实验五 拟南芥t-dna插入突变纯合体的鉴定.ppt

拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定,实验目的,1熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法；2掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变体的方法。,T-DNA插入鉴定的原理,突变体鉴定的步骤,T-DNA插入基因的基因组序列；T-DNA插入方向的确定；T-DNA插入位置的确定；引物设计；PCR扩增；电泳检测。,T-DNA插入基因的基因组序列,,点击基因编号进入网页,,点击sequence viewer进入,,点击nucleotide view进入,,点击突变体编号后进入的网页,,进入网站/cgi-bin/tdnaexpress查找基因突变体及插入方向,基因方向,T-DNA方向,5引物,3引物,实验设计,引物设计,基因上面引物的设计可以通过下面提供的拟南芥网站/tdnaprimers.html进行自动生成，也可以根据自己的需要进行设计。一般进行鉴定的引物距离T-DNA插入的位置300bp以上为宜，即300+N bp。LBa1 of pBIN-pROK2 for SALK lines：TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG,植物基因组DNA的快速提取,（1）取植物叶片（拟南芥一片叶子），置于1.5ml离心管中，加入400 ml提取缓冲液；（2）用研磨棒研磨植物材料，直至缓冲液变为绿色；（3）在台式离心机上13000 rpm离心5分钟；（4）离心后将上清300 ml转移至一个新的1.5 ml离心管中；（5）在上清中加入300 ml异丙醇，混匀后于室温下13000 rpm条件下，离心5分钟；（6）弃上清后，用70%乙醇润洗沉淀，并在室温下干燥沉淀；（7）100 ml TE溶解沉淀，将制备好的样品在4保存备用。,（此方法提取的基因组DNA只适用于PCR的鉴定，不适合酶切和大片段基因的扩增）,PCR鉴定,30ml反应体系： 2ml 植物基因组DNA样品 3ml 10扩增缓冲液 0.5ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 引物1（10 mmol/L） 1ml 引物2（10 mmol/L） 用无菌水补足体积。,PCR反应条件,94 3min30循环（94/1min，55/1min，72/1min）； 72 延伸10min。注：反应条件需根据所要扩增产物的大小和引物的性质进行合适的调整。,PCR安排,每小组四个PCR反应，引物和DNA模板分别如下： 1.WT基因组模板2个PCR反应：引物分别为基因自身的5和3端引物；5引物和LBa引物。2.突变体基因组为模板2个PCR反应：引物分别为基因自身的5和3端引物；5引物和LBa引物。,046号突变体的鉴定（1-6组）,30ml反应体系1： 2 ml 植物基因组DNA样品（WT） 3 ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10mmol/L） 1 ml 046 5引物（10mmol/L） 1 ml 0463引物（10mmol/L） 30ml反应体系2： 2 ml 植物基因组DNA样品WT 3 ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1 ml 046 5引物（10 mmol/L） 1 ml LBa 引物（10 mmol/L）,30ml反应体系3： 2 ml 植物基因组DNA样品（111） 3 ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10mmol/L） 1 ml 046 5引物（10mmol/L） 1 ml 0463引物（10mmol/L） 30ml反应体系4： 2 ml 植物基因组DNA样品（111） 3 ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1 ml 046 5引物（10 mmol/L） 1 ml LBa 引物（10 mmol/L）,135号突变体的鉴定（7-11组）,30ml反应体系1： 2ml 植物基因组DNA样品（WT） 3ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5引物（10 mmol/L） 1ml 135 3引物（10 mmol/L） 30ml反应体系2： 2ml 植物基因组DNA样品（WT） 3ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 3引物（10 mmol/L） 1ml LBa 引物（10 mmol/L）,30ml反应体系3： 2ml 植物基因组DNA样品（111） 3ml 10扩增缓冲液 0.5 ml Taqase （5U/ml） 0.5 ml dNTP（10 mmol/L） 1ml 135 5引物（10 mmol/L） 1ml 135 3引物（10 mmol/L） 30ml反应体系4： 2ml 植物基因组DNA样品（111） 3ml 10扩增缓冲液 0.5