2012届-理学院-应用化学系-制药工程-1083-余灵峰-200811931331.doc

本科生毕业论文本科生毕业论文 超声波法辅助提取海蒿子多糖及分析超声波法辅助提取海蒿子多糖及分析 UltrasonicUltrasonic AssistedAssisted ExtractionExtraction ofof SargassumSargassum PallidiumPallidium andand AnalysisAnalysis itit 学生姓名余灵锋 所在专业制药工程 所在班级制药 1083 申请学位工学学士 指导教师郝心敏职称教授 副指导教师职称 答辩时间2012 年 06 月 09 日 目 录 目目 录录 摘摘 要要 I ABSTRACT II 1 绪论绪论 1 1 1 前言前言 1 1 2 大分子多糖的概述 1 1 2 1 抗肿瘤药 2 1 2 2 治疗艾滋病 AIDS 等抗病毒药 2 1 2 3 抗衰老药 2 1 2 4 降血脂和抗凝血 2 1 3 常用的提取方法 2 1 4 海蒿子多糖的概述及其研究 3 1 4 1 海蒿子多糖的概述 3 1 4 2 国内外海蒿子多糖提取的研究 3 1 4 3 海蒿子多糖的药理学研究 3 1 5 实验内容的概述 4 2 本课题的研究内容及意义本课题的研究内容及意义 4 2 1 研究内容 4 2 2 研究意义 4 3 实验部分实验部分 4 3 1 实验材料 4 3 2 实验试剂 主要试剂 4 3 3 实验仪器 主要仪器 5 4 海蒿子多糖的超声波提取与含量测定海蒿子多糖的超声波提取与含量测定 5 4 1 海蒿子的脱脂 7 4 2 海蒿子多糖含量的测定 7 4 2 1 糖含量的测定方法 7 4 2 2 苯酚试剂的制备 7 4 2 3 绘制葡萄糖溶液标准曲线 7 4 3 海蒿子多糖提取工艺的研究 8 4 4 海蒿子的总糖含量测定 9 5 结果与分析结果与分析 9 5 1 蒿子粗多糖正交实验结果及分析 9 5 2 海蒿子多糖的分析 10 目 录 5 2 1 红外光谱分析 10 5 2 2 海蒿子多糖还原能力测定 11 5 2 3 海蒿子多糖对超氧阴离子自由基 O2 的抑制作用 11 6 结论结论 13 鸣鸣 谢谢 14 参考文献参考文献 15 摘 要 I 摘摘 要要 目的 本实验首先研究海蒿子中多糖的超声波提取工艺 方法 在料液比分别为 1 20 采用 正交设计优化海蒿子多糖的提取工艺 并用硫酸 苯酚比色法对多糖的含量进行测定 接着对海蒿 子多糖进行了红外光谱的分析 然后对海蒿子多糖进行还原能力的测定和抗氧化活性的研究 结果 最佳提取条件为 超声波功率为 480W 提取时间 160min 提取频率 20Hz 在此条件下海蒿子总 多糖提取率为 1 55 红外光谱的分析中 海蒿子多糖表现出了一般硫酸多糖物质的特征吸收峰 而还原能力的测定和抗氧化活性方面的研究 则表明海蒿子多糖随着浓度的增大还原性越强 并有 较强的还原性 而且对超氧阴离子自由基 O2 有较强的清除作用 结论 海蒿子多糖进行最佳提 取工艺条件和其活性的研究将有利于海蒿子的开发和利用 关键词关键词 海蒿子 多糖 超声波 提取 ABSTRACT II ABSTRACT Objectives First of all this experiment study on the ultrasonic extraction technology of polysaccharide from Sargassum pallidum than in the sauce were 1 20 using orthogonal design optimization of extraction process of polysaccharide from Sargassum pallidium and polysaccharide content by phenol sulphate Colorimetry determination Infrared spectrum analysis of polysaccharide from Sargassum pallidium then restore ability of polysaccharide from Sargassum pallidium determination and study on the antioxidant activity of Results optimal extraction conditions for ultrasonic power for 480W extraction time 160min extraction frequency 20Hz this conditions Xia from Sargassum pallidium total polysaccharide extraction rate for 1 55 infrared spectrum of analysis in the from Sargassum pallidium polysaccharide performance out has general sulfuric acid polysaccharide material of features absorption peak and restore ability of determination and anti oxidation activity area of research is indicates that from Sargassum pallidium polysaccharide as concentration of increases restore sexual more strong and has strong of restore sexual and on Super oxygen Yin ion free base O2 With strong clearing effect Conclusion The optimum extraction conditions of polysaccharide from Sargassum pallidium and its activity will benefit from Sargassum pallidium s development and use it KEYWORDS Sargassum Pallidium Polysaccharide Ultrasonic Extracting 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 1 超声波法辅助提取海蒿子多糖及分析超声波法辅助提取海蒿子多糖及分析 制药工程 200811931331 余灵锋 指导老师 郝心敏 1 绪论 1 1 前言 海蒿子 Sargassum pallidum 是生长在温带水域的褐藻门马尾藻科植物 我国黄海 渤海沿岸各 地习见种 生长于潮间带的石沼中和大干潮线下 1 至 4 米深处的岩石上 海蒿子形体特征为 藻体 褐色 高一般 30 60 厘米 可达 1 米 固着器盘状 上有单生 偶有双生或三生的圆柱状的主干 初生分枝自主干钝角羽状出生 为一年生 完成生殖任务后即行凋落 但在主干表面上遗留一个清 晰的圆锥形突起 第二年 新枝在突起上部生出 初发生时 部分旧枝仍然残留在主干上 主干自 顶端逐年增长 圆锥形的突起也逐渐增多 海蒿子除含有丰富的营养物质 如 藻胶酸 粗蛋白 甘露醇 灰分 钾 碘外 还含有大量的褐藻多糖 主要包括褐藻糖胶 褐藻胶和褐藻淀粉 是中 药海藻水提取物的主要部分 是作用较显著 研究较多的一类生物活性物质 中药大辞典 记载 海蒿子性苦 咸 寒 入肺 脾 肾经 具有软坚 消痰 利水 泻 热之功效 可用于治疗瘰疠 瘿瘤 积聚 水肿 脚气和睾丸肿痛等症 1 日本 美国 挪威等 国家从我国传统中药昆布受到启发 特别是从我国沿海居民食用海藻后能软化血管 抗肿瘤 增强 人体免疫功能等方面受到启示 从褐藻中提取分离得到了褐藻糖胶 并且证明了这种多糖具有抗肿 瘤 抗凝血 降血脂 解重金属中毒和抗 HIV 的作用 2 3 海蒿子的药用活性是确切可靠的 对其化学活性成分 结构 抗癌活性 新药的开发及海洋资 源的应用进行研究有着重要的科学价值和经济意义笔者前期已对海蒿子多糖的提取工艺及脱蛋白方 法进行了一系列的研究 在此探讨海蒿子粗多糖的抗氧化活性 这不仅可为海篙子多糖生理活性的 研究提供参考 也可为海篙子的开发利用和新药研制创造条件 1 2 大分子多糖的概述 多糖 Polysaccharides 是自然界含量最丰富的物质之一 广泛存在于动物细胞膜 植物和微 生物细胞壁中 是与人类生活紧密相关的一类生物大分子 对维持生命活动起着重要的作用 多糖 核酸和蛋白质并称为生命三大物质 多糖来源十分丰富 广泛存在于动物 植物 微生 物 细菌和真菌 和海藻中 如植物的种子 茎和叶 动物粘液 昆虫及甲壳动物的壳真菌 细菌 的胞内外等 从动植物器官组织 菌类及微生物发酵产物中可得到不同种类的多糖 按其来源可 分为高等植物多糖 动物多糖 微生物多糖 藻类多糖 多糖类物质作为药物始于 1943 年 大多数多糖类物质无毒性 是一种比较理想的药物 近年 来 随着研究海洋生物方法的不断改进及现代化分离技术的有效使用 多糖及其生物活性的研究 从陆地延伸到海洋 海藻是海洋植物中数量 品种最多的一类 具有陆生植物所不具有的分子结构 及生理 生化特性 有着不少特殊的医疗保健功能 对治疗人类的常见病 多发病具有显著的疗效 4 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 2 多糖的生物学功能是多种多样的 除众所周知的多糖在生物体内有的是贮存物质 有的是结构 支持物 有的是机械保护作用等等外 随着对糖类在生命现象中重要性的不断认识 发现生物多糖 可以携带巨大的信息量 而成为参与生命现象中形形色色识别作用的基础 不论是生物体作为通讯 识别的信息分子还是细胞间的识别无不与糖链有关 近年来 大量研究表明多糖具有免疫调节 降血糖 降血脂 抗肿瘤 抗病毒 抗氧化 抗衰老 抗凝血 抗溃疡 防辐射等多种生物学功能 植物源的多糖类化合物由于它们的独特功能和很低的毒性 因而在临床应用中显示出越来越广阔的 前景 主要体现在以下几个方面 1 2 1 抗肿瘤药 将多糖作为抗肿瘤药是由于人们对当前癌症化疗药物不满意 虽然化学家们合成了无数个对癌 细胞有相当强杀伤作用的化合物 但它们在杀死癌细胞的同时也同样损伤正常细胞 临床上表现出 很多副作用 尤其对患者免疫系统的损害 目前除香菇多糖外已有不少多糖类化合物作为抗肿瘤免 疫治疗药物经过了卫生部门的批准 正式用于临床 其中有代表性的 如裂褶多糖 云芝多糖 猪 等多糖等 5 据不完全统计 来源于植物的抗癌制剂已占抗癌剂总数的 32 5 6 1 2 2 治疗艾滋病 AIDS 等抗病毒药 近年来发现硫酸化多糖 如硫酸葡聚糖 角叉菜胶 肝素 硫酸软骨素等对人类免疫缺陷病毒 HIV 有抑制作用 7 其作用机制可能有 3 种途径 一是硫酸化多糖能抑制逆转录酶的活性 而 HIV 是一种逆转录酶病毒 二是能抑制靶细胞与病毒的结合 三是能增强机体免疫功能 这可能是 多糖在整体状况下抗 H IV 的重要机理之一 目前现有抗艾滋病的药物 如 AZT ddc 天花粉蛋白 等其毒性均较大 存在着严重的毒副作用 难以推广应用 因此 寻找新的毒性小的抗 HIV 药物已 成为科学家们所关注的问题 而硫酸化多糖很有希望成为高效低毒的抗艾滋病药物 但同时也必须 解决如何使带阴离子的高分子量硫酸化多糖通过血脑屏障 以及消除硫酸化多糖的抗凝血活性的不 良反应 1 2 3 抗衰老药 到目前为止 对衰老发生的机理有众多的学说 如遗传学说 自由基学说 交联学说以及免疫 功能下降学说等等 其中持免疫功能学说的科学家认为 免疫功能具有增龄性变化 即年龄增大 其免疫功能下降或紊乱 结果胸腺萎缩 T 细胞损耗 从而导致机体衰老 寿命缩短 由于多糖类 化合物可以增强老年人的免疫功能 因此很有希望将它们作为抗衰老药应用于临床 1 2 4 降血脂和抗凝血 一些多糖类物质结构与肝素类似 能促进脂蛋白脂肪酸释放 使血液中大分子的脂质分解成小 分子 因而对血脂过多引起的血清浑浊有澄清作用 也能明显降低血胆固醇 国外研究表明 海蒿 子多糖有抗高血脂活性 从铜藻中制成的海带淀粉 经磺化后有防治冠心病人的凝血和血栓的形成 作用 洋栖菜中的褐藻淀粉的磺化产物可显著降低小鼠由高脂饲料所致的血脂水平升高 而且还有 抗凝血作用 近年来人们对海藻多糖已做了大量的研究 但在海藻多糖的结构鉴定方面研究的尚欠 深入 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 3 1 3 常用的提取方法 多糖是极性大分子化合物 常用的提取方法有 热水浸提法 稀碱浸提法 酸浸提法和酶法 前三种为化学方法 酶法为生物方法 稀酸提取时 时间宜短 温度不宜超过 50 一般植物多 糖提取多采取热水浸提法 在提取多糖之前 首先要根据多糖的存在方式及提取部位的不同 决定 在提取之前是否作预处理 动物多糖和微生物的细胞内多糖的组织细胞多有脂质包围 一般需先加 入醇或醚进行回流脱脂 释放多糖 然后依多糖性质 如酸碱性 胞内或胞壁多糖 再将脱脂后的 残渣采用以水为主体的溶剂 冷水 热水 稀盐或稀碱水 或热的稀盐或稀碱水 等溶液提取 溶 剂性质 浸提温度 时间等均影响提取效果 现在 提取多糖还多采用酶法 常用的酶有纤维素酶 果胶酶 蛋白酶及其复合酶 1 4 海蒿子多糖的概述及其研究 1 4 1 海蒿子多糖的概述 许多研究工作表明 海藻是许多海洋生物活性物质的重要来源 海蒿子多糖又是海藻中一类重 要的生物活性物质 是海蒿子的重要组成成分 主要成分为马尾藻聚糖等 中国海洋药物辞典 记载 马尾藻聚糖是一种多肽类多聚糖化合物 主要由 D 半乳糖 D 木糖 D 岩藻糖 D 甘露糖和 D 葡糖糖醛酸等构成 8 1970 年 Ovodov 等 9 从海蒿子中提取出硫酸蛋白结合多糖 经凝胶过滤 离子交换法纯化 电泳法证明为均一多糖 1973 年 俄国人 Krasikova IN 等 10 用气 2 液色谱对海蒿子多糖的结构进行了鉴定 1985 年 Usov AI 等 11 通过对海蒿子多糖进行酸降解及片断分离 证明其是由岩藻糖 葡萄糖 D2 甘露糖及葡 萄糖醛酸组成 1998 年 湖北中医学院的芦金清等 12 用水煎法从海蒿子中提取出水溶性多糖 用乙醇 沉淀法对其纯化 并用电泳法证明其为均一多糖 并用纸层析及红外光法鉴定其结构 近年来研究表 明 13 海蒿子提取液具有抗癌 抗衰老和增强免疫机能等作用 近年来的研究表明 海蒿子多糖具有降血脂 抗肿瘤等生物活性及药用功能 14 15 1 4 2 国内外海蒿子多糖提取的研究 海蒿子多糖的提取 一般都先用石油醚或甲醇将海蒿子原料物质脱脂 如需要脱色的 则在室 温下用 H2O2 pH 8 脱色 脱脂后的残渣或不需要脱脂的海蒿子原料常用水作溶剂来提取粗多糖 或 用酸性水溶液作为溶剂来提取粗多糖 所以海蒿子多糖的提取方法主要可分为以下两种 1 水提方法 取 10 g 海蒿子干粉置于具塞三角瓶中 加入 100 ml 3 7 甲醛 16 溶液浸泡过夜 次日加入 200 ml 蒸馏水 75 水浴提取 4 小时 160 目纱网趁热抽滤 滤液冷却后 透析液硅藻土过滤 滤液减压 浓缩至其 1 4 体积 加入 4 倍体积乙醇将多糖沉淀后抽滤 放入烘箱中干燥得淡黄色固体 加入蒸馏水 溶解 加入 0 05 mol L 的 MgCl2 溶液和 18 ml 的乙醇沉淀 离心取上清液 减压浓缩至少许 干燥得 粗多糖 C1 2 酸提方法 取 100 g 海蒿子干粉 加入 1000 ml 0 1 mol L HCl 溶液提取 室温搅拌 1 h 后过滤 重复操作三遍 合并滤液 滤液减压浓缩至总体积的 1 5 再加入 95 乙醇至乙醇浓度达 30 沉淀 离心除去沉淀中 的褐藻酸 继续向上清液中加入乙醇至乙醇浓度达 70 室温放置过夜使沉淀完全 离心 沉淀干燥得 海蒿子粗多糖 C2 17 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 4 1 4 3 海蒿子多糖的药理学研究 一 海蒿子多糖的降血脂机理 海蒿子活性多糖的主要成分为马尾藻聚糖 为可溶性多糖 并含有大量活性基团如硫酸根等 其降血脂机理可能是因为海蒿子活性多糖的活性基团能够螯合吸附肠道内胆汁酸 胆固醇 减少胆 汁酸重吸收 增加粪便胆汁酸排泄 阻断胆汁酸的肠肝循环 同时海蒿子活性多糖可降低消化道对 膳食胆固醇的吸收率 另外 海蒿子活性多糖被大肠内细菌发酵降解 所产生的脂肪酸可抑制胆固 醇的生物合成 18 二 海蒿子多糖 DEI DEII 的抗癌活性 采用 MTT 抗癌活性筛选方法对多糖 DEI DEII 作 P2388 白血病细胞株 筛选 经国家新药筛选 中心鉴定两种多糖均有活性 1 5 实验内容的概述 本实验先将海蒿子进行粉碎 然后采用石油醚将海蒿子进行脱脂处理 然后利用超声波的提取 工艺进行提取其多糖 采用的是正交设计优化海蒿子多糖的提取工艺 并用硫酸 苯酚比色法对多 糖的含量进行测定 对其提取的结果进行分析计算出海蒿子的总提取率 便得到超声波法提取海蒿 子多糖的最优提取条件 并对海蒿子多糖进行还原能力和抗氧化能力的测定 最后对海蒿子多糖还 进行了红外光谱的分析 2 本课题的研究内容及意义 2 1 研究内容 本文通过正交实验的方法 对超声波提取海蒿子多糖工艺优化 从而寻找出超声波提取海蒿子 多糖的最佳提取工艺条件 并将提取出来的海蒿子多糖进行还原能力和抗氧化能力的测定 最后还 做了海蒿子多糖的红外分析 以更全面地了解海蒿子多糖的特性与结构 2 2 研究意义 目前我国对于海蒿子多糖提取工艺的研究比较少 对其特性和结构的研究也不是很多 而海蒿 子多糖能够抗肿瘤和降血脂 在药用方面有着不错的应用价值 超声波法提取多糖是属于比较先进 的多糖提取方法 与传统的多糖提取方法比具有不可比拟的优势 提取时间短 耗能低 将超声波 法应用于海蒿子多糖的提取 并利用正交实验的方法寻找出其提取的最佳工艺条件 将有助于更好 地开发海蒿子 使其更好地为我们人类服务 本文还对超声波法提取出来的多糖进行还原能力和抗 氧化能力的测定 最后还作了红外光谱分析 从而更全面地了解海蒿子多糖的特性与结构 3 实验部分 3 1 实验材料 材料 海蒿子 采于湛江海域沿岸 并将采得的海蒿子洗干净晒干粉碎备用 3 2 实验试剂 主要试剂 盐酸 AR 广州化学试剂二厂 石油醚 AR 广州化学试剂厂 95 乙醇 AR 广东光华化学厂有限公司 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 5 硫酸 AR 衡阳市凯信化工试剂有限公司 六水合三氯化铁 AR 广东光华科技股份有限公司 磷酸二氢钠 汕头市光华化学厂 葡萄糖 汕头市光华试剂厂 3 3 实验仪器 主要仪器 全数字超声波发生器 武汉嘉鹏电子有限公司 WQF 310 傅立叶红外光谱仪 安捷伦 FA1104 型电子天平 上海天平仪器厂 RE 52C 型旋转蒸发器 巩义市英峪予华仪器厂 UV 2102 PCS 型紫外可见分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司 GZX 9070 MBE 型数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备 TDL 40B 台型式离心机 上海安亭科学仪器厂 电热恒温水浴锅 沈阳莱克斯仪器制造有限公司 SHB 循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司 酸 碱式滴定管及各种玻璃器皿 回流装置 索氏提取装置等 4 海蒿子多糖的超声波提取与含量测定 海蒿子多糖的超声波提取及分析的工艺流程图 如图 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 6 海蒿子 石油醚脱脂 超声波提取 离心 残渣上清液 蒸发浓缩到原体积的 1 4 加 3 倍 95 乙醇 置 24 小时 离心 上清液棕色沉淀 多糖 置烘箱烘干 还 原 能 力 测 定 抗 氧 化 能 力 测 定 红 外 光 谱 分 析 图 4 1 海蒿子多糖的超声波提取及分析的工艺流程图 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 7 4 1 海蒿子的脱脂 取粉碎好的海蒿子 10g 用滤纸包好置于索氏提取器中 加入石油醚 300mL 55 C 恒温水浴 回流约 3h 至海蒿子不再脱色为止 则脱脂完成 多进行几次脱脂操作 将脱脂好的海蒿子倒出 晾干后置于干燥皿内备用 4 2 海蒿子多糖含量的测定 4 2 1 糖含量的测定方法 利用苯酚 硫酸法 19 测定糖含量 原理是硫酸多糖在硫酸的作用下先水解成单糖份子 并迅速 脱水生成糖醛衍生物 然后与苯酚发生显色反应 并在 490nm 处的吸光度与其含糖量呈线性关系 由此可测样品中硫酸多糖的糖含量 4 2 2 苯酚试剂的制备 称取 100g 苯酚 0 05g 碳酸氢钠和 0 1g 铝片 常压条件下蒸馏 收集 182 的馏分 5g 然后 置 100mL 容量瓶中 并定容至刻度 摇匀后虑至棕色试剂瓶中 得 5 苯酚溶液 置冰箱中储存备 用 20 4 2 3 绘制葡萄糖溶液标准曲线 准确称取干燥至恒重的葡萄糖 100mg 用蒸馏水溶解 定容至 100mL 容量瓶中 摇匀配成 0 20mg mL 的葡萄糖标准溶液 分别移取葡萄糖标准溶液 0 5mL 1 0 mL 2 0mL 3 0mL 4 0mL 5 0mL 置于 100mL 容量瓶中 加蒸馏水定容 分别取系列标准溶液 2 0mL 加入具塞试管中 再加入 5 苯酚溶液 1 0mL 摇匀后迅速加入硫酸 5 0mL 摇匀 室温放置 5min 90 C 水浴加热 15min 冷却至室温 以蒸馏水做参比 测定在波长 490nm 处的吸光度 见 表 4 1 以葡萄糖标准溶液的吸光度 A 对其糖浓度 Cg 作图 其标准曲线见图 4 1 所示 表 4 1 葡萄糖标准溶液吸光度 A 浓度 mg mL 00 0050 010 020 030 040 05 吸光度 A 00 06830 11550 25030 38270 49980 6359 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 8 葡萄糖溶液标准曲线 y 12 68x 0 0018 R2 0 9994 0 1 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 00 010 020 030 040 050 06 浓度 mg mL 吸光度A 系列1 线性 系列1 图 4 2 葡萄糖溶液标准曲线 4 3 海蒿子多糖提取工艺的研究 为了进一步综合确定超声波功率 超声波频率和提取时间 3 个因子对海蒿子多糖产率的影响 本实验设计了正交表 L9 33 各因素 水平如表 4 2 所示 表 4 2 超声波法提取海蒿子多糖正交实验因素水平表 因素 ABC 水平 功率 W 时间 min 频率 Hz 13608020 248012030 360016040 按照正交表 L9 33 将各个条件组合成 9 个实验组进行实验 每次称取经过脱脂的海蒿子 2 0g 置于具塞的三角烧瓶中 并加入 20mL 的水 然后置于超声波仪器中进行超声提取 提取结束 后 将其进行离心 5min 取上清液进行蒸发浓缩 浓缩到原来体积的 1 4 为止 再加入 3 倍体积 95 乙醇静置 24 小时 再将其进行离心 保留棕色沉淀 并将其置于烘箱中 45 中烘干 将烘干 的海蒿子多糖称量并记录 海蒿子粗多糖提取率的计算方法 海蒿子粗多糖提取率 粗多糖重量 海蒿子原料重量 100 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 9 4 4 海蒿子的总糖含量测定 准确称取干燥至恒重的海蒿子多糖样品 10mg 定容于 100mL 的容量瓶中 配成海蒿子多糖样 品液 取 1 0mL 粗多糖溶液于具塞试管中 加入 5 苯酚溶液 2 0mL 然后按照标准曲线项下的的方 法操作 测定其吸光度 并由标准曲线方程求出溶液浓度 根据公式 多糖含量 C V 10 100 C 测定的样品浓度 V 样品的体积 计算多糖含量 5 结果与分析 5 1 蒿子粗多糖正交实验结果及分析 超声波法提取海蒿子粗多糖正交实验结果及分析如表 5 1 所示 表 5 1 正交条件组 试验号功率 W 时间 min 频率 Hz 多糖产率 136080207 89 2360120308 03 3360160408 05 448080306 85 5480120405 46 6480160209 69 760080404 63 8600120205 70 9600160306 31 k17 996 467 76 k27 336 397 06 k35 568 016 05 极差 R 2 441 621 71 优组合 A2B3C1 海蒿子多糖的最佳工艺 由表 5 1 结果可得 时间的极差最大 其次是超声波的功率 再是超声波的频率 因此各因素 的主次关系为 时间 B 功率 A 频率 C 再结合 K 值可得 提取海蒿子多糖的最佳组合为 A2B3C1 即超声波功率为 480W 提取的时间为 160min 超声波的频率为 20Hz 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 10 5 2 海蒿子多糖的分析 海蒿子多糖含量测定 按 4 4 法操作测得 A 值为 0 2072 代入公式计算海蒿子多糖含量为 1 55 5 2 1 红外光谱分析 在远红外灯下将 1mg 干燥的海蒿子多糖粉末与 100mg 溴化钾混合在玛瑙研钵中研磨均匀 经 压片机压成薄片 在 4000 450cm 1 波数范围进行红外光谱扫描 观察谱峰情况 见图所示 海蒿 子多糖表现出了一般硫酸多糖物质的特征吸收峰 在 3433cm 1 处出现了一宽峰 是 O H 的伸缩 振动 表明多糖存在分子间和分子内氢键 该多糖在 2927cm 1 出现了一吸收峰 在 3000 2800cm 1 区域内的吸收峰是糖类的特征峰 是多糖分子 C H 伸缩振动引起的 在 1637cm 1 处的峰是多糖 中乙酰氨基 NHCOCH3 的伸缩振动 1409cm 1 处是羧基的 C O 伸缩振动引起的吸收峰 1322cm 1 处不是很强的吸收峰是由 C H 的变角运动引起的 也说明了海蒿子多糖是一种酸性多糖 1251cm 1 处的吸收峰是硫酸基 O SO 2 中 S O 的伸缩振动所引起的吸收峰 说明海蒿子多糖 是一种硫酸多糖 1033cm 1 处则是醚 C O C 中 C O 键的伸缩振动 911cm 1 处出现的峰是 C O S 伸缩振动的特征吸收峰 691cm 1 处 D 葡萄吡喃糖环 C O C 的振动吸收峰 如图 5 1 所示 为海蒿子多糖的红外光谱 图 5 1 海蒿子多糖的红外光谱 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 11 5 2 2 海蒿子多糖还原能力测定 试剂配制 磷酸缓冲液 磷酸氢二钠 精确称取7 16g 用蒸馏水定容至100ml 磷酸二氢钠 精确称取 3 12g 用蒸馏水定容至100ml 磷酸缓冲液 0 2mo L PH值为 6 6 量取上述磷酸氢二钠37 5ml 加入上述磷酸二 氢钠 62 5ml 1 铁氰化钾溶液的配制 精确称取0 5g铁氰化钾 用蒸馏水定容至50ml 10 三氯乙酸溶液的配制 精确称取5g三氯乙酸 用蒸馏水定容至50ml 0 1 三氯化铁溶液 精确称取0 1g三氯化铁 用蒸馏水定容至100ml 实验步骤 在 10 ml 试管中分别加入不同浓度 0 1 0 3 0 5 0 7 1 0mg ml 提取液 0 5 ml 磷酸盐缓冲溶 液 0 2 mol L pH 6 6 2 5 ml 和 1 铁氰化钾 2 5ml 置于 50 水浴中反应 20 min 后急速冷却 然后 加入 10 三氯乙酸 TCA 2 5ml 混匀后 3000 r min 离心 10 min 吸取上清液 5ml 加 1ml0 1 三氯化铁 溶液 再加 4ml 蒸馏水 以溶剂代替样品做空白 摇匀后在 700 nm 处测定吸光值 其结果如图 5 2 所示 海蒿子多糖还原能力随浓度的变化 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 1 2 1 4 00 20 40 60 811 2 样品浓度 mg mL 吸光度 A 系列1 图 5 2 海蒿子多糖还原能力随浓度的变化 图 5 2 表明 随着多糖浓度的增大 吸光度逐渐增大 其还原力也逐渐增强 说明海蒿子多糖是 良好的电子供应者 5 2 3 海蒿子多糖对超氧阴离子自由基 O2 的抑制作用 试剂配制 Tris Hcl缓冲液 0 1mol L的盐酸 取浓盐酸 密度为1 18 36 4 2ml 加双蒸水稀释至500ml 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 12 0 1mol L的Tris溶液 取3 0285g Tris 加水溶解 配成250ml Tris Hcl缓冲液 pH为8 4 浓度为0 1mol L 取 86ml 0 1mol L的盐酸和 250ml 0 1mol L的Tris 溶液 加双蒸水稀释至 500ml 10mmol L HCl 取 0 1mol L的盐酸10ml 加双蒸水稀释到100ml 6mmol L 邻苯三酚 精确 精确称取 0 07567g邻苯三酚 加100ml 10mmol L的 HCl 实验步骤 采用邻苯三酚自氧化法 分别考察五种不同浓度 0 1 0 3 0 5 0 7 1 0mg ml 多糖对超氧 阴离子自由基 O2 的抑制作用 按照表 5 2 的方法进行加样 25 保温 20 分 加入预热 25 邻苯三 酚溶液 且加入后快速摇匀 然后以空白作对照测定样品在 325 nm 处的吸光值 每隔 0 5 min 记录 一次 连续记录 4 min 其吸光度如表 5 3 所示 各管的氧化速率及对 O2 的清除率按下列公式计算 氧化速率 最后 1 次记录值 第 1 次记录值 4 清除率 自氧化管氧化速率 样品管氧化速率 自氧化管氧化速率 100 表 5 2 邻苯三酚自氧化法加样表 试剂空白管 ml 自氧化管 ml 样品管 ml Tris HCl4 54 54 5 蒸馏水 0 480 4 邻苯三酚 0 080 08 红海榄黄酮 0 4 总体积 4 984 984 98 表 5 3 自氧化管吸光值数据 时间 s 0306090 12 0 15 0 18 0 21 0 24 0 氧化速 率 平均氧 化速率 第1次 A 0 2308 0 2621 0 2911 0 3208 0 3532 0 3842 0 4133 0 4423 0 4672 0 0589 第2次 A 0 3012 0 3401 0 3763 0 4012 0 4411 0 4686 0 5024 0 5405 0 5679 0 0667 第3次 0 2447 0 2713 0 3028 0 3348 0 3629 0 3910 0 4269 0 4582 0 4857 0 0603 0 0620 广东海洋大学 2012 届本科生毕业论文 13 表 5 4 不同浓度多糖的样品管吸光值数据记录 时间 浓度 0 3 0 6 0 9 0 120150180210240 氧化 速率 0 10 10870 13960 71260 16760 19370 21760 23990 26070 28060 0429 0 30 43260 45600 47720 49670 51470 53140 54650 56080 57450 0355 0 50 67430 69080 70490 71720 72850 73890 74750 75410 76200 0219 0 70 98750 99831 00741 01571 02321 03021 03741 04381 04990 0156 1 01 27421 28231 28871 29351 29831 30251 30621 30971 31280 0097 计算清除率其结果如表 5 5 所示 表 5 5 各浓度样品的清除率 浓度 mg mL 0 10 30 50 71 0 清除率 30 842 764 774 484 4 由上表可以看出海蒿子多糖对超氧阴离子自由基 O2 有较强的清除作用 且随浓度的增高 作 用增强 6 结论 本研究在固液比为 1 20 的条件下进行了超声波法提取海蒿子多糖 并应用了正交试验法分析 了影响超声波提取海蒿子多糖的主要因素 超声功率 提取时间 超声频率 进行最优提取条件 的研究 结果显示 海蒿子多糖超声波提取的最佳工艺条件为 超声波功率为 480W 提取的时间 为 160min 超声波的频率为 20Hz 在此条件下 海蒿子粗多糖的提取率为 9 69 总糖提取率为 1 55 而李俊卿 21 用传统的热水浸提法提取 4 小时 所得到的海蒿子粗多糖提取率为 2 58 总 糖提取率为 0 96 相对比可以知道超声波法提取时间缩短了 42 9 总糖提取率比传统的提高了 61 5 红外光谱分析表明海蒿子多糖具有一般硫酸多糖物质的特征吸收峰 对海蒿子多糖还原能 力测定表明 海蒿子多糖是良好的电子供应者 最后体外抗氧化活性实验证明海蒿子多糖有较强的 抗氧化活性 综上所述 海蒿子可作为进一步提纯和开发海蒿子多糖的抗衰老产品的参考 鸣 谢 14 鸣鸣 谢谢 本论文是在导师郝心敏教授的悉心指导下完成的 所以衷心地感谢她 从选题到查阅 资料 论文提纲的确定 中期论文的修改 后期论文格式调整等各个环节 她都耐心地指导 我 并且多次询问我们研究进程 并提出不少建议 还对本论文的选题 研究方向 理论运 用给予了许多深入的指导 使得论文得以顺利完成在此谨向她致以诚挚的谢意和崇高的敬意 感谢应用化学系化学实验室全体老师们的支持和帮助 为本论文的实验提供仪器 材料以 及在操作中的指导 随着这篇本科毕业论文的最后落笔 我四年的本科生学习进入了尾声 在大学四年的生活 里 我得到了老师们许多的帮助 是他们拓宽了我的视野 丰富了我的学校生涯 四年来 我 的领导 我的师长 我的同学给予我很多的关心和帮助 使我受益匪浅 终身收益 我真心地 感谢他们 参考文献 15