小剂量阿司匹林对糖尿病大鼠白细胞凋亡相关蛋白的研究

小剂量阿司匹林对糖尿病大鼠白细胞凋亡相关蛋白的研究摘要目的研究小剂量阿司匹林对糖尿病大鼠白细胞凋亡相关蛋白的影响。方法雄性SD大鼠，尾静脉注射链脲佐菌素30mg/kg，造成1型糖尿病动物模型，随机分为糖尿病模型组和9mg/kg阿司匹林治疗组（ASA治疗组），每组8只，另选8只健康雄性大鼠为正常对照组。各组大鼠灌服给药12周后，免疫组化法检测分析白细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达情况。结果与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠白细胞Caspase-3、Bax表达增强，Bcl-2的表达减弱，Bcl-2/Bax比值降低；ASA治疗组大鼠，Caspase-3、Bax表达减低，Bcl-2表达提升，并提高Bcl-2/Bax比值。结论小剂量阿司匹林对糖尿病大鼠白细胞凋亡相关蛋白表达有调节作用。关键词阿司匹林；糖尿病；白细胞；细胞凋亡中图分类号R-33文献标识码A文章编号1674-4721（2013）02（c）-0011-03愈来愈多的证据表明白细胞与糖尿病及其并发症关系密切。有研究表明1-5，糖尿病常伴有白细胞功能异常，既表现为白细胞游走和吞噬功能下降，抗感染作用减弱，增加一些机会性感染及感染后难以好转，又易表现部分白细胞活化，多种白介素和黏附因子表达异常，促进白细胞黏附和穿过血管内皮细胞，损伤血管，造成视网膜及肾脏的小血管损伤以及肢体大血管硬化。TennenbergSD等6和GlowackaE等7研究认为，糖尿病患者会出现中性粒细胞相关性凋亡增加，引起细胞功能性寿命下降和感染部位清除增加，这可能是糖尿病易合并感染且难好转的重要原因。近年来，抑制白细胞凋亡已成为防治糖尿病及其并发症的重要机制4-5。邱丽颖等8-9研究报道阿司匹林在大鼠脑缺血再灌注损伤时，通过提高Bcl-2并降低Bax基因蛋白表达，提高Bcl-2/Bax比值而发挥抗凋亡效应，从而起到神经保护作用。有研究报道阿司匹林发挥保护作用的有效剂量包括相当人常规使用的小剂量（日用100mg），而目前临床糖尿病患者大多因合并或并发心脑血管疾病而长期服用小剂量阿司匹林，但小剂量阿司匹林糖尿病患者长期服用，对白细胞凋亡是否有影响，进而影响白细胞功能，目前尚缺乏实验依据。本研究采用大鼠尾静脉注射链脲佐菌素造成1型糖尿病动物模型，研究相当人小剂量阿司匹林对糖尿病大鼠白细胞凋亡相关蛋白表达的影响，为小剂量阿司匹林可能会发挥改善糖尿病患者白细胞功能提供实验依据。1材料与方法1.1实验动物雄性SD大鼠30只，体重180220g，辽宁医学院实验动物中心提供。1.2主要药物、试剂和器械拜阿司匹林（阿司匹林肠溶片），拜耳医药保健有限公司进口分装，生产批号：BJ00557；链脲佐菌素（STZ），美国sigma公司产品；兔抗大鼠Bcl-2抗体、Bax单克隆抗体、二步法非免疫血清、生物素二抗及辣根酶标记的链酶亲和素试剂盒（PV6001）、DAB显色试剂盒由中山杉生物技术公司提供，Caspase-3单克隆抗体、生物素化二抗试剂盒（SP0023）美国sigma购自北京博奥森公司产品；DP72型OLYMPUS光学成像分析系统，日本奥林巴斯公司；京都型血糖检测仪，日本ARKRAY，Inc株式会社；TGL-168高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂。1.3动物分组与处理30只雄性SD大鼠，随机选取8只作为正常对照组，22只尾静脉注射链脲佐菌素（STZ，30mg/kg；1gSTZ溶于100mL柠檬酸盐缓冲液配制而成，pH=4.5），正常对照组大鼠注射同等体积的缓冲液。3d后，禁食12h，剪大鼠尾尖部，采用血糖仪现场测定血糖浓度，将血糖测定结果大于16.7mmol/L视为1型糖尿病造模成功。随机选取造模成功大鼠16只，分为糖尿病模型组和9mg/kg阿司匹林（ASA治疗组）治疗组（按体表面积换算相当人日用100mg），每组8只。ASA组大鼠，拜阿司匹林片剪断研碎后加适量蒸馏水，混匀后以0.1mL/100g灌胃给药12周，正常对照组和糖尿病模型组大鼠同日灌服等量蒸馏水。实验结束时，大鼠禁食12h，5%水合氯醛腹腔麻醉，剪大鼠尾尖部，采用血糖仪现场测定血糖浓度，随后心室内取血1mL，加4mL0.45%冷盐水，混匀后静止15min，低渗促红细胞溶血，1000r/min离心10min，沉淀以冰生理盐水冲洗，再次1000r/min离心10min，沉淀放入10%中性甲醛固定，24h后1000r/min离心10min，沉淀加1mL0.9%氯化钠溶液，混匀后，于防脱处理载玻片上进行细胞涂片，每只大鼠血细胞涂片10张，自然干燥后进行免疫组化染色。1.4血糖检测用血糖仪及专用血糖试纸现场检测大鼠血糖。1.5免疫组化染色免疫组织化学染色：将细胞涂片，高压修复抗原（将切片置于含pH=6.0枸椽酸缓冲液的高压锅内，加热至减压阀喷气2min，自然冷却，取出，0.01MPBS洗涤3次，每次5min）；3%过氧化氢溶液处理1030min以去除内源性过氧化物酶，0.01MPBS洗涤3次，每次5min；滴加1100稀释的滴加第一抗体（Bcl-2、Bax），4过夜，0.1MPBS洗5min3次；滴加辣根酶标记羊抗兔IgG多聚体（PV6001），37孵育30min，0.01MPBS洗涤3次，每次5min；滴加生物素化第二抗体，3720min，0.1MPBS洗5min，3次；滴加辣根酶标记链霉亲和素工作液，3720min，0.1MPBS洗5min3次；使用DAB显色试剂盒1mL蒸馏水加显色剂A、B、C各1滴，混匀，加至标本上，显色6min，充分水洗；苏木素复染细胞核1min，充分水洗、1%盐酸酒精分化、1%胺水反蓝、充分水洗、经70%乙醇5min、尿80%乙醇5min、90%乙醇5min2次、95%乙醇5min2次、100%乙醇5min2次，脱水、二甲苯透明5min2次、中性树脂封片。Caspase3检测：一抗洗涤后，滴加生物素化羊抗兔IgG（SP0023），37孵育30min，0.01MPBS洗涤3次，每次5min；滴加试剂SP，37孵育30min，0.01MPBS洗涤3次，每次5min；DAB显色。其余步骤同上。结果观察：用Olympus成像分析系统高倍镜（400）下观察和采集显微图像，采用美国显微镜图像分析测量软件Image-ProPlus6.0测量单个细胞平均光密度值（mean-density），以黄色为阳性表达，分析Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达情况。每只大鼠测量值取3张涂片的平均值。1.6数据处理方法用SPSS13.0软件进行统计分析。结果以xs表示，采用单因素方差分析，P0.05为差异有统计学意义，P0.01为差异有高度统计学意义。2结果小剂量阿司匹林对糖尿病大鼠白细胞细胞凋亡相关蛋白表达的影响，具体见表1和图1，正常对照组，白细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2均有一定程度表达；糖尿病模型组，白细胞Caspase-3和Bax表达均明显强于正常对照组，而Bcl-2表达明显弱于正常对照组，Bcl-2/Bax比值同时明显低于正常对照组；小剂量ASA治疗组，Caspase-3和Bax表达均明显弱于糖尿病模型组，而Bcl-2表达明显强于糖尿病模型组，Bcl-2/Bax比值同时明显高于糖尿病模型组。3讨论近年来的大量研究表明，细胞凋亡受多基因严格控制的过程，这些基因包括Bcl-2家族、Bax家族、Caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。细胞凋亡的过程大致可分为几个阶段：在接受凋亡信号后凋亡调控蛋白间发生相互作用，促使蛋白水解酶的活化（Caspase），引起细胞膜、线粒体和染色体结构改变等一系列连续反应过程，导致细胞凋亡。Bcl-2和Bax蛋白就是一对重要的凋亡调控蛋白，它们分别与细胞凋亡呈负相关和正相关，Bcl-2/Bax比值被许多学者作为评价凋亡调控的重要指标10。直接判定凋亡细胞的指标包括流式细胞检查、Tunal染色、凋亡小体及染色体检查等，但蛋白水解酶（Caspase）的表达增强也可以作为启动凋亡的重要标志。本研究采用尾静脉注射链脲佐菌素造成1型糖尿病动物模型，免疫组化研究结果显示，糖尿病大鼠白细胞Caspase-3和Bax表达均明显强于正常对照组，而Bcl-2表达明显弱于正常对照组，Bcl-2/Bax比值同时明显低于正常对照组，这表明白细胞凋亡启动信号明显，凋亡能力增强。小剂量ASA治疗组，糖尿病大鼠白细胞Caspase-3和Bax表达均被对抗，Bcl-2表达增强，提高Bcl-2/Bax比值。这表明，小剂量阿司匹林可通过提高Bcl-2/Bax比值，抑制糖尿病大鼠白细胞凋亡过程。阿司匹林对细胞凋亡研究已有多篇报道。有报道11-13阿司匹林抑制神经细胞凋亡被认为是对神经系统缺氧/缺糖损伤重要保护机制。谢宝明等14采用流式细胞术检测线粒体膜电位技术发现，阿司匹林对缺氧/缺糖的神经元细胞线粒体膜电位具有一定的稳定作用，并认为是抑制神经元细胞凋亡的机制之一。阿司匹林对糖尿病白细胞的保护作用已见研究报道。叶琳等15研究报道阿司匹林对糖尿病大鼠白细胞有保护作用，并指出与抑制COX-2表达有关。李文通等16研究报道阿司匹林对STZ糖尿病大鼠外周血白细胞iNOSmRNA有抑制作用。本实验证实小剂量阿司匹林可调节白细胞凋亡相关蛋白的表达，可抑制白细胞凋亡，这是否会有助于恢复或提升白细胞的正常功能，尚需进一步实验研究。参考文献1李秀钧，邬红云.糖尿病是一种炎症性疾病J.中华内分泌代谢杂志，2003，19（4）：251-253.2田风胜，王元松，苏秀海.中性粒细胞与糖尿病J.山东医药，2006，46（19）：92-93.3Lo-PrestiR，SinagraD，MontanaM，etal.Polymorphonuclearleukocytemembranefluidity，atbaselineandafterinvitroactivation，inobesitywithorwithoutdiabetesmellitusJ.ActaDiabetol，2002，39（1）：29-33.4WalrandS，GuilletC，BoirieY，etal.InvivoevidencesthatinsulinregulateshumanpolymorphonuclearneutrophilfunctionsJ.JLeukocBiol，2004，76（6）：1104-1110.5OkonchiM，OkayamaN，OmiH，etal.Theantidiabeticagent，gliclazide，reduceshighinsulin-enhancedneutrophiltransendothelialmigrationthroughdirecteffectsontheendotheliumJ.DiabetesMetabResRev，2004，20（3）：232-238.6TennenbergSD，FinkenauerR，DwivediA.AbsenceoflipopolysaccharideinducedinhibitionofneutrophilapoptosisinpatientswithdiabetesJ.ArchSurg，1999，134（11）：1229-1233.7GlowackaE，BanasikM，LewkowiezP，etal.TheeffectofLPSonneutrophilsfrompatientswithhighriskoftype1diabetesmellitusinrelationtoIL-8，IL-10andIL-12productionandapoptosisinvitroJ.ScandJImmunol，2002，55（2）：210-217.8邱丽颖，余涓，陈崇宏，等.阿司匹林对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响J.中国药理学通报，2004，20（2）：177-180.9邱丽颖，余涓，周宇，等.阿司匹林对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤的保护作用及机制J.药学学报，2003，38（8）：561-564.1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