此型患者白细胞中残余酶活性较高,可高达正常低限的50%左右,而父母杂合水平与无关正常个体有重叠。若要检出杂合子需进行基因分析1。通过两例孕中期羊水细胞中酶活性结果与孕早期绒毛中酶活性结果的一致性,说明NPD B型的产前诊断于孕早期取绒毛直接进行鞘磷脂酶活性检测即可得出准确结论5。应用HNP底物检测鞘磷脂酶与同位素标记底物有着很大的差异,HNP底物为成色底物,它与不同酶源反应时,所需反应时间不同,用白细胞作为酶源时,保温时间要延伸到17小时,才能得到足够的成色产物,而以绒毛、经培养的羊水细胞作为酶源时，保温3小时即可得到足够的成色产物。由于NPD B型目前尚无有效的治疗手段,准确的产前诊断是防止患儿出生的唯一途径,从而达到优生的目的。参考文献1Schuchman EH,Desnick RJ. Niemann-Pick disease types A &127;and B: acid sphingomyelinase deficiencies. In:&127; Scrive CR, Beaudet AL, Sly WS, eds. The metabolic basis of inherited disease. 7th ed. New York: McGraw-Hill, 1995. 2601-2639.2施惠平,袁丽芳,张桂香,等. 遗传性鞘脂代谢病的实验诊断. 中国医学科学院学报,1984,6:446-448.3施惠平,刘春芸,袁丽芳,等. 遗传性鞘脂代谢病的产前诊断. 中国医学科学院学报,1984,6:449-450.4Vanier MT, Rousson R, Garcia I, et al. Biochemical studies in Niemann-Pick disease. III.In vitro and in vivo &127;assays of sphingomyelin degradation in cultured skin fibroblasts and amniotic fluid cells for the diagnosis o