妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞功能的研究

妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞功能的研究摘要目的研究妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞功能的变化。方法选择2010年10月2011年8月于我院产科住院的妊娠高血压综合征患者12例作为研究对象（妊娠高血压综合征组），同时选取12例正常妊娠的同期入院患者作为对照组。分离两组患者外周血单个核细胞进行体外诱导培养以获得内皮祖细胞，并对其增殖、黏附、迁移能力进行检测。结果各组骨髓单个核细胞在体外培养下均能够获得内皮祖细胞，与对照组比较，妊娠高血压综合征组内皮祖细胞增殖、黏附、迁移能力均有不同程度的下降。结论妊娠高血压综合征的发生与循环内皮祖细胞功能的下调存在明显的相关性。关键词妊娠高血压综合征；内皮祖细胞；外周血单个核细胞中图分类号R714.246文献标识码A文章编号1673-7210（2013）02（b）-0025-03近年来大量的研究显示，妊娠期高血压的发生与血管内皮损伤之间存在着密不可分的联系，而在血管损伤修复中扮演着关键角色的内皮祖细胞（endothelialprogenitorcell），其数量及功能的变化对于疾病的评估有着至关重要的作用。血管内皮祖细胞通常定居于骨髓，作为血管内皮细胞的前体，其不仅参与胚胎血管生成及血管再生，同时在特定的状态下，它可以进入外周血，迁移并归巢至发生损伤的血管部位，发挥重要的血管修复作用。既往的研究表明，妊娠高血压综合征患者体内的循环内皮祖细胞数量存在显著的减少，然而对于其功能状态的研究却很少。因此，在本研究中通过体外培养的方式对妊娠高血压综合征患者的循环内皮祖细胞进行培养扩增，并对其体外的功能状态进行检测，以探讨内皮祖细胞功能状态与妊娠期高血压综合征之间的关系。1资料与方法1.1一般资料选择2010年10月2011年8月于我院产科住院的妊娠高血压综合征患者12例作为研究对象（妊娠高血压综合征组），其中，年龄（28.53.7）岁；孕龄（35.24.1）周。所有病例的入选标准均符合乐杰主编的妇产科学（第6版）中妊娠期高血压疾病的诊断标准，并且除外多胎妊娠、妊娠心脏病、妊娠糖尿病和妊娠期哮喘。同时选取12例正常妊娠的同期入院患者作为对照组，年龄（27.94.2）岁；孕龄（35.83.7）周。经统计学分析显示，两组在年龄、孕龄上差异无统计学意义（P0.05），具有可比性。1.2主要试剂内皮细胞培养基-2（EGM-2，瑞士Lonza公司）；DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-acLDL，美国MolecularProbes公司）；FITC标记的血凝素（FITC-lectin，美国Sigma公司）；纤维连结蛋白（fibronectin，美国HematologicalTechnologies公司）；噻唑蓝（MTT，美国Duchfo公司）；淋巴细胞分离液（天津TBD公司）。1.3研究方法1.3.1循环内皮祖细胞体外培养所有患者清晨空腹经肘静脉采集外周血20mL，经过密度梯度离心收集外周血单个核细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）反复洗涤离心后，加入EGM-2培养基重新悬浮细胞并将其细胞密度调整至1107/mL，将该细胞悬液接种至纤连蛋白包被的24孔板中，于37、5%CO2浓度的培养箱内进行细胞培养。培养至第3天用预热至37的PBS将未贴壁的细胞完全冲洗去除，更换新的培养液后对贴壁的细胞进行继续培养，以后采取隔日半量换液。1.3.2免疫荧光鉴定在细胞培养至第7天时，培养基中加入DiI-acLDL使其终浓度为5mg/L，于培养箱中继续培养4h，经2%多聚甲醛固定、PBS洗涤后，在24孔板中于每孔加入含有5mg/LFITC-lectin的PBS0.2mL，将其置于37温箱中孵育1h，经PBS反复冲洗后于荧光显微镜下进行观察。显示红色荧光者为DiI-acLDL阳性细胞，显示绿色荧光者为FITC-lectin阳性细胞，经过ImageJ图像处理软件进行图像叠加呈现为黄色荧光的细胞（即双荧光阳性的细胞）被认为是内皮祖细胞。1.3.3细胞增殖能力检测在细胞培养至第7天时，常规应用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化，并将其制备成密度为1105/mL的单细胞悬液，于96孔板的每孔中加入0.2mL细胞悬液，在37、5%CO2浓度的培养箱中培养96h，在培养时间结束的前4h于每孔中加入20LMTT（5mg/mL）。培养结束后，将培养基吸弃并加入100LDMSO，经振荡后用酶标仪检测其570nm处的吸光度（A值）。1.3.4黏附能力检测在细胞培养至第7天时，常规应用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化，并将其制备成密度为5104/mL的单细胞悬液，取1mL加入纤维连结蛋白包被过的24孔板中，在37、5%CO2浓度的培养箱中培养30min，经过PBS轻轻冲洗3遍后，利用相差显微镜（200）对贴壁细胞进行计数。1.3.5细胞迁移能力检测在24孔插入式培养皿的外孔中加入0.6mLEGM-2培养基，在细胞培养至第7天时，常规应用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化，并用不含细胞因子、血清浓度仅为0.1%EGM-2培养基将其制备成密度为5104/mL的单细胞悬液，取0.2mL细胞悬液加于皿内。在37、5%CO2浓度的培养箱中培养24h，取出培养皿，将皿内层的细胞去除后，对皿外层的细胞进行固定并行结晶紫染色，利用相差显微镜（200）对细胞进行计数。1.4统计学方法应用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。正态分布的计量资料数据以均数标准差（xs）表示，比较采用t检验，P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1内皮祖细胞培养及鉴定外周血单个核细胞在体外培养至第7天时，可以见到典型的内皮祖细胞生成，经过免疫荧光染色后，通过荧光显微镜检测显示，细胞摄取DiI-acLDL后呈现为红色荧光，结合FITC-lectin后呈现为绿色荧光。通过ImageJ图像处理软件进行图像叠加后可以发现，该类细胞具有同时摄取DiI-acLDL和结合FITC-lectin的能力，并显示为黄色荧光（图1，见封三），这与相关报道中内皮祖细胞的特性完全一致。2.2内皮祖细胞增殖能力的变化在体外增殖能力检测的MTT实验中，妊娠高血压综合征患者组循环内皮祖细胞在570nm处的吸光度为（0.530.12），而对照组循环内皮祖细胞在570nm处的吸光度则为（0.740.18）。经统计学分析显示，二者之间的差异具有高度统计学意义（t=5.94，P0.01）。2.3内皮祖细胞黏附能力的变化各组内皮祖细胞在体外培养30min，经过PBS轻轻冲洗3遍后，利用相差显微镜（200）对贴壁细胞进行计数，结果显示，妊娠高血压综合征组循环内皮祖细胞的贴壁细胞数为（5.821.69）个/HPF，明显少于对照组（12.372.96）个/HPF的贴壁细胞数量，两组比较，差异有高度统计学意义（t=2.64，P0.01）。2.3内皮祖细胞迁移能力的变化各组内皮祖细胞在24孔插入式培养皿内培养24h后，通过对皿外层的细胞进行固定并行结晶紫染色，利用相差显微镜（200）对细胞进行计数。结果显示，妊娠高血压综合征患者组循环内皮祖细胞迁移至皿外侧的细胞数量为（6.372.13）个/HPF，明显少于对照组（13.242.36）个/HPF的迁移细胞数量。两组比较，差异有统计学意义（t=3.62，P0.05）。3讨论妊娠高血压综合征主要是由于妊娠期全身小动脉痉挛性收缩和继发性损伤所致，血管内皮细胞激活和损伤所导致的血管内皮功能障碍的发生目前已被公认为该疾病的主要发病机制1。内皮功能障碍主要是由于内皮的损伤和修复之间的动态平衡发生破坏。而作为血管内皮细胞前体的内皮祖细胞，在血管损伤后的修复中发挥着至关重要的作用2。通常认为，当胎盘发生缺血缺氧时，可以促使血管内皮细胞分泌内皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子-、血管紧张素-等细胞因子进而达到对骨髓内皮祖细胞的动员目的，促进其进入外周血，并归巢至血管损伤部位，以实现受损血管内皮的修复。有研究显示，在妊娠高血压综合征患者处于子痫前期时，其外周血内皮祖细胞的数量会出现明显的减少3，并且在体外培养状态下内皮祖细胞集落形成能力同样会出现显著的下调4。尽管目前对于内皮祖细胞数量及集落形成能力的下调在妊娠高血压综合征患者发生子痫前期的过程中发挥着什么样的作用尚不完全明确，然而鉴于内皮祖细胞在血管损伤修复中所起到的关键作用，通常认为，与许多心血管疾病类似，妊娠期间由于各种原因所造成的内皮祖细胞的数量减少及功能下调，最终将致使机体应对炎症反应及代谢失衡能力的降低，从而导致广泛性的血管内皮舒张功能的障碍以及子痫前期的发生5。目前对于妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞数量的研究已经有较多的报道，但关于其功能状态的研究却相当较少。因此，在本研究中笔者采用体外培养的方式对妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞进行扩增培养，并对其体外的功能进行了相关的检测，以便进一步了解妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞除数量减少外，是否也同样存在一定程度的功能变化。研究结果显示，在恰当的培养体系下，各组外周血单个核细胞均能培养出内皮祖细胞，处于增殖期的内皮祖细胞同时具有摄取acLDL和结合lectin的能力，这与相关研究完全一致6，这为下一步的研究奠定了基础。在随后的内皮祖细胞体外功能检测中，笔者发现，妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞在体外的增殖、黏附、迁移能力较对照组相比均存在显著的下调。由此可见，妊娠高血压综合征的发生与循环内皮祖细胞数量的减少存在一定相关性的同时，其循环内皮祖细胞的功能亦存在不同程度的下调。正是由于这两方面共同作用的结果，导致患者受损的血管内皮细胞不能得到及时的修复，最终导致血管舒张功能严重受损。然而循环内皮祖细胞功能的下调是否与妊娠高血压综合征的严重程度存在一定的相关性还需要做进一步的研究。参考文献1林其德.妊娠高血压综合征病因学研究进展与展望J.中华妇产科杂志，2003，38（8）：471-473.2WernerN，KosiolS，SchieglT，etal.CirculatingendothelialprogenitorcellsandcardiovascularoutcomesJ.NEnglJMed，2005，353（24）：999-1007.3LinC，RajakumerA，PlymireDA，etal.Maternalendothelailprogenitorcellcolony-formingunitswithmacrophagecharacteristicsarereducedinpreeclampsinJ.AmJHypertension，2009，22（9）：1014-1019.4SugawaraJ，Mitsui-SaitoM，HayashiC，etal，DecreaseandsenescenceofEPCinpatientswithpreeclampsiaJ.ClinEndoerinolMetab，2005，90（9）：5329-5332.5HuppertzB.PlacentaloriginsofpreeclampsiachallengingthecurrenthypothesisJ.Hypertension，2008，51（4）：970-975.6YoonCH，HurJ，Par