第八章 细胞周期及调控.doc

第八章 细胞周期及调控内容简介1第一节 细胞周期2一、细胞周期时相2二、人体细胞的动态分类：5第二节 细胞分裂6一 、有丝分裂6二、 早期对酵母细胞周期的研究20三、 CDK 和 Cyclin 在细胞周期调控中起关键作用22四、 CDK 活性的调节26五、 细胞周期运转的调控32内容简介细胞增殖 (cell reproduction) 是一切有机体生长、繁衍的基本方式。一个成年人大约拥有万亿个细胞，这些细胞均起源于一个受精卵。受精卵经过不断的分裂、分化，最后形成完整成熟的个体。这是一个在细胞自我调控下的增殖过程。早在 100 多年前，人们就已经了解到细胞是通过分裂进行增殖的。然而，直到最近 20 年，随着细胞和分子生物学的兴起，科学家们才对细胞增殖调控的分子机制的研究取得了重要进展。 本章主要介绍细胞周期、细胞分裂及细胞周期运行过程中的调控。 第一节 细胞周期 人们认识细胞增殖是从观察细胞分裂（ cell division ）的形态开始的。在细胞增殖过程中人们首先看到了细胞的分裂和“静止”两个时期，并称之为分裂期（ mitosis ）和分裂间期 (interphase) ，分裂期简称 M 期。同时可以看到细胞在增殖过程中是呈周期性的。 1953 年 Howard 等提出了细胞周期（ cell cycle ）的概念，认为细胞从上次细胞分裂结束到下一次分裂结束的过程称为一个细胞周期。细胞周期又称细胞生活周期（ cell life cycle ）或细胞繁殖周期（ cell reproductive cycle ），即由原来的亲代细胞（ mother cell ）经过物质准备和积累，完成细胞分裂形成子代细胞（ daughter cell ）的循环过程。 一、细胞周期时相 1 、细胞周期各时相 早就知道遗传物质 DNA 的复制应当是细胞最重要的活动之一，但在细胞周期的那一时段进行的复制呢？ Howard 等人（ 1953 ）用 32 P 标记的方法观察蚕豆根尖。实验表明，复制活动并非像以前认为的那样发生在有丝分裂期，也不是充满整个分裂间期，而是在间期的一定时段进行的。现在把这一时段称作 DNA 合成期（ DNA synthesis phase ）即 S 期。又了解到在 S 期的前后分别有时间间隔（ Gap ），在 M 期之后 S 期之前的间隔叫做 G 1 期（ Gap 1 phase ）；在 M 期之前在 S 期之后的叫做 G 2 期（ Gap 2 phase ）。显然，在复制和分裂这两个重大事件发生之前都要有一个准备时间， G 1 期是准备细胞分裂的时期，而 G 2 期是准备复制的时期。这样人们明显的看到细胞周期有四个时段，它们是 G 1 期、 S 期、 G 2 期和 M 期（图 8-1 ）。 对所有真核生物而言，细胞周期的不同时相高度精确地协调着。细胞必须递次地经过细胞周期的不同时相，在完成上一个时相内的事件后，才有可能进入下一个时相 , 它们有秩序的运转使细胞增殖。 这一过程中的任何缺陷将导致染色体发生变异，染色体或部分染色体可能丢失、重排或非平均地分配到子代细胞中，这种染色体变异常见于肿瘤细胞。 然而，不同种类细胞的细胞周期时间有很大的差异。比如小鼠食管细胞周期时间是 115 小时，而小鼠十二指肠细胞仅 15 小时。进一步研究表明，这种细胞周期时间上的差别主要取决于 G 1 期的长短。如上例，小鼠食管上皮细胞 G 1 期长达 103 小时而十二指肠细胞 G 1 期仅为 6 小时。而 M 期的时间各细胞之间相差不大，常常是在半小时左右。但一般来讲，在多数哺乳动物细胞中，细胞周期的时间为 10 30 个小时。 2 、细胞周期各时期的主要活动 复制和稳定的遗传应当是生命最本质的现象，作为生命载体的细胞主要行使的也是复制和遗传这两种功能。这两种功能是在细胞周期的 S 期和 M 期实施完成的。实际上 G 1 期主要是为 S 期做准备，而 G 2 期主要是为 M 期做准备。 图 8-1 细胞周期的四个连续时期（引自 Karp,2002 ） （ 1 ）、 G 1 期 G 1 期，又称合成前期，是细胞分裂后子代细胞进入的第一个时期。该期开始合成细胞生长所必需的各种蛋白质、糖类和脂类等物质。 （ 2 ）、 S 期 S 期，即 DNA 合成期，是细胞生命活动的重要时期。 S 期的初期急剧合成 DNA 聚合酶和四种脱氧核苷酸，然后主要合成 DNA ，同时也合成组蛋白和 DNA 所需要的其它酶类。 在 DNA 复制时，一般常染色质 DNA 的复制早于异染色质 DNA 的复制；能转录的 DNA 复制早于不能转录的 DNA 复制； GC 含量高的 DNA 复制早于 AT 含量高的 DNA 复制。合成后的 DNA 立即和组蛋白结合，形成核小体串珠结构。 S 期 DNA 的精确复制为 M 期的遗传物质的平均分配打下了基础。 DNA 的复制一旦发生错误，可导致畸形细胞的产生。 （ 3 ）、 G 2 期 G 2 期，即合成后期。该期细胞核内的 DNA 含量已经增加一倍，主要合成大量的 ATP 、 RNA 、蛋白质等，为进入 M 期做准备。 （ 4 ） M 期 M 期，即细胞分裂期，和 S 期一样是细胞周期的重要时期。该期发生大量的变化，主要有 RNA 合成停止，蛋白质合成减少；细胞染色体凝集，高度螺旋化；出现纺锤体；染色体分离，平均分配到两个子细胞中。因为 M 期要保证细胞遗传物质平均分配到子细胞中去，避免遗传失衡使细胞畸变。根据其变化，又人为地划分为前期（ prophase ）、前中期（ prometaphase ）、中期（ metaphase ）、后期（ anaphase ）、末期（ telophase ）和胞质分裂（ cytokinisis ）（图 8-1 ）。 3 、细胞周期各时期 DNA 含量 在细胞周期中复制和分裂这两个事件导致了各时段 DNA 含量的差异。在细胞周期中复制和分裂虽然在时间上有间隔。但在事件发生上是有因果关系的两个连续的过程。除了个别细胞比如果蝇唾液腺等细胞外，细胞周期的 S 期发生后细胞就会走向 M 期。也就是说，在一般情况下， DNA 复制必然导致细胞分裂。而分裂后的细胞却不一定走向复制，它们可能走向分化、衰老或死亡。这样看来成熟个体的体细胞一般都停留在 G 1 期，我们常见的物种染色体或 DNA 含量的表示，是指该物种 G 1 期细胞染色体或 DNA 的含量。 G 1 期细胞是亲代分裂而来的子细胞，由于它含有来自父母本的两套基因组，所以我们用 2C 或 2n 表示它的 DNA 含量，用 2n 表示它的染色体含量。在 S 期， DNA 逐渐复制，所以细胞 DNA 的含量逐渐增加，从 2C 或 2n 增加到 4C 或 4n 。因此， S 期的 DNA 的含量是 2C -4C ， G 2 期 DNA 含量是 4C ， M 期 DNA 的含量是 4C -2C （图 8 -2 a ）。在减数分裂过程中，细胞只经历了一次 S 期却经历了两次 M 期，第一次 M 期 DNA 的含量是 4C -2C ，第二次 M 期 DNA 的含量是 2C -1C （图 8-2 b ）。所以最终产生停留在 G 1 期的子细胞的 DNA 含量只有 1C 或 1n 形成了只含单倍体基因组配子细胞。比如 , 某一真核细胞染色体数 2n = 14 ，这时的 DNA 含量是 2C 。实际反映的是细胞在 G 1 期的情况。 a 有丝分裂中 DNA 含量 b 减数分裂中 DNA 含量 图 8-2 细胞周期各时期 DNA 含量 二、人体细胞的动态分类： 根据细胞的增殖能力、分化程度、生存时间，可将人体的组织细胞分为 4 类： 1 、 更新组织细胞：执行某种功能的特化细胞，经过一定时间后衰老死亡，由新细胞分化成熟补充。如上皮细胞、血细胞，构成更新组织的细胞。可分为类： 干细胞：能进行增殖又能进入分化过程，有时称 周期中细胞（ cycling cell ） 。 过渡细胞：来自干细胞，是能伴随细胞分裂趋向成熟的中间细胞。 成熟细胞：不再分裂，经过一段时间后衰老和死亡。 2 、 稳定组织细胞：是分化程度较高的组织细胞，功能专一，正常情况下没有明显的衰老现象，细胞分裂少见，但在某些细胞受到破坏丧失时，其余细胞也能进行分裂，以补充失去的细胞，如肝、肾细胞。有时称 G 0 期细胞，又称静止期细胞（ quiescent cell ）、 体眠细胞。 3 、 恒久组织细胞：属高度分化的细胞，个体一生中没有细胞更替，破坏或丧失后不能由这类细胞分裂来补充。有时称终端分化细胞，如神经细胞、骨骼细胞、肌纤维细胞和多型核白细胞。 4 、 可耗尽组织细胞：如人类的卵巢实质细胞，在一生中逐渐消耗，而不能得到补充，最后消耗殆尽。第二节 细胞分裂细胞分裂包括三种分裂方式：无丝分裂（ amitosis ），有丝分裂（ mitosis ），减数分裂（ meiosis ）。主要是后两种。有丝分裂是细胞的基本分裂方式，而减数分裂是生殖细胞形成过程中的特异分裂方式。 一 、有丝分裂 有丝分裂，又称间接分裂（ indirect division ）， 由 W. Fleming (1882) 年首次发现于动物及 E. Strasburger （ 1880 ）年发现于植物。特点是有纺锤体染色体出现，子染色体被平均分配到子细胞，这种分裂方式普遍见于高等动植物。 有丝分裂是细胞周期的 M 期进行的分裂活动。 DNA 复制后的细胞是靠有丝分裂把遗传密码平均准确的传递给子代的。这是细胞生命延续的基本保证。在光学显微镜下就可以观察到的细胞分裂给人们以强烈的动感效果。这不但使人们看到了生命细胞的活力而且意识到调控细胞分裂应当是精密和复杂的。而我们目前的论述仍以细胞的形态结构为主。 很早就有人根据形态学的观察将细胞的有丝分裂过程划分 前期、前中期、中期、后期、末期和胞质分裂六个时期。（图 8-3 ） 图 8-3 有丝分裂各时期（引自 Karp,2002 ） 1 、前期 前期是有丝分裂的第一个时期，其主要活动特征有： （ 1 ） 染色质浓缩，实际是线性染色质进一步的螺旋、折叠使之变短变粗，形成可见的早期染色体。此时一个着丝粒（ centromere ）上两条染色单体。 （ 2 ）在着丝粒处逐渐装配动粒（ kinetochore ）。着丝粒是染色体的永久部分，是染色体主缢痕部分的染色质，是由高度重复序列 DNA 构成的。 （ 3 ）以中心体为核心的微管向四周发射，中心体及其周围的微管一起被成为星体（ aster ）。两个星体向两极移动。（图 8-4 ） （ 4 ）核仁逐渐消失。 图 8-4 前期两个中心体向两极移动形成纺锤体（引自 Karp,2002 ）2 、前中期 核膜破裂是前中期开始的标志，其主要活动特征有： （ 1 ）核膜破裂，转化为小囊泡。 （ 2 ）主要由微管构成的纺锤体（ spindle ）在两个星体之间装配形成。显然星体参与了纺锤体的装配。 （ 3 ）染色体继续变短变粗，并剧烈运动。 （ 4 ）纺锤体开始“捕获”染色体，与染色体侧面的动粒相互作用。此时，纺锤体中有两种微管：动粒微管（ kinetochore microtubule ）、极微管（ polar microtubule ）。另外再两端还有星体微管（ astral microtubule ）。（图 8-5 ） 3 、中期 从染色体排列到赤道面上到姐妹染色单体开始分向两极的一段时间，纵向观动物染色体呈辐射状排列（图 8-6 ）。染色体两边的牵引力就像拔河一样达到平衡。其主要活动特征有： (1) 中期最显著的特征是染色体排列在赤道板 (equatorial plate) 上。染色体队列（ chromosome alignment ）的速度非常快。 (2) 组成纺锤体微管的数量不同种的细胞差别很大。少的仅有几十根甚至十几根，多的可达成千甚至上万根。结合到染色体动粒上的微管的数量也不同，多者可达几十根。 4 、后期 后期开始的标志是排列在赤道面上的每条染色体的姐妹染色单体分离，子代染色体向分 别向两极移动。 后期大致可分为前后两个阶段：后期 A 和后期 B 。 后期 A ，指染色体向两极移动的过 图 8-5 动物细胞的纺锤体（引自 Karp,2002 ） 图 8-6 中期（右图显示与染色体联接的微管） 程。其主要活动特征有：动粒微管变短，染色体逐渐向两极移动。后期 B ，指两极间距离拉大的过程。此时，极微管长度增加，两极之间的距离逐渐拉长。 5 、末期 当子染色体到达两极后，标志末期开始。其主要活动特征有： （ 1 ）染色体解螺旋转变成染色质。 （ 2 ）核膜前体小囊泡重新组装成核膜。 （ 3 ）出现新的核仁。 （ 4 ）动粒微管消失，极微管继续加长，星体微管开始加长。 6 、胞质分裂 胞质分裂开始于有丝分裂后期，完成于有丝分裂末期。前几个时期进行核分裂，胞质分裂是将细胞中的其它物质，如：各种细胞器、细胞骨架、可溶性蛋白等分配到两个子细胞中。 胞质分裂开始时，动物细胞是在赤道板周围细胞表面内陷，形成环形缢缩即分裂沟（ furrow ）。有实验显示，极微管与星体微管参与了分裂沟的形成。大量的肌动蛋白和肌球蛋白在分裂沟处装配成收缩环（ contractile ring ）。通过微丝滑动，收缩环收缩直到收缩环处细胞膜融合，细胞质一分为二（图 8-7 ）。 图 8-7 动物细胞的胞质分裂（引自 Karp ， 2002 ） 胞质分裂时，高等植物细胞是靠在细胞内形成新细胞壁而将细胞质一分为二的。在新细胞壁形成过程中，携带有细胞壁前体物质的高尔基体膜泡沿微管向赤道板方向移动，并融合成初级细胞板（ early cell plate ）。由细胞板向两侧扩大直到与原有细胞质膜融合，形成新细胞壁将细胞质分成两部分（图 8-8 ）。二、减数分裂 真核生物的减数分裂行为的出现是生命发展和进化过程的一个奇迹。它不但使配子细胞的 DNA 量和染色体数减少一半，解决了有性生殖合子可能遗传物质过重的负累。而且还在 图 8-8 植物细胞的胞质分裂（引自 /book/ ） 很大程度上丰富了物种的基因组，为生物物种产生广泛的变异奠定了基础。 减数分裂最主要的特征是：细胞中 DNA 分子只复制一次，而细胞连续分裂两次。两次分裂分别称为减数分裂期 I 和减数分裂期 II 。在两次分裂还有一个短暂的分裂间期。因此，把减数分裂前的间期称为分裂前间期（ premeiotic interphase ）。由于细胞核连续分裂分裂两次，结果所产生的子细胞中染色体数目减少了一半（图 8-9 ）。 1 、减数分裂前间期 减数分裂前间期与有丝分裂间期有相似之处，都分为 G 1 、 S 、 G 2 三个时期。但也有其明显的特点：（ 1 ） S 期持续的时间比较长，如蝾螈体细胞有丝分裂 S 期大约 12 小时，而减数分裂前 S 期持续 10 天左右。（ 2 ） 在有些物种中发现，减数分裂前间期的 S 期只复制 DNA 总量的 99.7%99.9% 左右，剩余的要到细胞进入减数分裂前期后才复制。研究表明，延迟复制的 DNA 分布在整个基因组，形成 500010000 个小片段。据认为，这些片段所以延迟复制是和减数分裂前期的染色体配对及基因重组有关。 减数分裂前间期经过 S 期 DNA 复制后，要经过两次连续的细胞分裂。最后 , 一个 DNA 含量为 4C 的合子细胞变成了四个 DNA 含量为 1C 的配子细胞。这一过程要比有丝分裂复杂的多。 图 8-9 减数分裂过程及 DNA 数目变化（引自 Lodish ， 2003 ）2 、减数第一次分裂 减数分裂 I 和有丝分裂比无论在形态上还是在实际意义上都有很大的差异。这些差异主要表现在第一次减数分裂 I 的前期，即减数分裂前期 I 。第一次减数分裂过程又认为地划分为前期 I 、中期 I 、后期 I 、末期 I 。 （ 1 ）、前期 I （ prophase I ） 前期 I 变化最为复杂，持续时间较长，细胞核明显增大，同源染色体进行配对交换等。此外，还合成一定量的 RNA 和蛋白质。根据细胞形态变化，又人为地将前期 I 划分为细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期五个阶段。 必须注意的是这 5 个阶段本身是连续的，它们之间并没有截然的界限。 细线期（ leptotene stage ）：又称凝集期（ condensation stage ）。染色体呈细线状，染色质纤维逐渐折叠和螺旋化， 但光镜下分辨不出两条染色单体。 有些物种，比如玉米的染色体上可以看到大小不同的颗粒状结构。这种结构被称为染色粒（ chromomere ）。还有的物种染色体的端粒（ telomere ）通过接触斑与核膜相连，使染色体装配成花束状，因此有人将细线期称为花束期 (bouquet stage) 。 偶线期（ zygotene stage ）：又称配对期（ pairing stage ）。这个时期的主要活动有： 染色质进一步凝聚，同源染色体 (homologous chromosome) 配对 (pairing) ，形成被叫做二价体 (bivalent) 的结构。两个复制后的同源染色体结合成二价体，这个二价体实际上是由四条染色单体构成的，因此又可称为四分体 (tetrad) 。同源染色体配对的过程叫联会 (synapsis) 。在同源染色体联会的部位形成一种特殊的结构，称为联会复合体 (synaptonemal complex ， SC) 。 由于减数分裂前间期的 S 期只复制 DNA 总量的 99.7% 左右，剩余的 0.3% 的 DNA 还需要合成，这剩余的未合成的 DNA 的绝大部分是在偶线期合成的。因此有人称这差不多 0.3% 的 DNA 为偶线期 DNA （ zygDNA ）。如果用 DNA 合成抑制剂抑制 zygDNA 的合成，联会复合体的形成也将受到抑制。 粗线期 (diplotene stage) ：又称重组期（ recombination stage ）。该期开始于同源染色体配对完成之后，染色体继续变短变粗。另外还有以下主要的活动： 同源染色体紧密结合，联会复合体中间出现重组结（ recombination nodule ）（图 8-10 ），等位基因之间交换重组，从而产生新的等位基因组合。 要合成一小部分尚未合成的 DNA ，这些 DNA 被称为 P-DNA 。它们主要编码一些和 DNA 修复有关的酶类。 粗线期将合成减数分裂期专有的组蛋白，并将体细胞类型的组蛋白替换下来。 图 8-10 联会复合体（示重组结）（引自 Karp ， 2002 ） 双线期（ diplorene stage ），主要活动特征有： 联会的同源染色体开始相互分离 ，染色体去凝集，形成多个核仁并进行 RNA 活跃地合成，有些动物，特别是鱼类、两栖类等，还形成一种形似灯刷的巨大染色体叫灯刷染色体 (lampbrush chromosome) 。 二价体中同源染色体开始分开，但在某些部位相互间仍有接触点，称为交叉 (crossover) （图 8-11 ）。 此期持续时间很长，短则几周、几月，长可达几十年。如：人卵母细胞的双线期最长可达 50 年。 终变期 (diakinesis stage) ，又称再凝集期（ recondensation stage ）。其主要活动特征有： 、染色质再次凝集成棒状染色体，灯刷染色体也不例外，其侧环回缩， RNA 转录停止。 、核仁消失，四分体较均匀地分布在细胞核中。 、交叉向染色体臂的端部移动，这个过程称为端化（ terminalization ）。 、像有丝分裂一样，已复制的中心体移向两极。 、核膜破裂标志前期 I 的完成。 A 、 B 光学显微镜照片及模式图 C 扫描电子显微镜照片 图 8-11 双线期的染色体交叉（引自 Karp ， 2002 ） （ 2 ）、中期 I （ metaphase I ） 前期 I 结束，第一次减数分裂进入中期 I 。在这个过程中主要活动特征有： 、 纺锤体进行组装，纺锤体微管侵入细胞核区，捕获分散在核中的四分体。 、每个四分体有四个动粒，一条染色体上的两个动粒位于一侧，即从纺锤体一极发出的微管只能与一条染色体的两个动粒相互作用。 、在染色体动粒的作用下，四分体最终排列在赤道面（ equatorial plane ）上。这些过程虽然和有丝分裂过程相似，但意义却相差很大。 （ 3 ）、 后期 I （ anaphase I ） 该期主要活动特征有： 、同源染色体分离，在纺锤体的作用下逐渐移向两极。 、到达每一极的染色体数量是细胞中染色体总数的一半。 、不同四分体间的非同源染色体在移向两极时是随机组合的。 移向两极的染色体是联会时的同源染色体之一，它们是均由两条染色单体构成的。从染色体数和 DNA 含量来看和有丝分裂后期的细胞比较应当是一样的。但拉向两极的染色体组成却有很大差别，有丝分裂分向两极的染色体组成完全一致，而减数分裂后期 I 拉向两极的染色体组成呈现了广泛的多样性，如人类细胞有 23 对染色体，那么在减数分裂后期 I 过程中所产生的染色体组成的形式可达 2 23 。另外，交叉互换基因重组，都为生物的变异提供了广泛的遗传基础。 （ 4 ）、末期 I （ telophase I ）和减数分裂间期（ intkinesis ） 在末期 I ，细胞的变化主要有两种类型：一是完全逆转到间期核的状态。即：染色体去凝集，形成核膜、核仁，胞质分裂进入短暂的分裂间期。二是没有回复到间期的过程，立即进行减数第二次分裂。含量为 4C 的合子细胞变成了四个 DNA 含量为 1C 的配子细胞。这一过程要比有丝分裂复杂的多。 3 、减数第二次分裂 减数第二次分裂和有丝分裂在形式上没有什么不同，但意义上却不一样。减数第二次分裂的本质是把细胞 2n 的染色体或 2C 的 DNA 转变成生殖细胞 1n 的染色体或 1C 的 DNA ，真正实施了遗传物质减半。形成了只含一个染色体组或基因组的配子。 雄性配子与雌性配子的产生有几点区别：（ 1 ）胞质分裂时，雄性生物的细胞质是均等分裂的，而雌性生物的细胞质是不均等分裂的，能产生极体。（ 2 ）经过一次减数分裂，雄性能产生 4 个雄配子，而雌性只能产生 1 个有功能的配子。第三节 细胞周期的调控 细胞周期的最主要的功能是将其基因组 DNA 在 S 期完整地复制成两份拷贝，而后在 M 期将这两份拷贝正确无误地分配给两个子代细胞。如果在这一过程中产生错误，又得不到及时纠正，那么将导致基因组的不稳定和变异。对多细胞生物来说不但会导致细胞增殖能力下降还会引起细胞转化甚至死亡。 人们比较早的认识了细胞周期各时段的细胞形态和所发生的事件。但是什么机制调控细胞周期有条不紊地运行，科学家们在近些年来才取得一些突破性的成果。特别是美国科学家利兰哈特韦尔 (Leland H. Hartwell), 英国科学家蒂莫西亨特 (R. Timothy Hunt) 和保罗纳斯 (Paul M. Nurse) ，由于他们 在有关调控细胞循环周期的研究中做出重要发现 而共同荣获 2001 年度诺贝尔生理学或医学奖。 4、发现 M 期促进因子 Rao 和 Johnson(1970 、 1972 、 1974) 等用 HeLa 细胞通过细胞融合试验发现，与 M 期细胞相融合的间期细胞，无论是 G 1 期、 G 2 期还是 S 期细胞，只要和 M 期细胞融合都会产生形态不同的染色体凝集现象。并称之为染色超前凝集（ premature chromosome condensation, PCC ）（图 8-12 ）。这些间期细胞的染色体被称为超前凝集染色体。不同时期的间期细胞与 M 期细胞融合，产生的 PCC 的形态各不相同。 G 1 期 PCC 为单线状，因 DNA 未复制； S 期 PCC 为粉末状，因 DNA 由多个部位开始复制； G 2 期 PCC 为双线染色体，说明 DNA 复制已完成。 这证明 M 期细胞可诱导其它时期的细胞产生 PCC ，推测在 M 期细胞中可能存在一种促使染色体凝集的因子。 1971 年， Masui 等用非洲爪蟾做了这样的实验，用孕酮诱导卵母细胞成熟并开始减数分裂，将诱导成熟的卵母细胞的细胞质少量注射到一些新的卵母细胞中，可以诱导新卵母细胞成熟。新的卵母细胞的细胞质可以进一步诱导更新卵母细胞成熟。 Masui 等明确提出了诱导细胞成熟的因子是成熟促进因子 (maturation promoting factor ， MPF) 这一概念。 进一步的研究发现，如果有蛋白质合成抑制剂的存在孕酮就不能诱导卵母细胞成熟。这 说明孕酮的作用是促进了某种蛋白质因子的合成。如果直接用成熟卵母细胞细胞质做诱导， 既使有蛋白质合成抑制剂的存在也可诱导卵母细胞成熟。这说明在成熟卵母细胞细胞质中已经有了某种蛋白质因子的存在。研究者提出，成熟卵母细胞细胞质中的因子应当是细胞促分裂因子（ mitosis-promoting factor ）或 M 期促进因子（ M phase-promoting factor ）即 MPF 。 M 期细胞与 G 1 期细胞融合 图 8-12 早期染色体凝集实验（引自 Lodish ， 2003 ） 不过只是处于非活性状态，被称为前体 MPF （ preMPF ），通过修饰后可以转化为活性态的 MPF 。后来通过实验发现，所有实验过的动物细胞中都存在 MPF ，说明这种因子是普遍存在的。 1988 年科学家们进行了 MPF 的纯化工作有了结果，分离获得了 p32 和 p45 两种蛋白。 P32 和 p45 结合后表现出蛋白激酶的活性。 二、早期对酵母细胞周期的研究 哈特韦尔（ Hartwell ）早在 60 年代就认识到了用遗传学方法研究细胞周期的可能性。他选择面包师用的酵母即芽殖酵母（ S. cerevisiae ）细胞作为研究材料。事实上酵母非常适合于细胞周期的研究。 Hartwell 等运用多种温度敏感突变株，设计了一系列精巧的实验，从中分离出一系列酵母细胞突变株。这些细胞株由于细胞周期调控基因发生改变，它们失去了正常分裂繁殖的能力。不同基因的突变形成的突变体是不同的，这些突变细胞在细胞周期中所停留的时期以及细胞所表现出的形态结构也往往是不同的。哈特韦尔对不同突变体进行综合分析。通过这种方法，他成功地得到了 100 多种参与细胞周期调控的基因，称为细胞分裂周期（ cell division cycle ）基因，即 cdc 基因。确定了在酿酒酵母细胞分裂周期中一些 cdc 基因可能的作用。迄今为止，已被克隆的芽殖酵母 cdc 基因有 cdc8 ， cdc24 ， cdc9 ， cdc28 和 cdc31 等等。其中的 cdc28 基因调控细胞周期通过 G 1 期的第一步，因而被称为 start 基因。这个基因的突变使细胞停留在 G 1 /S 交界处，因此知道 start 基因能够控制 G 1 期向 S 期的转化。哈特韦尔还提出了“检验点（ checkpoint ）”这一概念。所谓检验点，是指 DNA 一旦受到损伤，细胞周期就会暂时停滞下来，保证细胞在顺利进入下一个时相前，就可获得足够的时间来修补受到损伤的 DNA 。后来，哈特韦尔还将检验点的概念扩展到保证细胞周期各时相运转顺序的调控机制中。 保罗纳斯（ Paul Nurse ）延续了 Hartwell 的研究工作。他使用另一种酵母裂殖酵母（ S.pombe ）作为研究对象，这种酵母同哈特韦尔用的芽殖酵母在亲缘关系上相当远，它们在 10 亿年前就在进化的过程中分离了。纳斯使用的仍然是遗传学方法（图 8-13 ）。 70 年代中期，他发现了 cdc2 基因，这种基因在细胞分裂的调控（从 G 2 期向 M 期转化）中起着重要作用；后来，他又发现 cdc2 还有一个功能，同哈特韦尔早先发现的 start 基因一样能够控制 G 1 期向 S 期的转化。后来研究发现 cdc2 基因能调控细胞周期的不同时相。 图 8-13 裂殖酵母 cdc2 突变的表型（引自 Lodish ， 2003 ） 第一个被发现的 cdc 基因是 cdc28 它的表达产物是 p34 cdc28 。它在细胞周期 G1/S 的转换中起中心调节作用。 第一个被分离出来的 cdc 基因是 cdc2 。 cdc2 基因的表达蛋白为 p34 cdc2 。 p34 cdc2 具有蛋白激酶活性，能使多种底物磷酸化。它具有双重功能，在 G 1 /S 之前对细胞的启动和 G 2 /M 的转换都有调节作用。 蒂莫西亨特（ Timothy Hunt ）在 20 世纪 80 年代早期用海胆作为研究细胞周期的材料，他在实验中发现细胞周期中有种蛋白质分子周期性地生成，然后降解。因为这些蛋白质的水平在细胞周期中发生着周期性的变化所以称这种蛋白为 Cyclin 即周期素或周期蛋白。后来，这些周期蛋白很快便被分离和克隆出来，并被证明广泛存在于从酵母到人类等各种真核生物中。目前在人体中已发现了多种不同的周期蛋白。周期蛋白与 cdc 基因表达的蛋白结合形成复合物才有激酶活性。 进一步研究发现， p34 cdc2 和 p34 cdc28 是同源物，但它们本身并不具有激酶活性，只有当有关蛋白结合后，其激酶活性才能够表现出来。 P34 cdc2 必须和周期蛋白 p56 cdc13 结合才能表现出蛋白激酶的活性。一旦 p34 cdc2 表现出激酶活性，则可直接或间接诱导一系列底物的磷酸化。 至此，在酵母细胞周期调控中起关键作用的 MPF 的化学成分被确定下来： 周期蛋白是调节亚基， cdc 基因的表达产物为催化亚基。只有两者结合后，才能表现出蛋白激酶活性三、 CDK 和 Cyclin 在细胞周期调控中起关键作用 通过最初对酵母的研究，后来人们对包括人在内的其它真核细胞的周期调控研究也有突破性进展。 1987 年，保罗纳斯从人体中分离得到与酵母 cdc2 同源的基因，该基因的编码产物为周期蛋白依赖性蛋白激酶（ cyclin-dependent kinase ）蛋白家族中的一员。后来把这些产物命名为 CDK （周期蛋白依赖性激酶）。纳斯还发现 CDK 的激活依赖于可逆的磷酸化作用。此后，他在人体中又发现了多种不同的 CDK 分子。 1 、 CDK 的催化功能 CDK 是 cdc 基因编码合成的一种细胞周期蛋白依赖性激酶。激活的 CDK 可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应，如：激活的 CDK1 将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将组蛋白 H 1 磷酸化导致染色体的凝缩等等，这些效应的最终结果是细胞周期的不断运行。 由于 cdc2 基因是第一个分离出来的 cdc 基因，所以它的表达产物 P34 cdc2 被称为 CDK1 。但习惯上有资料用 Cdc 表示 cdc 基因的产物。如： Cdc2 表示 cdc2 基因的产物，其实质就是 CDK1 。 后来对哺乳动物研究发现了与 cdc2 相关的基因，对其产物分析都具有激酶活性，将它们统称为 CDK 激酶。目前在哺乳动物细胞中已发现并命名的有 CDK1 、 CDK2 、 CDK3 、 CDK4 、 CDK5 、 CDK6 、 CDK7 、等。 CDK1 即 Cdc2 ，因它是第一个被发现，而其它几种 CDK 激酶都是与其相比较而得来的。而在酵母细胞中只有一种 CDK 即 CDK1 ，其在裂殖酵母中就是 Cdc2 ，在芽殖酵母中就是 Cdc28 。 CDK 激酶有两个共同特点：一是它们含有一段类似的氨基酸序列，二是它们的活性只有在与细胞周期蛋白结合后才能表现出来。因此，被喻为细胞周期的“发动机”。 2 、 Cyclin 的调节作用 1983 年 ， Evans 等首次报道了细胞周期蛋白。后来很快清楚了细胞周期蛋白的调节作用，细胞周期蛋白起激活 CDK 的作用，还决定了 CDK 何时、何处、将何种底物磷酸化，从而推动细胞周期的运行。 从 1988 年以来，在不同种类生物，或同一种类生物的研究中，发现了多种细胞周期蛋白，如：在高等动物细胞中，有细胞周期蛋白 A 、 B 、 C 、 D 1 、 D 2 、 D 3 、 E 、 F 、 G 、 H 等。在芽殖酵母细胞中有 Cln1 、 Cln2 、 Cln3 、 Clb1Clb6 等，细胞周期蛋白为调节亚基， CDK 为催化亚基。正是由于不同的细胞周期蛋白和不同的 CDK 激酶的结合、分离，磷酸化与去磷酸化，激活催化亚基的激酶活性，被称为驱动细胞周期运转的 “变速器” 。 图 8-14 部分周期蛋白分子结构模式图 细胞 周期蛋白是在不同的时相发挥功能的，如：在 M 期表现出调节功能的就称它们是 M 期周期蛋白，如：周期蛋白 A 、 B 等。在 G 1 期表现出功能的称 G 1 期周期蛋白，如：周期蛋白 C 、 D 、 E 、 Cln1 、 Cln2 、 Cln3 ， 是指在 G 1 期和 G 1 /S 交界处发挥作用、启动细胞周期并能促进 DNA 复制的细胞周期蛋白。 但各种周期蛋白有着基本相同的结构。它们都有一个周期蛋白框 (cyclin box), 是由 100 150 个氨基酸 残基 的保守区 构成的，它的功能是介导细胞周期蛋白和 CDK 结合。有的周期蛋白还具有介导自身降解的结构，如： M 期周期蛋白在 N 端含有 9 个氨基酸构成的破坏框（ destruction box ）。而 G 1 期周期蛋白没有破坏框却在 C 端有一个被称为 PEST 序列的结构（图 8-14 ）。 研究发现，在哺乳动物细胞中，不同的 CDK 只能与相应的 Cyclin 结合才能使它们在不同时期表现出激酶活性。如： C 、 D 、 E 、 Cln1 、 Cln2 、 Cln3 等只能在 G 1 期表达并只在 G 1 /S 转化过程中执行调节功能。几种 Cyclin 与 CDK 的结合关系及执行功能的时期，如：表 8-1 。 表 8-1 几种 Cyclin 与 CDK 的结合关系及执行功能的时期（表中酵母细胞指芽殖酵母） 图 8-15 Cyclin-CDK 复合物在细胞周期中的作用（引自 Karp ， 2002 ） 3 、 Cyclin-CDK 复合物 CDK 激酶单独在细胞内没有活性，只有与 Cyclin 结合后形成 Cyclin-CDK 复合物，所以有人把 CDK 称为“发动机”，即 驱动细胞周期运转的引擎。 把 Cyclin 称为“变速器”或“ 齿轮箱” 。 CDK 分子作为引擎，而细胞周期蛋白可以作齿轮箱以控制引擎处于空转状态或者驱动细胞继续分裂。 Cyclin-CDK 复合物调节细胞内一系列磷酸化等反应，来推动细胞周期运转。因此 ，不同的 Cyclin-CDK 复合物的活性被激活，推动细胞不同时期地运转。如：在酵母细胞中， Cyclin-CDK 复合物的作用（图 8-15 ）。四、 CDK 活性的调节 1 、周期蛋白浓度变化 Cyclin-CDK 复合物的活性在细胞周期中周期性地运转，而 CDK 在细胞内是相对稳定的，主要原因之一是 Cyclin 在细胞内周期性地合成与降解。因此，以周期蛋白为调节亚基的 CDK 激酶的活性就不断发生变化。如：图 8-16 ，显示了 MPF 的活性与细胞周期蛋白一样在细胞周期中呈周期性变化。 图 8-16 周期蛋白与 MPF 活性在细胞周期中的变化（引自 Karp ， 2002 ） 在哺乳动物细胞中， G 0 期细胞没有 Cyclin ，也没有 cdc 基因表达，因此不能增殖。在 G 1 期， CyclinD 合成，与 CDK4/6 结合成复合物。该复合物被激活，使一些转录因子磷酸化而活化，促进 CyclinE 的积累。然后 CyclinE 激活 CDK2 ，促使与 DNA 合成有关的基因表达，细胞就由 G 1 期进入 S 期。在 S 期 CyclinD 和 CyclinE 逐渐被降解， CyclinA 积累达最大值，与 CDK2 结合调控 DNA 的复制。当细胞从 S 期进入 G 2 期后， CyclinB 开始积累并与 CDK1 结合形成复合物，由 CyclinB-CDK1 主要细胞进入 M 期及 M 期一系列事件。 M 期 CyclinB-CDK1 活性达最大后， CyclinB 逐渐被降解，细胞进入下一细胞周期。 因此，细胞周期中， Cyclin 周期性地表达、积累和降解，不同 Cyclin 浓度的变化调节不同 CDK 的活性，从而来实现细胞周期的运转。 2 、调控中的磷酸化 / 去磷酸化 从酵母细胞到哺乳动物细胞中，都存在 CDK 与周期蛋白结合后并非都表现出其激酶活性，即仅有周期蛋白结合并不能使 CDK 激酶完全活化。更精细的活化机制以磷酸化 / 去磷酸化为主。 在裂殖酵母和哺乳动物细胞周期的 G 2 期， CyclinB 和 CDK1 结合后，形成的复合物 CyclinB-CDK1 并没有活性。为了激活该复合物，需要另一种激酶 CAK （ CDK-activating kinase ）催化 CDK 上的第 161 位的苏氨酸（ Thr161 ）残基磷酸化，但在 Thr161 被磷酸化的同时，另一种抑制激酶 weel 催化 CDK 上 Tyr15 磷酸化。因此，此时 CyclinB-CDK1 复合物仍然没有活性。直到 G 2 期末由一种磷酸酶 Cdc25 使 Tyr15 去磷酸化， CyclinB-CDK1 复合物才有活性，使细胞进入 M 期（图 8-17 ）。 Weel 激酶使 CDK 上 Tyr15 磷酸化与磷酸酶 Cdc25 使 Tyr15 去磷酸化使 CDK 激酶活性相互平衡，共同调节 CyclinB-CDK1 复合物的活性。这样既可以使细胞快速进入 M 期，又可以防止细胞过早进入 M 期。 另外， CyclinE 和 CDK2 复合物使 DNA 复制的启动因子磷酸化而被激活，促使细胞周期进入 S 期。当 MPF 的活性达到最高峰时，促使后期调控复合物（ APC ）磷酸化而被激活。 在 G1 期的后期， APC 去磷酸化而失活。 图 8-17 细胞周期中 CDK 的磷酸化 / 去磷酸化（引自 Karp ， 2002 ） 3 、 CDK 抑制蛋白的作用 CDK 抑制蛋白（ CDK inhibitor , CKI ）是对 CDK 活性起负调控作用的蛋白质。目前，已发现多种 CKI 。 CKI 通过与 Cyclin-CDK 复合物结合来抑制其活性。 在芽殖酵母中，有一个 CDK 抑制蛋白被称为 Sic1 ，它主要是与 S 期周期蛋白（ Clb5 、 Clb6 ）与 CDK1 （ Cdc28 ）形成的复合物结合，该复合物主要调节 S 期的各种事件，被成为促 S 期因子（ S-phase-promoting factor ,SPF ）。 Sic1 与 SPF 结合后而使 SPF 失活，阻止细胞进入 S 期。 在哺乳动物细胞中，目前发现的 CDK 抑制蛋白 主要有两个家族：一是 Kip(Kinase inhibition protein) 家族，如： P21 、 P27 、 P57 。 此类 能抑制大多数 CDK 的激酶活性，如 P21 是一种 CDK4 抑制蛋白，在 DNA 受损时，受损的 DNA 使 P53 活化，致使 P21 转录，引起细胞周期被阻止在 G 1 期。 P21 还能与 DNA 聚合酶 的辅助因子 PCNA （ proliferating cell nuclear antigen ）结合，直接抑制 DNA 的合成（图 8-18 ）。 P27 在细胞外 TGF- 诱导下表达增加，与 CyclinE-CDK2 复合物结合，抑制其活性，阻止细胞进入 S 期。 二是 Ink4(Inhibitor of CDK4) 家族，如： P15 、 P16 、 P18 、 P19 等 。 P15 、 P16 都能使细胞被阻止在 G 1 期。 CKI 抑制 Cyclin-CDK 复合物的活性，也就是抑制细胞增殖，它们与促进细胞周期的因素相互协调，共同控制细胞周期的运行。4 、泛素（ ubiquitin ）介导蛋白质的降解 泛素由 76 个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径，泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。 因此，有人把泛素称为“标签分子”。 最初认为蛋白质是被溶酶体所分解，现在已清楚泛素参与了这些蛋白质的降解。 泛素化途径不仅能降解变性的、异常的或短命的蛋白质，而且能降解诸如细胞周期蛋白、 CDK 抑制蛋白、 p53 、 c-Jun 和 c-Fos 等天然蛋白质。目前研究 已经有大的进展，两名以色列科学家阿龙 - 西查诺瓦、阿弗拉姆 - 赫尔什科和一名美国科学家伊尔温 罗斯，由于在泛素介导的蛋白质降解方面的 卓越成就而共同荣获 2004 年度诺贝尔化学奖。 在细胞周期调控中， 泛素介导蛋白质的降解包括两方面：对 M 期细胞周期蛋白的降解 和对 CDK 抑制蛋白及其它周期蛋白的降解。 （ 1 ）、泛素介导的对 M 期周期蛋白的降解 在细胞周期中， M 期细胞周期蛋白 N 端有 9 个氨基酸破坏框（图 8-14 ）。细胞周期蛋白 A 和 B 在细胞进入分裂期的后期不久就开始降解，促使后期一系列事件发生。这些周期蛋白的降解就是通过泛素化途径（ ubiquitination pathway ）实现的。 泛素连接到周期蛋白上需要三种不同的介导。首先，在 ATP 供能的情况下，泛素的