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一 C值悖论物种的C值与其进化复杂性之间无严格对应关系 C值的资料表明，在不同的门中C值的变化是很大的。相对比较简单的单细胞真核生物象啤酒酵母，其基因组就有1.75107bp大约是细菌基因组的3-4倍。最简单的多细胞生物秀丽隐杆线虫其基因组有8107bp，大约是酵母的4倍。看来生物的复杂性和其DNA含量之间有较好的相关性。但我们可看到在其它的一些门中，这种相关性有的并不现在。实际上一个门中的C值变化并没有一定的规律。例如在哺乳类、鸟类和爬行类的C值变化范围都很小，而在两栖类中这种变化范围增大，而植物的C值变化范围更为宽广，常成倍成倍地增加。C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象称为C值悖论(C-value paradox)。现在我们还不能完全解释这种矛盾。在一定意义上说，生物类群中C值变化范围宽就意味着在某些生物中有些DNA是冗余的，不能编码有功能的活性物质。DNA总量变化范围的产生至少有一个原因，即在染色体上存在着不同数目的重复序列，这些重复序列是不表达的。 第一，生物体的高等还是低等并不能光光从染色体的多少或者DNA的多少来衡量，而应该看他们的有用基因的数量。因为染色体中很多内含子、junkDNA和重复序列在目前的研究看来对生物的性状是不必要的。 第二，从哲学的角度，生物并不能被分为高等和低等，这种划分是人为的划分，但在自然选择的角度下来看，所有地球上的生物都是平等的，没有高低等之分。 C值矛盾的产生一个基因组中的DNA含量用C值表示，C值的大小并不能完全说明生物进化的程度和遗传复杂性的高低。也在计算C值时是根据所有的表达产物来估计的。比如有1000种蛋白质产物就意味着会有大约1000种mRNA，就是1000个基因，而实际上还有非编码的，所以少估计了。 高等生物具有比低等生物更复杂的生命活动，所以，理论上应该是它们的C值也应该更高。但是事实上C值没有体现出与物种进化程度相关的趋势。高等生物的C值不一定就意味着它的C值高于比它低等的生物。这种生物学上的DNA总量的比较和矛盾，称为C值悖论。 C值与进化物种的C值与其进化复杂性之间无严格对应关系。C值的资料表明，在 不同的门中C值的变化是很大的。相对比较简单的单细胞真核生物象啤酒酵母，其基因组就有1.75107bp大约是细菌基因组的3-4倍。最简单的多细胞生物秀丽隐杆线虫其基因组有8107bp，大约是酵母的4倍。看来生物的复杂性和其DNA含量之间有较好的相关性。但我们可看到在其它的一些门中，这种相关性有的并不现在。实际上一个门中的C值变化并没有一定的规律。例如在哺乳类、鸟类和爬行类的C值变化范围都很小，而在两栖类中这种变化范围增大，而植物的C值变化范围更为宽广，常成倍成倍地增加。C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象称为C值悖论(C-valueparadox)。现在我们还不能完全解释这种矛盾。在一定意义上说，生物类群中C值变化范围宽就意味着在某些生物中有些DNA是冗余的，不能编码有功能的活性物质。DNA总量变化范围的产生至少有一个原因，即在染色体上存在着不同数目的重复序列，这些重复序列是不表达的。 C值与基因组结构基因组大小、基因数目与生物复杂度的关系也是科学家们关注的一个重要问题。基因组大小也称为C值，是指生物体的单倍体基因组所含DNA总量。从原核生物到真核生物，C值变化很大。但是基因组及其生物的复杂度与C值之间并不一定线性相关，如变形虫的C值是人的200倍。这就是所谓的C值悖论。这种差异主要来源于非编码序列的多少。目前对为什么有的基因组非编码序列多，有的则很少还没有明确的解释。有人怀疑非编码序列与基因组的可塑性有关。与此相关的一个问题是基因数目与生物体的复杂性是否有关?这个问题引起了对G(gene)值的讨论。现在已经发现，一些生活史相似的近缘物种基因数不同。例如，支原体病菌中的Mycoplasmapneumonia的基因组中包括的基因数比Mgenitalium的多50%。此外，基因数与生物体的复杂性也没有明显的相关性。例如，拟南芥和果蝇各自的基因数是25，000和14，000，前者编码的基因数是后者的近两倍，但从生物体的复杂性上看，并不能说拟南芥的复杂度是果蝇的两倍。这种现象就称为G值悖论。近来对植物和动物基因的研究提示，动物可能多用选择性剪切来增加复杂度，而植物则似乎是以基因数目来增加复杂度。但C值和G值悖论还远未解开，还有待于更多基因组进化的数据。 在基因组结构进化的探讨中，基因，特别是基因组重复也是人们关注的一个重要话题。现在认为，基因和基因组重复是生物进化和复杂性增加的重要原材料。Ohno提出脊椎动物的基因组可能经历了两轮重复。目前有许多研究者在进行基因组是否重复、重复以后如何进化等问题的研究，未来一些年中也将会是一个热门的研究课题。 基因组时代的到来，也极大地改变了许多传统进化生物学研究领域的面貌。例如人们将有机会彻底检验关于生物进化的中性进化论和选择论的激烈争论。中性进化论认为，大多数的变异是中性的。最近一项对果蝇基因组变异模式的研究表明，基因组中绝大部分的变异只能用选择理论解释。更多的研究提示，达尔文意义上的正选择是普遍存在的。相信未来几年中针对各种进化力量对基因和基因组的作用的分析仍然会是一个热门的进化生物学研究方向，并有望结束中性进化论在分子水平的统治地位。 构建生物系统发育的进化树也是进化生物学中的一个传统课题。但离重建整个生命之树的目标还很遥远。现在人们提出了雄心勃勃的计划，希望利用整个基因组的数据来重构生物的系统发育，并提出了系统发育基因组学(Phvlogenom七s)这一概念。随着基因组测序技术的不断改进和成本的不断降低，相信人们将有希望彻底解决生物界的系统发育问题。 一、基因序列和非基因序列基因序列：以起始密码子开始，终止密码子结束的一段DNA序列，称为开放阅读框（openreadingframe，ORF） 非基因序列：基因序列以外的DNA序列。 编码序列和非编码序 编码序列：编码RNA和蛋白质的DNA序列。 非编码序：内含子和基因的间隔序列。 单一序列和重复序列 单一序列：基因组中只有一份的DNA序列。 重复序列：基因组中重复出现的序列。例如，STR，SNP，微卫星DNA等。 二、寻找基因的思路：功能克隆：克隆（致病）基因的一种策略。收集所要克隆的基因的蛋白质产物及其功能的信息，用以分离基因，并对基因进行定位。 定位克隆：利用遗传连锁或细胞学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带 主要方法：家系调查法、体细胞杂交法、核酸杂交技术 用遗传标记进行基因定位 形态标记morphologicalmarkers，细胞标记cytologicalmarkers，生化标记biochemicalmarkers，分子标记molecularmarkers分子遗传标记。 在核酸分子水平，对具有相对差异的等位基因DNA多态性的标记，广泛存在于 高等生物编码区和非编码区，又称为DNA分子标记，是DNA水平上遗传变异的直接反映。特点： 1、直接以DNA形式表现，在生物体各发育阶段,各组织均可检测到。 2、数量多，遍及整个基因组。 3、多态性高，自然界存在许多等位突变，无需专门创造特殊的遗传材料 4、中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁 5、许多分子标记表现为共显性（codominance）,能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息，其C值变化很大。 分子遗传标记发展restrictfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态性。以DNA酶切片段的lRFLP长度的不同，形成的多态性。 numbertandemrepeat数目可变的串联重复多态性，指重复单位相对较小，由重复单位的序列差异和数目变化，可形成丰富的多态性。包括：小卫星序列minisatellite和微卫星序列microsatellite。lSSLPsimplesequencelengthpolymorphism简单序列长度多态性，又称为VNTRvariable 小卫星DNA标记minisatellite，核心序列为1160bp，主要存在于染色体靠近端粒处，由于其拷贝数变化，在不同个体间中存在串联数目的差异，若在重复序列两侧有限制性内切酶酶切位点，则切下来的片段会呈现出多态性。可用于DNA指纹，DNAFinger。 微卫星DNA标记microsatellite，指以27个碱基为核心串联重复而成的一类序列（微卫星DNAmicrosatelliteDNA，又称为STRshorttandemrepeat短串联重复序列），由于核心序列重复数目的变化而在群体中呈现出遗传多态性，但在同一家系内具有高度的遗传保守性，以孟德尔方式遗传，散布于整个基因组中。 单核苷酸多态性，是指在基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同碱基，其中最少一种在群体中的lSNPsinglenucleotidepolymorphism频率不小于1%。SNP分为两种形式：基因编码区的SNP，称为cSNP遍布于基因组内的大量单碱基变异。可见C值的大小并不能完全说明生物进化的程度和遗传复杂性的高低。 SNP分析的特点（1）SNP数量大，分步密集，平均每1000bp就有一个SNP （2）SNP比STR扩增更有效，不会产生假带 （3）由于SNP是二态的，易于自动化批量检测，易于用计算机分析结果SNP与RFLP和STR等DNA标记的主要不同在于： 不再以“长度”的差异作为检测手段而是直接以序列的差异作为标记。但SNP单个基因座的多态性很差，只有二态，为此采用多个SNP基因座进行“单倍型”分析十分重要。 amplifiedfragmentlengthpolymorphism扩增片段长度多态性通过DNAPCR扩增基因组DNA的模板，随后用电泳将扩增片段分离，通过DNA谱带鉴别多态性。lAFLP 随机扩增多态性用于扩增多态性DNA的引物是随机的。在做多态性分析时，用一组引物（2040个）在基因组全序列上扫描可获得基因组多态性的丰富信息。 singlestrandconformationpolymorphism单链构象多态性是基于PCR扩增而新发展起来的DNA多态性分析，利用PCR特异的扩增出基因组的目的DNA片段，变性后形成的单链DNA在自然条件下能形成一定的空间构象，C值变化很大，并且这种空间构象由DNA链的碱基序列决定，若lSSCP碱基发生变化，将在电泳图谱上表现出不同生物个体的特异性，即多态性。 定位候选克隆该方法是定位克隆的进一步发展，将疾病相关基因定位于染色体相关区域，该染色体区域得到若干候选基因 进一步分析得到目的cDNA。 差异表达原理：比较不同个体或不同细胞来源，即通常所指的样本(tester，T)和参照(driver，D)的蛋白质或mRNA两者之间的差异，如缺失或特异表达部分，从而发现新基因消减杂交（subtractivehybrization）。 利用目的基因在两种组织或细胞中表达的差异，或者在不同发育阶段、不同状态下表达差异，通过其mRNA或单链cDNA进行杂交，除去两者之间相同的基因成分，使表达有差异的基因得到充分富集。它的实质是对两组基因转录本全面比较，去同存异，分离差异表达基因Subtractivecloning。 生物信息学方法通过序列的ORF预测，建立cDNA文库，差减杂交得到均质化文库。 cDNA序列测定生物信息学分析，ORF预测，同源性比较，功能预测生物信息学网页，NCBI界面，ORF预测软件：ORFFinder 读框预测实例，通过EST拼接。例如：已知小鼠某基因在人当中有高度同源序列，用该小鼠cDNA比对人的EST数据库，得到一簇EST后，将相邻的EST通过相互重叠部分进行拼接。得到人对应的完整cDNA的序列。 遗传印记一般发生在哺乳动物的配子形成期，并且是可逆的，它不是一种突变，也不是永久性的变化；它是特异性的对源于父亲或母亲的等位基因做一个印记，使其只表达父源或母源的等位基因，使之在子代中产生不同表型。印记持续在一个个体的一生中，在下一代配子形成时，旧的印记可以消除并发生新的印记。 遗传印记：越来越多的研究显示一个个体的同源染色体（或相应的一对等位基因）因分别来自其父方或母方，而变现出功能上的差异，因此当它们其一发生改变时，所形成的表型也有不同，这种现象称为遗传印记或基因组印记、亲代印记。PWS病症名称概述普达-威利综合症英文全称为Prader-Willi syndrome，为一种一种罕见疾病，目前证实为15号染色体缺失所致,属于遗传疾病致范畴。 临床表现患者表现为饥饿,且不能因进食而消除饥饿感，致使患者暴饮暴食。有时患者会出现吃猫粮狗粮，甚至煤等不是食物的物品进行“充饥”。由于长期 的暴饮暴食患者表现为病态肥胖。同时患者可伴有智力低下及其它异常。 治疗该病尚无药物治疗，只能通过控制饮食，加强锻炼来对抗疾病。抑制食欲的药物对该病无效。若不能有力的控制食欲，患者常因体重超标而引起的各种疾病而英年早逝。ASAngleman综合征(Angelman syndrome，AS)为临床少见病，国外统计发病率约为1/15000，而国际较少报道。其临床表现复杂多样，遗传机制特别复杂，绝大少数为分发病例。1987年，Magenis发现AS患者是由于母系来源的15q11-q13缺失招致的异常。随后的研讨发现AS分子缺陷类型复杂，次要包括：(1)约70%的患者是由于15q11-q13 缺失惹起的，而且存在这种缺失的染色体源自于患者的母亲，假如存在异样缺失的15号染色体来自于父亲，则为临床表现完全不同的 Prader-Willi综合征，其基本缘由是该区域内相关基因辨别为父源和母源印记基因所致。(2) UBE3A 基因编码一种与蛋白退变有关的遍在蛋白衔接酶，该基因位于 15q11-q13区域内，在脑组织呈母源特异性表达(遗传印记)，该基因的渐变是约20% AS 患者的致病缘由。(3)约5% AS 患者是由于位于 15q11-q13内的印记中心发作了渐变，即印记渐变，使得印记区域(15q11-q13)出现异常 DNA甲基化和表达所致。(4)约2% AS 患者的一对15号染色体没有构造上的异常，但均来自于父亲，即父源单亲二倍体是这局部患者的遗传根底。值得留意的是，大约10%具有经典AS表型特征患者目前的患病基因机制未知。剖析2 三类临床表现AS的临床表现复杂多样。2006年欧洲的诊断指南以为，依据症状呈现的频率可将其分为三类：(1)100%呈现的症状：发育缓慢、运动战争衡妨碍、浅笑面容和言语妨碍;(2)常常呈现的症状(80%)：头围较小、癫痫和异常脑电图(肌阵挛发作，锁时景象);(3)其他随同症状(20%80%)：枕骨扁平、脊柱侧弯、圆锥角膜、喂养妨碍、便秘、怕热、睡眠妨碍、瘦削等。HER2 原癌基因人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER2)基因,即c-erbB-2基因,定位于染色体17q12-21.32上,编码相对分子质量为185000的跨膜受体样蛋白,具有酪氨酸激酶活性。是重要的乳腺癌预后判断因子,HER2阳性(过表达或扩增)的乳腺癌,其临床特点和生物学行为有特殊表现,治疗模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别。检测方法有免疫组化、FISH等。目前已有针对该基因失活的药物-赫赛汀（Herceptin）。赫赛丁适应症: 适用于治疗HER2过度表达的转移性乳腺癌：作为单一药物治疗已接受1个或多个化疗方案的转移性乳腺癌；与紫杉类药物合用治疗未接受过化疗的转移性乳腺癌。MY C N基因是 m y c基因家族的重要成员之一 与 c m y c保持高度 同源性 是人类神经母细胞瘤 中最常见的扩增癌基因之一 MY C N通过编码大小约6 4 k u的磷酸化核蛋 白在转 录水 平调控基 因 的表达。在调节细胞生长、分化及恶性转移中发挥作用。MY C N通常在正常胚胎组织或细胞 中呈高表达。而在成人组织中呈低表达。但在人神经母细胞瘤等具有神经源性特征的肿瘤 中有明显扩增，且扩增程度与肿瘤发病进程相关 大量研究证实 ， 除神经源性 肿瘤 MYC N基因也与血液系统肿瘤密切相关有文献报道 ，2 0 1 0 0 的儿童急性髓系白血病A ML 患者的 MY C N表达量是 正常对照组的2 3 3倍 ：同时证实 过表达鼠源性 y C 可在小鼠中成功建立 A ML疾病模型。Wnt信号通路 包括许多可调控Wnt信号分子合成的蛋白质，它们与靶细胞上的受体相互作用，而靶细胞的生理反应则来源与细胞和胞外Wnt配体的相互作用。尽管发应的发生及强度因Wnt配体，细胞种类及机体自身而异，信号通路中某些成分，从线虫到人类都具有很高的同源性。蛋白质的同源性提示多种各异的Wnt配体来源于各种生物的共同祖先。经典Wnt通路描述当Wnt蛋白于细胞表面Frizzled受体家族结合后的一系列反应，包括Dishevelled受体家族蛋白质的激活及最终细胞核内-catenin水平的变化。 Dishevelled (DSH)是细胞膜相关Wnt受体复合物的关键成分，它与Wnt结合后被激活，并抑制下游蛋白质复合物，包括axin、GSK-3、与APC蛋白。axin/GSK-3/APC 复合体可促进细胞内信号分子-catenin的降解。当“-catenin 降解复合物”被抑制后，胞浆内的-catenin得以稳定存在，部分 -catenin进入细胞核与TCF/LEF转录因子家族作用并促进特定基因的表达。myc基因简介myc基因是较早发现的一组癌基因，与之同源的病毒癌基因存在于MC29及其它一些具有高度致癌性的猿逆转录病毒中。myc基因高水平表达时可转化啮齿类成纤维细胞。 简介myc基因是较早发现的一组癌基因,包括C - myc，N -myc，L - myc ，分别定位于8号染色体，2号染色体和1号染色体。结构上由不编码蛋白质的第1外显子和编码蛋白质的第2、3外显子构成。myc基因属于编码核蛋白的癌基因，3个基因都编码一种与细胞周期调控有关的核内DNA结合蛋白。myc基因家族及其产物可促进细胞增殖，永生化，去分化和转化等，在多种肿瘤形成过程中处于重要地位。myc基因家族中的3个成员对肿瘤形成及在肿瘤类型方面存在差异。目前认为，C - myc的扩增与肿瘤发生与转归密切相关，N - myc的扩增对肿瘤的预后判断有意义，L - myc扩增与肿瘤的易患性和预后在不同的肿瘤中表现不一样。近年来的研究表明，myc基因产物，尤其是c - myc在诱导细胞凋亡过程中也起重要作用。 myc基因首次在Burkitt淋巴瘤中发现，可通过染色体易位而活化，最常见的是通过8号染色体与14号染色体间易位，使得8号染色体上的myc基因或其相邻区域与14号染色体的免疫球蛋白重链融合而被活化。myc基因还可以通过染色体2：8或8：22间易位与免疫球蛋白轻链序列融合而被活化。尽管不同肿瘤中影响myc基因的易位断裂点的具体位置可能有所不同，但染色体易位的共通之处是改变了myc基因正常的表达调控机制。 除了染色体易位可破坏myc基因的表达调控之外，在某些肿瘤类型中myc基因还受DNA扩增的影响。myc基因在小细胞肺癌中有较高频率扩增，在很多其它类型上皮癌如乳腺癌和结直肠癌中也有扩增。 myc基因的分类和功用myc基因包括C - myc，N -myc，L - myc，分别定位于8号染色体，2号染色体和1号染色体。结构上由不编码蛋白质的第1外显子和编码蛋白质的第2，3外显子构成。myc基因属于编码核蛋白的癌基因，3个基因都编码一种与细胞周期调控有关的核内DNA结合蛋白。myc基因家族及其产物可促进细胞增殖，永生化，去分化和转化等，在多种肿瘤形成过程中处于重要地位。myc基因家族中的3个成员对肿瘤形成及在肿瘤类型方面存在差异。目前认为，C - myc的扩增与肿瘤发生与转归密切相关，N - myc的扩增对肿瘤的预后判断有意义，L - myc扩增与肿瘤的易患性和预后在不同的肿瘤中表现不一样。近年来的研究表明，myc基因产物，尤其是c - myc在诱导细胞凋亡过程中也起重要作用。 c-myc癌基因结构及表达c-myc基因是禽类髓细胞病毒(AMN)MC-29的V-myc的细胞同源序列，从MC-29病毒 中分离的V-myc是gag-myc融合体，它由1358个bp的gag基因与1568个bp的V-myc基因共 同组成.C-myc基因由3个外显子及2个内含子组成，第一个外显子不编码，只起调节作 用，只有外显子2和3与V-myc相对应，编码一个439个氨基酸的蛋白质.C-myc基因由启 动子P1或P2起始转录并在第一内含子中尚有一个潜在启动子P，当第一个内含子发生 断裂时，P可被激活而成为一个异常转录起始点，但蛋白合成起始位点不变，并与正 常C-myc基因产物相同.在各种不同动物中，C-myc基因和第2.3外显子具有高度保守 性，而第1外显子则有较大的差异.小鼠和人的外显子1只有70%的同源性.人类C-myc基 因定位于8q24.在生理学上，C-myc基因的表达一般与细胞的生长状态有关，如有生长 因子刺激成纤维细胞，可导致C-myc表达增强，相反，在细胞分化时C-myc表达降低， 在细胞培养过程中，用C-myc表达结构或反义寡脱氧核酸进行研究，发现C-myc在细胞 G0期到S期的过程中也起作用.表明C-myc表达的变化与细胞的增殖及分化状态有关， 其表达产物在调节细胞生长、分化或恶性转化中发挥作用。 C-myc基因的表达产物及功能C-myc基因的产物为62KD的磷酸化蛋白P62c-mgc，是由C-myc基因的外显子2和3共 同编码的由439个氨基酸组成的蛋白质，定位细胞核内，为核蛋白，依C-one编码产 物，功能分类，C-myc癌基因属核蛋白基因，具有转化细胞的能力，并具有与染色体 DNA结合的特性，在调节细胞生长、分化及恶性转化中发挥作用.C-Myc蛋白在结构上 可分为转录激活区，非特异DNA结合区，核靶序列，碱性区，螺旋一环一螺旋(HLH)及 亮氨酸拉链区，在已知的转录因子中可介导蛋白的寡聚化，这两个区同时存在是 C-myc蛋白所特有的，在其它蛋白质中，很少发现.在C-Myc蛋白中，螺旋一环一螺旋 紧随着碱性区，揭示其以特异性序列方式和DNA相互作用.在以原核生物为实验对象的 研究表明，该碱性区以一个自由环存在，当以特殊方式结合到DNA上时，则变成螺 旋，该区是C-Myc蛋白与DNA特异序列的结合部位. 在C-Myc中还存在着与抑制细胞分化、自身抑制有关的区域及肿瘤转化所必需的 区域.Smith等研究了C-Myc的亮氨酸拉链区，该区介导各种转录因子的二聚作用.在亮 氨酸重复部位的突变能显蓍降低C-myc抑制鼠红白血病(MEL)细胞分化能力，同样地， 此区的插入突变能消除C-Myc的转化活性.正是这些C-myc结构成分的表达阻止了细胞 进入细胞周期，从而抑制许多细胞系的分化.Cronch等对C-Myc亮氨酸拉链区的亮氨酸 进行致突变，发现这些突变不能自身抑制，说明了亮氨酸拉链区在自身抑制中的重要 性.Stone等研究认为，C-Myc分子的中间1/3以及N-端，C-端是肿瘤转化所必需的，是 C-myc基因与肿瘤转化有关的C-myc区段.正是由于这些C-Myc功能区域的存在，从而使 C-Myc在胞浆内合成后，与其它蛋白形成寡聚体，再转移到核内，并结合到特异性的 DNA序列上，从而激活和抑制许多靶基因的转录，引起细胞生长和分化的改变，发挥 其生理调节功能及恶性转化作用. 近年来对疗程性细胞死亡Programmed Cell death. PCD)研究的深入，发现Myc蛋 白参与诱导细胞凋零.C-myc基因表达的失调是多种细胞凋零的主要诱因，细胞发生凋 零的速度及其对诱导因素的敏感性均依赖于细胞Myc蛋白的含量.尚未成熟胸腺细胞中 Myc基因的高表达是胚胎胸腺细胞凋零死亡的诱因.而且在凋零细胞的死亡阶段，也观 察到C-myc基因的高水平表达，如果用反义寡核苷酸阻断C-myc基因的表达，则细胞凋 零受到严重干扰.Evan研究发现，C-myc表达的失调也会启动去除生长因子后培养细胞 的成熟前凋零.他们对小鼠IL-3依赖性髓样细胞素32D进行观察，发现在洗去IL-3后， 可立即观察到C-myc基因表达下调.结果使培养细胞停止于G1期，将携带C-myc基因的 载体转染32D细胞，获得稳定表达C-myc基因的32D细胞克隆，结果这种细胞去除H-3 后，不停止于G1期，而是启动以凋零为特征的程序性细胞死亡.结果揭示细胞凋零是 清除固定突变及细胞周期调控失衡的细胞的重要机制，一旦细胞发生障碍，C-myc基 因会启动凋零程序，相反，则导致肿瘤形成。 myc癌基因与人类肿瘤myc基因定位于染色体8q24、IgH、IgK、Ig链的基因位点分别在14q32、2P13和 22q11，在BL细胞中往往出现C-myc基因位点与Ig基因位点之间的易位，即C-myc易位 到Ig位点的高活性转录区，从而组成一个高转活性的重排基因，启动C-myc转录，使 C-myc表达增强，促进细胞恶变，最后导致肿瘤的发生. C-myc基因主要通过扩增和染色体易位重排的方式激活，与某些组织肿瘤的发 生、发展和演变转归有重要关系.在不同的人体肿瘤细胞系中，包括粒细胞性白血病 细胞系，视网膜母细胞瘤细胞系，某些神经母细胞病细胞系，乳腺癌细胞系及某些肺 癌细胞系，已发现C-myc或C-myc相关序列的扩增，在人结肠癌细胞系中也观察到 C-myc基因的扩增.C-myc癌基因已在成骨肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、横纹 肌肉瘤中发现扩增，当扩增达到30倍时，染色体上表现HSR和DMS，而且C-myc过量表 达与肿瘤的早期复发有关，在致瘤中，已发现ras与myc、sis与myc、myc与fos偶联激 活，协同致瘤等. 许多资料表明C-myc位点在所有受检的B细胞肿瘤中有重排，Casares等发现定位 在8号染色体上的C-myc与定位在14号染色体上的Ig重链基因有同样的14.2Kb的ecori 酶切片段，因而发生814易位可能是何杰氏淋巴瘤的一个普通标志.N-myc在人神经 位母细胞瘤.视网膜母细胞瘤和小细胞肺癌中有扩增，扩增的程度与肿瘤的发病进程 有关.Schwab等报告20%的神经母细胞瘤有N-myc扩增，其中大多数是侵袭性肿瘤.Seege r等报告基因拷贝数的多少预示疾病的进程，总的来说，带有一个拷贝数的、 、.期神经母细胞瘤常规治疗效果较好，带有多个拷贝的、期病人，病 情将不断加重.c-myc首先被发现与小细胞肺癌有关，30%的病例c-myc扩增，复发病人 中，myc扩增者的生存期短于没有扩增的病例，研究还发现接受化疗的肿瘤病人易引 起myc扩增.有关myc基因扩增与其它肿瘤的关系也有许多报道.目前认为胃癌、乳腺 癌、结肠癌、宫颈癌、何杰金氏病及头部肿瘤等都有myc基因的扩增或过度表达 myc基因临床意义过度表达，见于各种肿瘤，如肺癌，胃癌，乳腺癌，结肠癌，宫颈癌，某些神经母细胞病，粒细胞性白血病 ，视网膜母细胞瘤，成骨肉瘤，软骨肉瘤，脊索瘤，脂肪肉瘤，横纹肌肉瘤，何杰金氏病及头部肿瘤等都有myc基因的扩增或过度表达。建立同时检测Myc基因3个成员L-myc 、N-myc及C-myc异常扩增的简便方法。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术，用一对引物同时扩增Myc基因3个成员第2外显子中的高度保守区，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及激光扫描。结果此法可以检测Myc基因家族中3个成员的扩增情况。 经检测，正常组织细胞没有Myc基因扩增，32例喉癌组织中47%有L-myc和C-myc扩增，41%有N-myc 扩增，与正常比差异均有显著意义(=6.764,7.609, 5.961;P均0.05) 。结论此法对检测肿瘤组织中Myc基因3个成员提供了简易、特异、 无放射污染，并且适于临床应用的、优于PCR-琼脂糖凝胶电泳的方法。 论文至今Myc基因已被发现了至少3种，C-myc、N-myc和L-myc 讨论目前，国内外用于检测N-myc、L-myc及C-myc的方法大多采用各种杂交技术。由于应用放射性同位素，需要各种防护措施，不安全又复杂，且一次只能检测Myc基因家族中的一个基因，临床上很难常规应用。PCR琼脂糖凝胶电泳技术简单、易行、快速，但由于灵敏度低，不能分开只相差3个bpDNA的L-myc和N-myc，所以只能检测C-myc的相对扩增，而不能检测N-myc或L-myc扩增或二者的同时扩增。而且，如果有N-myc或L-myc扩增或二者同时扩增时，即使有C-myc扩增，也会出现假阴性结果。我们首先把PCR技术与中性聚丙烯酰胺凝胶电泳及激光扫描技术结合起来，并用硝酸银试剂使凝胶上的Myc 基因双链染成黑褐色。这样的实验结果特异性高，方法简单，成本低，又避免了放射性同位素的一切弊端，很适合于临床应用。聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，具备分离只相差一个核苷酸的不同DNA片段的特性。在中性聚丙烯酰胺凝胶中，双链DNA片段的电泳迁移率主要由DNA片段长短决定，而与其碱基组成和顺序基本无关。基于以上原理，我们设计了此实验，目的是能把琼脂糖凝胶电泳上没有分开的只相差3 bp的N-myc和L-myc分开，作到一次可同时检测3种Myc基因的扩增情况。实验表明：用PCR-中性聚丙烯酰胺凝胶电泳和用PCR-琼脂糖凝胶电泳检测C-myc基因结果基本相符， 说明本研究建立的方法结果可靠。Myc基因是较早发现的一组癌基因，Myc基因的异常扩增或表达，参与了很多肿瘤的发生和发展。本研究方法对进行3种Myc基因在肿瘤形成过程中作用机理的研究，提供了简便易行的实验手段。 结果1.PCR-琼脂糖凝胶电泳结果：实验设计的引物扩增Myc 3种基因，经PCR扩增，喉癌组织及正常组织细胞DNA在琼脂糖凝胶上均可见2条小于300 bp 的电泳带。第1条带为N-myc( 230bp)和L-myc(227 bp)2个DNA片段合成带，因两者只相差3 bp，故琼脂糖凝胶电泳不能将其分开而呈现1条带；第2条电泳带为C-myc基因(244 bp)。 将电泳结果拍照后的底片在激光扫描仪进行扫描，得出2条带的峰面积值。正常组织细胞的C-myc带比N-myc和L-myc合成带密度弱，比值小于1，求出正常组织细胞的C(N+L)均值为0.6 。 C-myc扩增倍数=喉癌的C(N+L)0.6，考虑实验中的综合因素，定为1.5倍以上有C-myc扩增。结果显示：喉癌中有42%的C-myc扩增，正常组织细胞没有C-myc的扩增。 2.PCR-中性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果：由于中性聚丙烯酰胺凝胶电泳对DNA的分离特性，经PCR扩增后的Myc基因电泳带显示3条。第1条带为L-myc(227 bp)，第2条为N-myc(230 bp)，第3条为C-myc(244 bp) 。将扩增出特异性Myc基因电泳带的凝胶片，直接在激光扫描仪上进行扫描，得出3条带的峰面积值。然后用各自的峰面积值除以各自的碱基数，作为该基因的单拷贝数，将L-myc、N-myc和C-myc三者中最小的单拷贝数设定为1，比较其他2个基因的相对倍数。正常组织细胞L-mycN-mycC-myc均值为1.02.23.8。结果32例喉癌中47%有L-myc和C-myc的扩增，41%有N-myc扩增。C-myc的扩增率与用PCR-琼脂糖凝胶电泳检测的结果基本一致(=0.254，P0.614)。 一、材料1.标本：32例喉癌组织取自我院耳鼻咽喉科住院病人，7例正常喉组织取自我科同期住院的非癌症病人，3例正常白细胞取自我院血库人全血。所有标本均经病理证实。根据喉癌组织病理分化程度不同，分为高、中、低分化癌。 2.PCR引物：5-CCCAGCGAGACATCTGGAAGAA-3，5-GAGAAGCCGCTCCACATGCAGTC-3。扩增Myc基因家族的3个基因，即C-myc(244 bp)，N-myc(230 bp)，L-myc(227 bp)，由上海复旦大学遗传学研究所合成。 3.试剂：TaqDNA聚合酶、dNTP为Promega公司产品；蛋白酶K为Merke公司产品；硝酸银为沈阳试剂二厂产品；Marker PUC 18质粒DNA Hea酶切片段为Sigma公司产品。 二、方法1.模板DNA提取：参照参考文献3方法进行。 2.PCR扩增：PCR扩增总反应体积50 l，应用模板DNA 50 ng，在DNA扩增仪操作(Perkin Elmer Cetus)，循环周期为941分钟，551分钟，722分钟，经过30个循环后，补加727分钟。 3.琼脂糖凝胶电泳步骤：取PCR产物5 l加1l上样缓冲液(0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯氰FF，40%蔗糖水溶液)之后备用。制备2%琼脂糖凝胶倒入水平式电泳槽中。待胶凝固后加样，用1TAE缓冲液作为电极缓冲液，溴化乙锭染色，电压低于5V/cm，时间约为2小时。电泳结束后，凝胶直接在紫外透射仪上观察结果。照像，拍片后的底片在激光扫描仪上进行扫描。 4.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：取PCR产物5 g加1 l上样缓冲液之后备用。制备8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注于20 cm20 cm0. 1 cm垂直板电泳槽中， 待凝胶聚合后加样，用1TBE缓冲液作电极缓冲液，室温下电泳1瓦特约14小时，待指示剂溴酚蓝移到边缘时停止电泳。将电泳后的凝胶移至方盘中进行硝酸银染色。染色过程如下：用双蒸馏水(dH2O)洗凝胶3次后浸泡于染色液(硝酸银1g，加dH2O至500 ml)中30分钟，去掉染色液，用dH2O漂洗3次凝胶，然后浸泡于显色液(NaOH15g，38%甲醛3.8 ml，加dH2O至500ml)中约10分钟，当显出棕黑色DNA区带时，用dH2O洗1次凝胶后，浸于停影液(冰醋酸25 ml，加水至500 ml)中约30分钟，然后把凝胶移至固定液(乙醇25 ml，冰醋酸2.5 ml加dH2O至500 ml)中固定。固定后的凝胶在看片灯上观察结果、拍照片，凝胶直接在激光扫描仪进行扫描。 ，3者在第2外显子中有2个区域高度同源，3个基因分别表达各自独立的蛋白，它们的生理作用基本一致。研究表明，在许多肿瘤细胞中有Myc基因扩增或异常表达，但在不同的肿瘤组织和癌细胞系中，Myc基因家族的成员在扩增或表达方面有些差异。因此，深入研究Myc基因3个成员与人类肿瘤的关系非常有意义。本研究建立的PCR-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-激光扫描技术，可同时检测肿瘤组织中3种Myc基因的扩增情况，在肿瘤发生发展过程中，为进行3种基因各自作用机理的研究提供了简易的实验手段。P53因编码一种分子质量为53 kDa的蛋白质而得名，是一种抗癌基因。其表达产物为基因调节蛋白（P53蛋白），当DNA受到损伤时表达产物急剧增加，可抑制细胞周期进一步运转。一旦p53基因发生突变，P53蛋白失活，细胞分裂失去节制，发生癌变，人类癌症中约有一半是由于该基因发生突变失活。人体抑癌基因。该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，命名为P53。p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。但是事物必然有它的两个方面，p53是一个重要的抗癌基因使癌细胞自杀，防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。这种功能对于受化疗药物作用而受伤的癌细胞，则起修复作用，而不是使癌细胞自杀。造成被修复的癌细胞在治疗后成为新的肿瘤。p53是一种肿瘤抑制基因（gene）。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。由这种基因编码的蛋白质（protein）是一种转录（transcription）因子，其控制着细胞周期的启动。许多有关细胞健康的信号向p53蛋白发送。关于是否开始细胞分裂就由这个细胞决定。如果这个细胞受损，又不能得到修复，则p53蛋白将参与启动过程，使这个细胞在细胞凋亡（apoptosis）中死去。有p53缺陷的细胞没有这种控制，甚至在不利条件下继续分裂。像所有其它肿瘤抑制因子一样，p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。 细胞中抑制癌变的基因“p53”会判断DNA变异的程度，如果变异较小，这种基因就促使细胞自我修复，若DNA变异较大，“p53”就诱导细胞凋亡。 P53 是重要的肿瘤抑制基因，自从该基因在1979年被首次报道以来，有关研究论文在Medline上可查到20000余篇。人们最初认为P53基因是一种癌基因，但随着近十年研究的深入， P53作为抑癌基因的功能逐渐被揭示出来。在人类50%以上的肿瘤组织中均发现了P53基因的突变，这是肿瘤中最常见的遗传学改变，说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素。 P53基因突变后，由于其空间构象发生改变，失去了对细胞生长、凋亡和DNA 修复的调控作用， P53 基因由抑癌基因转变为癌基因。 P53 介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用， 它与细胞内其它信号转导通路间的联系十分复杂，其中P53 参与调控的基因已超过160 种， 因此，Levine 等学者提出了P53 基因网络的概念： 他们认为不能孤立地观察各个基因的生物学功能，而应该将它们组合起来看待。 P53蛋白主要分布于细胞核浆，能与DNA特异结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻译后修饰调控。正常P53的生物功能好似“基因组卫士（guardian of the genome）”，在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性。如有损伤，P53蛋白阻止DNA复制，以提供足够的时间使损伤DNA修复；如果修复失败，P53蛋白则引发细胞凋亡;如果p53基因的两个拷贝都发生了突变，对细胞的增殖失去控制，导致细胞癌变。 P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，在短短的十多年里，人们对 P53基因的认识经历了癌蛋白抗原，癌基因到抑癌基因的三个认识转变，现已认识 到，引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是P53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因 子，它可以消除正常P53的功能，而野生型P53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。P53蛋白还分布于线粒体、核仁等结构，并且与细胞骨架有相互作用关系。 P53基因结构及表达P53基因在人类、猴、鸡和鼠等动物中相继发现后，对其进行了基因定位，人类 P53基因定位于17P13.1，鼠P53定位于11号染色体，并在14号染色体上发现无功能的 假基因，进化程度迥异的动物中，P53有异常相似的基因结构，约20Kb长，都由11个 外显子和10个内含子组成，第1个外显子不编码，外显子2、4、5、7、8、分别编码5 个进化上高度保守的结构域，P53基因5个高度保守区即第1319、117142、17119 2、236258、270286编码区.P53基因转录成2.5KbmRNA，编码393个氨基酸蛋白， 分子量为53KD，P53基因的表达至少受转录及转录后二种水平的调控.在停泊生长或非 转化细胞中P53mRNA水平很低，但刺激胞液后mRNA显著增加.持续生长的细胞，其mRNA 水平不随细胞周期而出现明显变化，但经诱导分化后mRNA水平降低，部分是转录后调 控.P53基因的转录由P1、P2二个启动子控制.P1启动子位于第一外显子上游100250bp， P2位于第一内含子内，在启动子中包含1个NF1蛋白结合位点和一个转录因子AP1相关 蛋白的结合位点，对正常P53基因的转录，不仅需要二个启动子的平衡作用，而且P53 基因内含子也起作用，如内含子中有正调控作用，其调控有组织特异性. P53基因产物及功能P53蛋白N一端为酸性区180位氨基酸残基，C-端为碱性区319393位氨基酸残 基，正常的P53蛋白在细胞中易水解，半衰期为20分钟，突变性P53蛋白半衰期为1.4 7小时不等，P53蛋白N端有一个与转录因子相似的酸性结构域，与GAL4的DNA结合区重 组时，融合蛋白能激活GAL4操纵子转录，激活功能定位在P53第2040位密码子，P53 细胞定位及反式激活功能提示，P53蛋白可能直接或通过与其他蛋白作用参与转录控 制. P53蛋白的DNA结合作用及反式激活作用还提示其参与细胞生长调控.通过流式细 胞仪测定单个细胞的细胞周期中P53的表达，发现激活的淋巴细胞比未激活者有较多 的P53表达，而且随细胞从G1至S期再到G2，M期而增加，提示P53表达与细胞生长的相 关性比进入细胞周期或周期中特定时刻为高.以编码反义P53RNA的质粒转染非转化细 胞导致细胞生长完全停止，P53抗体注入将进入生长周期的静止细胞.可抑制细胞入S 期，提示P53可能为Go/G1-S转换所必需，但P53抗体对细胞从分裂至S期无作用，G1期 细胞有抑制作用的二丁酸钠也抑制P53合成，这些结果提示P53对细胞生长调控作用至 少表现在从G0-G1，或G1-S，但其作用机理尚未弄清楚.目前认为，P53蛋白可通过调 控Cipt基因表达而调控细胞生长，即P53蛋白可刺激Cipt基因产生分子量为21KD的蛋 白，这种蛋白能够有效抑制某些促使细胞通过细胞周期进入有丝分裂的酶活性，从而 抑制细胞生长，此外，P53的抑制作用还伴随细胞生长核抗原株表达的降低.细胞生 长、核抗原参与细胞DNA复制.因此，P53可能通过抑制与DNA复制相关的细胞基因或基 因产物而发挥作用。 1. 阻滞细胞周期在细胞周期中，P53 的调节功能主要体现在G1和G2/M 期校正点的监测，与转录激活作用密切相关。P53下游基因P21编码蛋白是一个依赖Cyclin的蛋白激酶抑制剂，一方面P21 可与一系列Cyclin-cdk 复合物结合，抑制相应的蛋白激酶活性，导致高磷酸化Rb 蛋白堆积，后者使E2F转录调节因子不能活化，引起G1期阻滞；另外P53的另外3个下游基因Cyclin B1,CADD45 和1