EPC-10膜片钳放大器的使用

EPC 10 膜片钳放大器的使用 1 EPC 10 膜片钳放大器的使用膜片钳放大器的使用 东乐科技有限公司技术部主任 刘振伟 一 概述一 概述 德国HEKA公司生产的EPC Extracellular patch clamp 系列放 大器的早期型号为EPC 5 这是世界上最早的膜片钳放大器 此后陆 续升级为EPC 7 EPC 8 EPC 9和EPC 10 EPC 9和EPC 10为全电脑 控制的膜片钳放大器 目前EPC放大器的最高版本为EPC 10膜片钳 放大器 截至到2011年7月 有EPC 10 USB和EPC 10 Plus两大类机 型 本文讲解EPC 10 USB的使用 EPC 10 USB膜片钳放大器主要有如下应用 单通道记录 可记录亚 pA 级的单离子通道电流 低噪声全细胞膜片钳记录 电压钳 电流钳 低频电压钳 LFVC 记录 可记录全细胞膜各种离子通道电流 细胞动 作电位等 传统细胞内记录 可记录动作电位 细胞放电等 使用金属电极的场电位记录 如整体动物与脑片的诱发场电 位记录 突触长时程增强 LTP 长时程抑制 LTD 记录 整体动物与脑 片的 LTP LTD 记录 EPC 10 膜片钳放大器的使用 2 松散封接记录 人工脂膜离子通道 纳米孔等的记录 放大 器探头有足够的大电流测量能力 最大可测量 2 A 的电流 离子选择性测量 采用离子选择性电极检测溶液中某一离子 浓度 电化学检测 伏安法 安培测量法 如采用碳纤电极的细胞 或膜片安培测量法 检测细胞某些物质的释放 细胞胞吞 胞吐或突触递质释放的研究 采用膜电容测定法 可测量因细胞胞吞 胞吐或突触递质释放所引起的全细胞膜 电容的微小变化 EPC 10膜片钳放大器具有如下显著特点 仪器面板的各个功能钮 键均为计算机控制 所有操作均在程 序面板中通过鼠标与键盘进行 面板程序可在 PC 机 Windows 2000 XP Vista 操作系统 和 苹果机 Mac OS 10 4 及以上版本操作系统 上运行 放大器本底噪声小于 90 fA 探头有三种反馈电阻 可测量的最大电流分别为 200 pA 50 G 20 nA 500 M 2 A 5 M 测量范围满足绝大多 数电生理实验信号的要求 电极电容 快电容 和膜电容 慢电容 补偿可自动进行 液接电位实现了自动校正 无需其他常见膜片钳放大器的手 工计算与校正 EPC 10 膜片钳放大器的使用 3 具有 Lock in 放大器功能 可对膜电容微小变化进行精确检测 用于与膜面积有关的细胞分泌等的研究 通过软件扩展功能 可进行离子浓度荧光检测 实现光电联 合检测 EPC 10 USB主要具有如下四种机型 1 EPC 10 USB 含有一个探头 为一台膜片钳放大器 2 EPC 10 USB Double 含有两个探头 为两台组合在一起的 EPC 10放大器 3 EPC 10 USB Triple 含有三个探头 为三台组合在一起的 EPC 10放大器 4 EPC 10 USB Quadro 含有四个探头 为四台组合在一起的 EPC 10放大器 上述任何一种机型在机箱内都包含一个LIH 8 8 AD DA转换器 提供4个DA输出通路 满足每个放大器同时输出刺激的需要 同时 提供8个独立的AD通路 满足独立的放大器对电流 电压信号的输 入 对于含有多个放大器的EPC 10 USB机型 可通过放大器软件面 板选择某一放大器 使其激活 被激活的放大器可接受软件设置的 命令 并在放大器面板上通过Digital Bus绿灯显示 当有软件命令输 出给放大器时 Digital Bus灯会闪烁 未被激活的放大器不能接受命 EPC 10 膜片钳放大器的使用 4 令信号 但只要选择上 仍然可随时被激活 以下介绍的是EPC 10 USB 二 探头二 探头 一 探头特点 一 探头特点 1 EPC 10 的探头呈狭窄长条形 体积较小 这样设计的目的 是为了在有限的显微镜工作距离下 便于记录电极的操作 2 探头表面有探头的序列号 如果是 Double 机及以上机型 探头表面还有 Probe 2 等字样 3 底部有能固定在微操纵器上的塑料底座适配器 可与绝大 多数类型的微操纵器直接进行匹配 在购置某些微操纵器时 要注 意选择与探头匹配的适配器 4 探头内部有一个电流 电压转换器 Current to voltage converter 即摄入电流 输出电压 这与一般的微电极放大器探头 不同 后者摄入和输出的均为电压 5 探头具有 5 M 500 M 和 50 G 三种反馈电阻 分别用 于记录双分子层膜 松散封接模式 大细胞等的大电流 2 A 一般的全细胞电流 20 nA 和单通道电流 200 pA 二 探头连线 二 探头连线 1 信号输入端口信号输入端口 用聚四氟乙烯 Teflon 白色 绝缘的 BNC 插口 与电极夹持器 Holder 直接连接 EPC 10 膜片钳放大器的使用 5 2 地线连接口 地线连接口 GND 为黑色插孔 承载高质量接地信号 用于将浴池 参比 电极接地 也可用于将探头附近的物体 如显 微镜 屏蔽设施等接地 该接地口通过探头电缆线与放大器前面板 上的信号地 Signal GND 相连通 三 探头使用注意事项 三 探头使用注意事项 在放大器开启的情况下 应尽量避免用手直接触碰信号输入端 口 否则可能由于手上带有静电而损伤探头内部电路 在更换 玻璃电极时 若一定要触碰信号输入端口 请一定先除去手上 的静电 通过触摸其他金属物体 如屏蔽网等 再触碰信号 输入端口 若由于探头损坏而更换探头 则需要在连接新探头后对放大器 进行校正 方法为 开启EPC 10 预热30 min后 放大器与探 头均处于正常工作的温度 打开Patchmaster软件的EPC 10 USB菜单 选择Test and Calibrate条目 即可对EPC 10放大 器进行全方位校正 校正的内容包括放大器软件面板上所有的 数码开关和控制按钮 这些结果仅是针对正在被校正的放大器 的 不适用于其他EPC 10放大器 校正的结果可存储为 Scale epc文件 该校正应该每隔半年进行一次 如果发现放大 器的频响不准确或者偏移比较明显时 应随时进行校正 校正 过程耗时5 10 min 依计算机的速度而异 放大器校正后 再 用Re Initialize EPC10 USB功能对放大器进行初始化 EPC 10 膜片钳放大器的使用 6 三 电极夹持器三 电极夹持器 为了获得低噪声记录 电极夹持器必须直接插入探头中 不推 荐将电极夹持器屏蔽的做法 因这样可引入更多的随机噪声 背景 噪声可增加 1 2 倍 这些随机噪声来自夹持器塑料材质 聚碳酸酯 的非理想化绝缘特性和液体水膜上的热电压波动 金属的屏蔽物质 可使更多的噪声通过电容耦合方式进入放大器探头 尤其是单通道 记录更不能屏蔽夹持器 聚碳酸酯具有低介电损失性 若自己制作 电极夹持器 要考虑采用低介电损失的材料 表面要具有疏水性 以防液膜的形成 聚碳酸酯是目前发现的符合上述特点的最佳材料 使用电极夹持器时 将银丝 长度一般在 4 5 cm 焊接在铜针 上 后者插入探头 BNC 插口内 银丝表面需要镀上 AgCl 可用含 Cl 离子的溶液 如 100 mM KCl 溶液或生理盐溶液 电镀 与铜针 焊接处部位的银丝不要电镀 电极夹持器的噪声测定 将含有银丝电极的夹持器插入探头 探头用锡箔纸包裹 采用放大器的 Noise Test 功能测量噪声 良好 的夹持器应该只增加噪声 10 左右 例如从 95 到 105 fA 四 模型细胞四 模型细胞 一般的膜片钳放大器均配备模型细胞 它的用途有如下两个 1 用于模拟真实细胞的膜反应 帮助初始者演练放大器各项 EPC 10 膜片钳放大器的使用 7 功能的使用 2 用于检测放大器的功能是否正常 如果用模型细胞检测放 大器时没有问题 则表明放大器功能是正常的 与 EPC 10 放大器配备的是 MC 10 模型细胞 它通过 BNC 适配 器与探头信号输入接口连接 通过另一根细线与探头 GND 接地口连 接 其上有三个位置 通过扳手来选择 10 M位置位置 模拟电极入浴液 电极电阻为10 M 可模拟进行 施加测试脉冲和补偿失调电位 如液接电位等 中间的位置中间的位置 模拟电极与细胞膜形成高阻封接 电极电容 及 其他漂浮电容 为6 pF 可模拟进行电极电容 C fast 的补 偿功能 0 5G 位置位置 模拟形成了全细胞记录模式 串联电阻为5 1 M 膜阻抗为500 M 0 5 G 膜电容为 22 pF 可模拟 进行膜电容 C slow 的补偿功能和电流钳模式 还可用于检 测软件Patchmaster编辑输出的刺激脉冲 五 仪器面板五 仪器面板 一 前面板 一 前面板 1 Power Switch 电源开关 为让放大器能正确地初始化 一般是要先开启放大 器电源开关 再打开采样软件 Patchmaster 或 TIDA 当然 在忘 记先开启放大器时 也可通过采样软件重新对放大器进行初始化 EPC 10 膜片钳放大器的使用 8 注意 在开始实验前 放大器需要预热至少 15 分钟 2 Probe 用于连接探头 3 Chassis Gnd CHAS EPC 10 放大器的机壳地 与大多数仪器一样 该机壳地与电源 地相连通 为避免形成地线环路 在放大器设计上 信号地与机壳 地之间不直接连通 而是中间连接了一个 10 的电阻 4 External Stim Input CC 外部来源的电压刺激信号从这里输入 放大器会根据需要设定 的比例转化为刺激电流 可与放大器内部的电流刺激信号叠加 用于电流钳模式 5 External Stim Input VC 外部来源的电压刺激信号从这里输入 它们可与放大器内部的 电压刺激信号叠加 用于电压钳模式 叠加的刺激信号通过2极滤波 器滤波 以去除电压变化初始与结束时产生的跃迁 这避免了刺激 命令处理电路出现非线性特性 同时也降低了电极电容快速充电时 产生的电流瞬变值幅度 软件提供两个滤波等级 用10 90 瞬变值 幅度上升时间表示 2 s 是防止放大器内部电路出现非线性化所 需的最小上升时间 和20 s 最适合于那些除了最快速测量以外的 所有测量 用于降低电容瞬变值幅度 6 Voltage Monitor 将电极上的电压输出给监视系统 如示波器 该电压是将输出 EPC 10 膜片钳放大器的使用 9 给电极的电压放大了10倍 该输出的阻抗为50 在Patchmaster的 示波窗口中可显示原始的未被放大的信号 7 Current Monitor 输出电极电流 该信号经过了在放大器软件面板中所设置的滤 波器滤波 正电压与从电极输出的电流相对应 通常 左手边的输 出 Filter 1 是经过放大器软件面板中Filter 1滤波后的输出 可输 出给数据记录装置 如磁带记录仪等 用于记录宽频信号 如可记 录单通道活动 右手边的输出 Filter 2 是经过放大器软件面板中 Filter 2额外滤波后的输出 用于输出给示波器 监视整个实验过程 如封接 破膜等 上述任何一种输出都可在软件Patchmaster的示 波窗口中显示 8 Signal GND 为香蕉插口 是高质量的信号地 可用做膜片钳系统中其他仪 器的公共地 9 Clipping 这是一个二极管指示灯 当放大器输入电流饱和时该指示灯亮 在电压钳实验中 电容充放电伪迹将被电脑去除 而去除过程只有 在不出现饱和的情况下完成 该指示灯起到这样一个监督的作用 特别地 虽然通过滤波后输出的电压没有达到饱和 但如果滤波前 输出的电压是饱和的 则该指示灯也会指示饱和 10 Digital Bus 该指示灯显示计算机正发送数码信息到EPC 10放大器 EPC 10 膜片钳放大器的使用 10 11 A D Inputs 放大器内设的转换器 EPC 10采用LIH 1600 EPC 10 USB采用 LIH 8 8 提供8个模拟 数码 A D 输入通道 其中3个在仪器内部 与EPC 10连接 若使用EPC 10 Double或EPC 10 Triple 则分别有5或 7个与放大器在内部连接 剩余的输入通道可提供给其他应用程序 软件 如Patchmaster可利用这些通道监测从温度传感器 压力传感 器或其他传感器的输出 12 Trigger In 外部触发信号输入口 当在采样软件Patchmaster中的Pulse Generator选择Trigger Series或Trigger Sweeps时 外部触发信号通过 该输入口触发放大器进行数据采集 13 Trigger Output TTL触发输出 有3个输出 用于使其他设备与膜片钳实验同步 化 14 D A Outputs 提供3个数码 模拟 D A 信号输出通道 0 2 它们携带如 下信号 DA 0 Free C slow during Cap Track DA 1 Free G series during Cap Track DA 2 Free 在Patchmaster采样软件的Capacitance Tracking模式 DA 0和 DA 1接口可作为特殊用途的输出口 这可在软件中设定 如果在 EPC 10 膜片钳放大器的使用 11 EPC 10放大器软件面板中执行Cap Track功能 则DA 0将输出C slow 数值 DA 1将输出G series 1 R series 的数值 上述数值是以电 压形式输出的 G series的转换因子为100 nS V C slow的分别是 0 5 5或50 pF V 对应于30 100和1000 pF范围的电容值 DA 2 通常用于触发示波器或隔离器 注意 1 当在软件面板中使用Reset时 上述输出的数值将 都变为0 2 当需要使用软件面板Cap Track功能时 不能将DA 0 和DA 1用做触发信号的输出 3 这3个接口是输出口 千万不要 将刺激信号从这里输入 二 后面板 二 后面板 EPC 10 USB后面板上有2个25针的连接口 1个40针的连接口和 4个通信输入器口 用于放大器与其他设备的连接 1 USB 接计算机USB 2 0口 连接放大器软件与EPC 10 USB主机 在 连接有多个EPC 10 USB放大器时 为使采集时钟同步化 需要将一 个放大器的MASTER SYNC和另一个放大器的SLAVE SYNC用标准 CAT5网线连接 而且该线要求越短越好 2 DIGTAL IN 从外部设备来的TTL逻辑电路的触发信号输入口 为25针的输 入口 3 DIGTAL OUT EPC 10 膜片钳放大器的使用 12 TTL逻辑电路的数字信号输出口 为25针的输入口 用于输出 触发信号给其他设备 如给药灌流系统 第21 23针输出的触发信号 也可通过前面板的TRIGGER INPUT OUTPUT中的OUT 0至OUT 2输 出 4 Digital IN OUT 只用于和HEKA公司的其他设备连接 如连接EPC 8或TIB 14到 EPC 10 USB放大器 为40针的输入 输出口 5 TELEGRAPH INPUTS 4个通信输入器插口 用于将EPC10 USB放大器的滤波频率 Frequency 所测膜电容 Cm 增益 Gain 大小等信息输出 给软件 6 AUX DAC 辅助数模通路 7 SOUND 声音输出口 8 Power 电源线插口 输入电压有90 210 V和220 250 V两个交流电范围段 可自动调节 保险丝的规格是1mA 六 软件面板六 软件面板 EPC 10 膜片钳放大器的使用 13 一 主要功能 一 主要功能 1 单机与多机单机与多机 无论单机还是多机 都共用一个LIH 8 8型AD DA转换器 该转 换器提供4个DA通道 可允许同时输出4个刺激信号 8个AD通道 可同时摄取不同放大器的8个电压或电流信号 当前正在激活的 放大器可通过仪器前面板上的Digital Bus绿灯在闪亮判断出来 当使用EPC 10 Double Triple或Quadro放大器时 软件面板会 显示 1 Amplifier 2 Amplifier 等 点击其中任何一个放大器 则将激活该放大器 显示为红色 各放大器的设置是互不影响 相 互独立的 2 Gain 电流输出的增益 数值范围为0 005 2000 mV pA 分为三档 0 005 0 002 0 5 20和50 2000 mV pA 分别对应于探头 5M 500M 和50G 的反馈电阻 用于记录不同范围大小的电流 见下表 当选择不同Gain数值 通过键盘上的上下箭头或拖动鼠 标来选择 时 软件会自动选择相对应的探头反馈电阻的大小来通 过电流 低范围的Gain用于双层膜 松散封接膜片和大细胞的实验 在 这类实验中 记录的电流比较大 可高达2 A左右 电容补偿可 达1 nF 可补偿小至10 的串联电阻 中范围的Gain主要用于一般 大小的细胞的全细胞记录 记录的电流范围可达20 nA 电容补偿可 达1000 pF 可进行串联电阻补偿和电流钳记录模式 背景噪声比高 EPC 10 膜片钳放大器的使用 14 范围Gain的噪声大 但提供100 kHz的频带宽 高范围Gain用于单通 道记录 其噪声极低 但记录的最大电流大约在200 pA以内 最大 频带宽约为60 kHz 但是一些在中范围Gain情况下的功能不能使用 如电容补偿最大为100pF 电流钳模式不能使用等 表表 EPC 10 增益增益Gain的三个范围的三个范围 低范围低范围中范围中范围高范围高范围 Gain mV pA 0 005 0 0020 5 2050 2000 对应的反馈电阻大小5 M 500 M 50 G 电压钳模式能够测量的 最大电流 2 A 20 nA 200 pA 电流钳模式能够输出的 最大电流 100 nA 10 nA 摄取信号的频带宽 kHz 10010060 C slow慢电容补偿范围 pF 30 100 100030 100 100030 100 是否具有电流钳模式是是否 能否进行串联电阻补偿能能能 适用的记录模式 大电流记录 双分子层膜 全细胞记录 单通道记 录 EPC 10 膜片钳放大器的使用 15 松散封接或大 细胞 3 Clipping Indicator 当放大器的输入发生饱和时 在Gain的标框处出现一个闪烁的 Clip 警示电流超载 这个Clip与放大器前面板上的Clipping灯的 功能相同 但它给人的感觉好像比后者更敏感 其实不然 它只是 将处于超载的时间显示得长些而已 4 V membrane 电压钳模式下 用于设定 双击鼠标左键或单击右键输入 钳 制电位 范围为 1 000 mV 电流钳模式下 显示为I membrane 用于设定 双击鼠标左键或单击右键输入 钳制电流 范围为 1 000 pA 如果零电位 该电位下通过电极的电流为零 已经被 正确设置 则软件会将液接电位和其他失调电位进行校正 以保证 钳制电位的准确性 5 I mon 显示实际测量的通过电极的直流电流 基线位置的电流 在对 液接电位等失调电位进行补偿后 该电流应接近0 6 V mon 显示对液接电位等失调电位校正后实际测量的通过电极的电压 在施加钳制电位 V membrane 后 则显示钳制电位 但注意的是 在某些情况下 如在长刺激脉冲期间 V mon可能会暂时与所设定 EPC 10 膜片钳放大器的使用 16 的钳制电位有些不一致 因为它显示的是钳制电位V membrane与所 设定的刺激脉冲电压之和的平均值 7 R memb 在电极进入浴液到形成封接前 R memb R membrane 显示串 联电阻 Rs 主要为电极电阻 的大小 封接形成后显示封接电阻 Rseal 的大小 形成全细胞记录模式后则显示细胞膜电阻 Rm 的大小 其数值是通过测量基线与测试脉冲后半部分的电流幅度来获得的 可通过本软件面板下部的 Sound 功能 见后 对 R memb 大小进行 声音监控 8 Input ADC 在这里选择Patchmaster采样软件示波窗口中可显示的输入信号 包括如下几种 F2 EXT 外部刺激命令 从放大器前面板上的 External Stim Input VC 输入 经过滤波器 Filter2 滤波 显示在示波窗 口 Imon 1 电流输出1 Imon 2 电流输出2 Vmon 电压输出 AD0 4 任何其他的AD通道 9 Recording Mode 用于选择记录模式 包括In Out 内面向外记录模式 On Cell 细胞贴附记录模式 Out Out 外面向外记录模式 Whole EPC 10 膜片钳放大器的使用 17 Cell 全细胞记录模式 和C Clamp 电流钳模式 10 Test Pulse 可产生一定幅度 在 Amplitude 中设定 与频率 在 Length 中 设定脉冲宽度 间接决定了脉冲频率 的测试刺激脉冲施加给细胞 记录电流反应 仅适用于电压钳模式 用于监测封接过程或其他需 要给予刺激脉冲来监测一些实验设置参数的情形 要关闭测试脉冲 可选择其左侧的 off 要选择单向脉冲 可选择其左侧的 Single 可 通过 Test Pulse 右侧的框选择显示输出脉冲电压还是电流反应或都显 示 11 Amplitude Length 设定测试脉冲的幅度与持续时间 测试脉冲幅度的范围为 100 mV 持续时间范围为 0 1 1000 ms 当脉冲持续时间为 1 ms 时 每 个测试脉冲含有 100 个采样点 即采样间隔时间为 10 m 12 Noise 该功能用于检测放大器的内部噪声和环境噪声 当将探头屏蔽 时 检测的是放大器的内部噪声 当将探头裸露时 检测的是环境 噪声 执行该功能时 rms 噪声电流被持续检测与更新 此时将没 有测试脉冲输出 rms 噪声电流通过当前激活的 AD 数模通道采集 通常经过 Imon 2 输出 频带宽由 Filter 2 决定 电流的采样间隔为 100 s 获得一个噪声数值需要持时 256 ms 噪声数值显示在 Noise 仪表中 噪声的详细测量方法见 七 功能检测 13 LJ Liquid junction EPC 10 膜片钳放大器的使用 18 液接电位 mV 该框内需要手工输入液接电位的数值 放大 器会根据这个数值对液接电位自动进行校正 在线校正需要在封接 前操作Auto Vo 输入LJ合适的数值 如果LJ输入0 mV 则放大器 将不执行校正功能 双击鼠标左键输入LJ数值 范围 200 mV 可 以拖动鼠标改变LJ数值 LJ数值的计算方法见文献 Neher E 1992 Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments In Methods in Enzymology 207 123 131 Academic Press New York 用于计算LJ的常见离子迁移率见文献 Barry P H Lynch J W 1991 Liquid junction potentials and small cell effects in patch clamp analysis J Memb Biol 121 101 117 下表列出了常见溶液与生理盐溶液 140 mM NaCl 之间的LJ 值 LJ的极性是生理盐溶液相对于表中溶液的 注意 LJ 不受 Reset 按钮功能的影响 也不能用宏命令 macros 设定 这一限定是为了避免 LJ 的意外变化引起错误的 LJ 校正 如果我们用的电极内液和细胞浴液是同一种溶液 且浓度 也相同 则 LJ 应该为 0 mV 对于标准的液接电位校正 LJ 中输 入数值的正负极性应该是浴液相对于电极内液的电位 例如 如果 EPC 10 膜片钳放大器的使用 19 电极内液含有谷氨酸或天门冬氨酸 浴液中含有 Cl 离子 LJ 的极 性应该为正 如 10 mV 点击 Auto Vo V membrane 将变为 10 mV Whole Cell 和 Out Out 模式时 或 10 mV On Cell 和 In Out 模 式时 此时 LJ 得到了准确校正 在膜片钳实验中 需要考虑的偏移电位主要有放大器偏移电位 范围 30 mV 电极电位 范围 200 mV 依赖于玻璃电极内 与参比电极附近的Cl离子浓度 液接电位以及与要研究的细胞膜 串联的其他细胞膜的电位 如在细胞贴附式时 实验中一些偏移 电位是固定不变的 如放大器偏移电位和电极电位 而液接电位却 是变化的 实验开始时 首先要做的就是将那些固定不变的偏移电位去除 使通过玻璃电极的电流为0 这样放大器的命令电压V membrane就 是施加给细胞膜的电压 液接电位在实验中是变化的 例如在全细胞记录模式 当记录 电极进入浴液时 因电极内液与浴液的成分不同 液接电位得以产 生 而当形成全细胞记录模式后 因电极内液与细胞内液接近 液 接电位此时基本消失了 在电极刚入浴液时 为了去除液接电位 我们需要将其去掉 这个过程叫补偿 而当形成全细胞记录模式 时 又需要将已经补偿掉的液接电位恢复回来 这个过程叫校正 14 Vo Pipette offset Vo 显示总的失调电位 施加到电极上的实际电压是 V EPC 10 膜片钳放大器的使用 20 membrane 与 Vo 之和 可通过点击 Auto Vo 来自动显示 也可拖 动鼠标手工调节 当改动 LJ 时 Vo 会随之自动变化 注意 不推 荐手工调节 Vo 因为这会干扰放大器对液接电位的校正 15 Auto Vo Auto Vo 按钮用于自动消除失调电位 使电极电流为 0 失调电 位的大小显示在 Vo 其范围为 200 mV Auto Vo 用于电极入浴液 后至开始封接前的时间段 其与 LJ 的合用可对液接电位进行在线校 正 点击 Auto Vo 后 V membrane 将变为 LJ 的数值 On Cell 和 In Out 模式时与 LJ 的极性相同 Whole Cell 和 Out Out 模式时与 LJ 的极性相反 注意 Vo 的数值不受 Reset 钮的影响 16 Track 它实质上是在钳制电位为 0 mV 时 Auto Vo 功能的反复多次的 执行 执行的频率取决于 EPC 10 菜单中 Search Mode Delay 的设定 17 C fast 用于补偿电极电容和其他漂浮电容 范围为 0 15 pF 如果探 头输入端不接任何东西 放大器仍会有残存的 1 1 5 pF 的输入电容 可被 C fast 补偿 补偿功能有两个框 上面的框显示电容值 下面 的框显示电容充放电的时间常数 8 s 补偿可通过拖动鼠标 手工进行 也可输入电容数值和 值 还可点击右面的 Auto 进行自 动补偿 如果将鼠标放在 上 则上下拖动鼠标可改变补偿的电 容值 左右拖动鼠标可改变时间常数 值 EPC 10 膜片钳放大器的使用 21 Auto 自动补偿的原理是 施加给电极一些 5 mV 的脉冲 对产 生的电容电流进行平均 然后用指数方程拟合出电容补偿数值 如 果 Auto 不能拟合出一个理想的补偿数值 Auto 右侧标有 E 的小框 将变灰暗 在采用细胞贴附式记录模式时 若对玻璃电极涂抹 Sylgard 树脂 电极电容变小 并且将 C slow 关闭 此时 Auto 补偿 功能的效果最好 放大器软件提供了两种补偿方法 快速补偿方法 采用查表法 look up table 即将放大器内储存的数值表查找一遍 直至找到某个值的过程 该方法首先需要在 中选择 Make C fast 在默认路径中创建出文件 CFast epc 如果程序找不到该文件 则在打开 Patchmaster 时将出现信息 提示找不到文件 此时 程序 将采用慢补偿方法 反复补偿法 18 C slow 用于膜电容补偿 有 3 个电容补偿范围 在 Range 中 30 pF 0 12 30 pF 100 pF 0 4 100 pF 和 1000 pF 4 1000 pF 该 范围还受到程序的限制 即必须保证时间常数 R series x C slow 大于 5 s 以防止振荡的出现 C slow 补偿可通过拖动鼠标手工进行 也可输入电容数值 还可点击右面的 Auto 进行自动补偿 包括 C slow 和 R series C slow Range 选择膜电容补偿的范围 Off 关闭补偿功能 30 pF 用于小细胞 100 pF 用于中小尺寸的细胞 1000 pF 用于大细胞 注意 1 当 选择 1000 pF 范围时 Gain 只能选择低和中范围 如果 Gain 选择高 EPC 10 膜片钳放大器的使用 22 于 20 mV pA 的数值 程序会自动将补偿范围降到 100 pF 2 若 使用 Cap Track 功能测量电容的微小变化 应该尽可能选择大范围 的 C slow 这与直觉恰好相反 选择大范围的 C slow 将使补偿更加 精确 分辨率更高 R series 显示串联电阻的数值 范围为 0 1 10 G 通过该数值可决定膜 充放电反应的时间常数和对串联电阻进行补偿 该数值的调节受限 于膜电容数值以及补偿范围 Range 该数值可通过拖动鼠标手工进 行更改 也可直接输入数值 还可点击右面的 Auto 自动进行测量 如果将鼠标放在 上 则上下拖动鼠标可改变补偿的电容值 C slow 左右拖动鼠标可改变串联电阻 R series 值 Auto C slow 该功能可自动执行 C slow 补偿功能和测量串联电阻 R series 数 值 若 C slow Range 处于 Off 状态 点击 Auto 时将自动把范围设成 1000 pF 低和中范围 Gain 时 100 pF 高范围 Gain 时 该功能 在 C fast 执行后进行时效果好 且为了获得更好的补偿效果 反复 交互执行 Auto C fast 和 Auto C slow 效果更佳 如果 Auto 功能不能给出一个理想的补偿数值 Auto 右侧标有 E 的小框将变灰暗 连续重复执行 Auto 可采用 Cap Track 功能 见 下 注意 在执行 Auto 前 提供合理的 C slow 和 R series 估计值 是必须的 否则 Auto 的自动补偿功能可能会失败 Cap Track EPC 10 膜片钳放大器的使用 23 点击该按钮可连续重复执行 Auto C slow 补偿功能 跟踪补偿膜 电容可能发生的微小变化 测量出电容值与串联电阻 R series 值 再次点击可关闭该功能 注意 在 Patchmaster 采样软件 EPC 10 菜 单中 选择 Output Cap Track 选项 则可将测量的电容值和串联电 导 G series 1 R series 值分别输出到 DA 0 和 DA 1 换算系数 G series 是 100 nS V C slow 是 0 5 5 或 50 pF V 分别对应于电容范 围 30 100 和 1000 pF 点击 Reset 钮 DA 输出的数值将被调为 0 如果要激活 Output Cap Track 功能 则一定要确保触发 DA 不能 是 DA 0 或 DA 1 通道 Delay 该功能设置下一次 Cap Track 执行前的等待时间 当 Delay 特 别短时 如 1 ms 膜电容测量的更新频率大于 10 Hz 还取决于计 算机类型 当关闭采样软件示波窗口时 Cap Track 的更新速度可 增加约 2 倍 19 Rs Comp 全细胞记录电压钳模式下 细胞膜电位由施加在记录电极上的 钳制电位所决定 但是这种钳制电位钳制的效果并不完全 因为它 还依赖于来自电极至细胞内部的串联电阻 Rs 和所记录电流幅度 的大小 Rs 因与电极电阻串联而得名 一部分 Rs 来自电极电阻本 身 但通常大部分 Rs 来自残留的破裂膜电阻 实验中 通常 Rs 至 多降低到电极电阻的 2 倍 Rs 对电流记录带来两方面的负面影响 1 首先 当通过电 EPC 10 膜片钳放大器的使用 24 极输出步阶电压给细胞时 Rs 延迟了膜电容充电反应 膜充电反应 的时间常数 Rs x Cm Cm 是膜电容 例如 若 Rs 5 M Cm 20 pF 则时间常数 100 s 该时间常数对于研究快速的电压门 控性离子通道电流 如 Na 通道电流 来说是太长了 2 其次 当 膜上有大电流通过时 Rs 产生的膜电位误差增大 例如 若 Rs 5 M 则 2 nA 的通道电流将产生 10 mV 的膜电位误差 这对于研究 电压门控性离子通道电流来说已经相当大了 一般要保持在 2 mV 以下的误差 执行 Rs 补偿功能时需要选择补偿速度与设定补偿的程度 百分 比 补偿速度有如下选择 Off 关闭补偿功能 100 s 慢补偿 10 s 快速补偿 2 s 极快速补偿 如何选择补偿速度取决于时间常数 值的大小 如果 值小于 500 s 应选择 2 s 提供补偿必需的速度 极快速补偿可加快电压 钳制速度 但需要苛刻的调节 以防止产生高频振荡 极快速补偿 时 Filter 1 将自动切换为 HQ 30 kHz 设置 电流钳模式下 Rs Comp 将成为桥补偿 理论上讲 Rs 补偿的百分比越大越好 但实际上补偿超过 90 将产生电极振荡 如何设定补偿的程度也取决于时间常数 值的大 小 如果 值大于 100 s 可以最大补偿到 90 而不产生严重的振 荡 对于较小的 值 补偿的程度应该为仅低于产生振荡的百分比 数值 EPC 10 膜片钳放大器的使用 25 Auto 按钮可以自动调节补偿的设置 使膜电位的跃迁速度达到 最大 并使超射最小 防止振荡产生 20 Filter 1 和和 Filter 2 Filter 1 设置放大器3极滤波器的滤波频率 有如下4个选项 Bessel 100 kHz Bessel 30 kHz Bessel 10 kHz和HQ 30 kHz 一般情 况下选择10 kHz就已经足够了 可有效地降低高频噪声的干扰 当 进行快速Rs Comp时 如选择2 s 此处会自动选择HQ 30 kHz 其 他场合基本不用HQ 30 kHz Filter 2 设置放大器4极滤波器的滤波频率 只用于I mon 2电 流信号 Filter 2与Filter 1是串联的 滤波频率可通过拖动鼠标手工 进行 也可输入数值 范围为0 1 16 kHz 步阶为0 1 kHz 保证精确 在0 5 15 kHz范围 有两种滤波器类型供选择 一是Bessel 这是我 们最常采用的滤波器 另一个是Butterworth 具有大的衰减斜率 主要用于功率谱分析 注意 1 当Filter 1和Filter 2联合使用说 实际上Filter 2的滤波频率 是起真正滤波作用的 即为I mon 2信号的滤波频率 2 如果不适用Filter 2滤波 而是采用外部滤波器滤波 则可 将I mon 1输出到外部滤波器的输入端 将滤波器的输出返回给放大 器的AD通道 AD 0 AD 5 将选择的AD通道作为信号输入通道 3 当放大器的输出选择I mon 1时 所用的滤波器为Filter 1 此时Filter 2失效 如要使用Filter 2 则必须先将放大器输出更改为I mon 2 EPC 10 膜片钳放大器的使用 26 21 Leak Comp 漏电流补偿功能 补偿程度用电导表示 该电导称为漏电导 Leak conductance 补偿范围为2 nS 200 nS和20 S 分别对应 于高 中 低范围的增益Gain 漏电流补偿可通过拖动鼠标手工进 行 也可输入数值 还可点击右面的Auto进行自动补偿 通过Track 钮可连续对漏电流补偿进行更新 跟踪漏电流的变化 22 Stim 当对电位变化的速度要求不高时 外部输入放大器的刺激信号 可被一个2极Bessel滤波 以降低快速的电容瞬变值幅度 放大器提 供了两个滤波等级 用10 90 瞬变值幅度上升时间表示 2 s 是防止放大器内部电路出现非线性化所需的最小上升时间 和 20 s 最适合于那些除了最快速测量以外的所有测量 用于降低电 容瞬变值幅度 通常选择20 s就足够了 除非要研究诸如Na通道 电流这种激活非常快的电流 External处可输入外部电压刺激输入的转换系数 范围是 0 10 x 便于使用不同的外部刺激器 注意 1 如果没有外部刺激 器输入到放大器前面板EXT STIM INPUT VC 强烈推荐将External 设为Off 即为0 这么做可有效地防止外部噪声的摄入 2 放大 器内部的钳制电位V membrane is不受该转换系数变化的影响 但是 如果钳制电位是通过外部的刺激器或另外的计算机设置的 则该转 换系数将对钳制电位V membrane产生影响 23 Zap EPC 10 膜片钳放大器的使用 27 用于打破细胞膜形成全细胞记录模式 点击Zap 放大器将通过 电极给予细胞膜一个高电压脉冲 幅度范围为 1V 持续时间为 0 005 1000 ms 在采样软件Patchmaster中 打开Windows下拉菜单 开启Configuration窗口 如果在Hardware中选择Zap OnCell only 则 Zap功能只用于形成封接后 而不能用于形成全细胞记录模式后 24 Sound 选择此项后 R membrane数值的变化将有声音的伴随 该功能 需要计算机具有声卡 25 Reset 该功能可使EPC 10软件面板上的一些设定恢复到最初的默认值 它将使DA通道变为0 取消使用Cap Track时C slow和R series的输出 另外 当记录宏命令时 也需要使用Reset功能使EPC 10恢复到初始 状态 二 一些较少使用的隐藏功能 二 一些较少使用的隐藏功能 一些较为少用的功能隐藏在EPC 10 USB软件面板的右侧 通过 点击EPC 10 USB软件最上端的 Show All 可以显示出来 1 LFVC V memb 用于设置低频电压钳 Low frequency voltage clamp LFVC 模 式的钳制电位 点击右侧的 V memb 或 R pip 点击该钮可将 R memb 的数值拷贝过来到 R pip 用于在封接前 将电极电阻值储存在所采集的数据文件中 4 CC Gain 该功能可选择电流钳的转换系数 0 1 pA mV 1 pA mV和10 pA mV 分别对应于最大命令电流1 nA 10 nA和100 nA 当通过 放大器前面板External Stim Input CC输入外部刺激命令时 需要在 此选择转换系数 当CC Gain选择1 pA mV External Stim Input CC 输入1 mV的命令时 将产生1 pA的命令电流 注意 gain的选择受 该转换系数的限制 如CC Gain选择1 pA mV 电流钳模式下gain的 范围只能是0 5 20 mV pA EPC 10 膜片钳放大器的使用 29 5 Gentle CC Switch 该功能用在电压钳与电流钳之间进行反复切换时 Gentle CC Switch选择On 为维持膜电位稳定 在切换为电流钳 时 I hold不为0 pA 而为某一数值 需要向细胞注入电流 为此 电压钳下V mon应该与初始的V membrane一致 同样 在返回到电 压钳时 V membrane将会在电流钳时的膜电位附近 Gentle CC Switch选择Off 在切换为电流钳时 I hold将设为0 pA 6 V mon Gain 所测量的V mon可以在输出到模数转换器前 被放大10或100倍 放大 100倍时 电压范围为 100 mV 分辨率为1 5 V 特别适用于 电压幅度较小的场电位记录 7 Last V membrane 电流钳模式下 膜电位非常容易改变 当切换到电压钳时 V membrane常常不同于切换为电流钳模式之前的数值 Last V membrane用于储存并恢复初始的V membrane值 8 Bell 点击该钮启动系统声音 用于在实施宏命令时提供反馈信息 9 Relative value 点击该钮 则在记录宏命令时 任何值的变化都以相对变化值 被记录下来 例如 如果使钳制电位从 60 mV超极化到 70 mV 则 宏命令中将记录 10 mV EPC 10 膜片钳放大器的使用 30 10 Overlay 点击该钮 测试脉冲波形线将以叠加的方式显示在采样软件示 波窗口中 11 List State 点击该钮 将放大器设置状态的一些信息发送到Notebook窗口 中 包括放大器类型 Amplifier 记录模式 Recording Mode 钳制电位 V membrane 增益 Gain 滤波频率 Filter 2 快电 容补偿 C fast 和慢电容补偿 C slow 12 One Pulse 点击该钮一次 就输出一个测试脉冲 当Test Pulse选择off时 若仅仅需要一次测试脉冲 可选此功能 13 I Scale and V Scale 用于设定测试脉冲Test Pulse在采样软件示波窗口中的显示比例 左侧框 和偏移 右侧框 数值1将使Y轴达到AD DA转换器的 最大量程 10 24 V 此时 如果输入信号饱和了模数转换器 便 很容易发现 但是 如果要对信号进行放大 则需要在采样软件 Patchmaster的Configuration窗口Misc 中选上Scale Test Pulse 14 Sound 编码R membrane的声音灵敏度 Hz M 和音量 在这里 设定 点击Sound钮可执行该功能 15 Wait 用于设定在记录宏命令时暂停的时间 点击该输入框 可将 EPC 10 膜片钳放大器的使用 31 Record变为Stop 此时宏命令的记录暂停 直到经过所设定的时间 或点击Stop 才可继续记录宏命令 七 功能检测七 功能检测 一 施加测试脉冲 一 施加测试脉冲 1 将模型细胞与探头连接好 将模型细胞与探头的BNC口连接 将探头后端的接地口与模型细胞接地线口连接 2 将模型细胞电路设置为 10 M 位置 此时模拟电极入浴液 电极电阻 10M 3 打开 Patchmaster 点击放大器软件面板的 Reset 图中 所 示 设置记录模式为 On Cell 模式 图中 所示 将 Test Pulse 的幅度 图中 所示 设为 5 mV 时间长度 图中 所示 设为 5 ms 此时在波形显示窗口将出现电流方波 如果增益 Gain 大小合适 即为 5 mV pA 图中 所示 则窗口中将显示一个幅度约为 500 pA 的电流方波 根据欧姆定律 I U R 5 mV 10 M 500 pA 图中 所示 4 PULSE 或 Patchmaster 会自动计算出且随时更新电极电阻的 大小 并显示在 R memb 上 图中 所示 10 M 左右 5 可能存在的失调电位可通过点击Vo右边的Auto 图中 所示 来自动完成 也可通过双击Vo 然后通过上下拖动鼠标使电流方波 的基线为0和使I mon显示为0 此时 命令电压V membrane