细菌检验的商品化、自动化设备.doc

第十七章细菌检验的商品化、自动化设备本章考点：（1）微量生化反应系统（2）自动化装置 第一节微量生化反应系统一、常用的微量生化反应系统根据细菌的不同生物学性状及其代谢产物的差异，可采用多种生化反应系统鉴定细菌，现已有商品化的成套产品，它多由1024项生化指标组合而成，通过对结果的判定，得出一个37位的数据，查阅编码手册即可获得相应的细菌名称。常用的微量生化反应系统有以下几种：（一）Micro-ID系统本系统主要用于肠杆菌科的细菌鉴定。它是一块带有15个反应池的塑料板，每个反应池含有一种生化反应培养基及试剂。（二）API系统（目前较常用的微量生化鉴定系统）API系统为一块塑料板，上有20个小杯，每个小杯装有不同的生化反应培养基和指示剂。API系统鉴定范围API-20E肠杆菌科细菌API-20NE非肠杆菌科细菌API Staph葡萄球菌属和微球菌属细菌API Strep链球菌属细菌API Coryne棒状杆菌属细菌API 50CHB芽胞杆菌属等革兰阳性杆菌API NH奈瑟菌属、布兰汉菌属和嗜血杆菌属细菌API Canpy弯曲菌和螺杆菌API-20A厌氧菌（三）Minitek系统该系统为带有l2个凹孔的塑料盘。包括34种生化反应培养基及指示剂的滤纸片。（四）肠杆菌-MBl2E系统该系统为一块96个凹孔的塑料板，分8排。可同时鉴定8份标本。每孔含有一种干燥生化培养基，可提供12项生化反应。（五）氧化发酵鉴定系统该系统主要有氧化发酵管可应用于非发酵菌，也可用于气单胞菌等一部分发酵型细菌的鉴定。二、自动化装置（一）半自动微生物鉴定和药敏系统1.VITEKATB （Automicrobic系统） （1）原理：将肉眼观察的结果输入电脑，结果与数据库内的细菌条目比较，自动得到鉴定结果。ATB敏感试验采用半固体培养基，不同的药敏试条含有不同种类抗生素。在24小时内通过观察有无细菌生长以判断药敏试验结果。（2）操作方法：挑取1至数个纯菌落制备为0.5麦氏单位菌悬液，接种试剂条，经35孵育1824小时，观察结果。2.Microscan Panel使用测试板及快速接种系统，人工判读后将其结果输入电脑，得出结果。（二）全自动微生物鉴定和药敏系统1.VITEK系统：该系统可鉴定各种细菌（包括厌氧菌）、酵母菌及细菌的药敏试验。类型有Vitek-32及Vitek-60及Vitek（有两种规格）。仪器采用数码鉴定原理，每个鉴定卡有30项反应，每3个反应为一组，可得一组10位数的数码。Vitek采用快速荧光法测定细菌。Vitek系统有高级专家系统，对药敏结果进行解释性判读。2.MicroScan自动微生物分析系统：该系统可鉴定各种细菌（包括厌氧菌）、酵母菌及细菌的药敏试验。类型有WalkAway-40，WalkAway-96。仪器应用传统呈色反应法，采用快速荧光法测定细菌。药敏部分采用比浊法进行测定。鉴定板有普通和快速两种，后者采用更为敏感的荧光底物，采用酶学方法分析。 第二节血培养系统一、半自动培养仪BACTECA60系统专用于快检血液、脑脊液、胸水及其他正常无菌体液中的细菌。将待测标本接种于含14C-底物的培养瓶中，活菌将利用14C-标记底物而产生14C02，测定气体量并换算成数值。培养瓶种类有需氧培养瓶、厌氧培养瓶、L型菌培养瓶、结核菌药敏瓶等。缺点是放射性废弃物的处理较为困难。二、全自动血培养仪全自动血培养仪软件功能全，操作简便，具有数据连网共享功能。培养瓶放入仪器后即开始连续孵育、轻度震荡培养和自动检测的全自动过程。1.BACTEC9000系列：包括9240型（240瓶）、9120型（120瓶）和9050型（50瓶）三种。BACTEC9000系列利用荧光探测技术（荧光增强法）：全自动连续检测培养瓶内微生物代谢引起的CO2浓度变化，而CO2浓度的改变可直接激活培养瓶底部包埋的对CO2浓度变化高度敏感的荧光物质，在二极管的激发下荧光物质释放荧光，荧光强度变化可直接反应培养瓶内CO2浓度变化。以判定是否有微生物生长繁殖，仪器每十分钟自动进行质控校正，由电脑分析判断细菌培养阴阳性，阳性者发出警报。培养瓶有标准及含树脂（有吸附抗生素作用）的需氧、厌氧瓶、儿童瓶，有真菌培养瓶、分枝杆菌培养瓶。2.BacTAlert系统：该系统为一种全自动微生物培养和监测系统，有120瓶和240瓶两种规格。培养瓶种类有需氧培养瓶、厌氧培养瓶、小儿培养瓶和抗生素中和瓶等。培养瓶底部有特殊的Novel C02感应器，有半渗透性薄膜，将培养基与感应器隔离，只有C02能通过薄膜。当有微生物生长释出C02可渗透至感应器，pH改变使其颜色也改变。仪器每十分种自动检测一次，由电脑分析判断阴阳性。阳性者发出警报。3.VITAL:有VITAL和miniVITAL两种规格。培养瓶有需氧和厌氧培养瓶等。仪器采用荧光法（荧光递减）全自动检测，每隔l5分钟读取每一瓶的荧光读数。自动处理数据，当荧光的光度与对应时间的曲线出现明显倾斜时，检出阳性血培养瓶。本章练习题：A.Micro-ID系统B.API系统C.Minitek系统D.肠杆菌-MB12E系统E.Automicrobic系统（AMS）那一项不属于细菌检验微量生化反应系统答疑编号500735170101正确答案E既可鉴定肠道杆菌又能鉴定厌氧菌的有答疑编号500735170102正确答案B第十八章病原性球菌及检验本章考点：（掌握，熟练掌握）（1）概念（2）生物学性状（3）微生物学检查方法与原理（4）临床意义（致病性、所致疾病）普及共性，单记个性生物学性状形态与结构：革兰染色性，菌体形态，大小，排列状态，特殊结构。培养特性：对气体需求，营养要求，最适pH值，最适温度，在培养基中的生长现象。生化反应：特殊生化。抗原：分类：致病性致病物质所致疾病微生物学检查：针对生物学性状和致病性一、葡萄球菌属（一）概念一群革兰阳性球菌，因常堆聚成葡萄串状而得名。（二）生物学特性1.形态与结构：本属菌革兰染色阳性，呈圆球形，直径0.51.5m，不规则成堆排列，形似葡萄串状，在脓汁、肉浸液培养物中，可见单个，成对或短链排列。无鞭毛和芽胞，有些细菌能形成荚膜。2.培养特性：需氧或兼性厌氧，营养要求不高，通常在肉浸液及肉浸液琼脂或加入血液的培养基上生长良好。最适pH为7.4，最适温度为3537。在普通琼脂平板上经352448h培养，可形成圆形、凸起、表面光滑湿润、边缘整齐并且不透明的菌落，直径为23mm。可产生不同的脂溶性色素，如金黄色、白色、柠檬色色素。在血琼脂平板上，几乎所有的葡萄球菌可产生、和溶血素。对人致病的主要是溶血素。在液体培养基（普通肉浸液）中生长迅速呈均匀混浊状。3.生化反应：触酶试验（+），对糖的发酵反应不规则，多数能分解葡萄糖、麦芽糖及蔗糖，产酸不产气。多数致病性葡萄球菌能分解甘露醇产酸、液化明胶和产生血浆凝固酶。4.抗原：葡萄球菌水解后，用沉淀法可获得两种抗原，即蛋白抗原和多糖抗原。（1）蛋白抗原：为完全抗原，有种属特异性，无型特异性。存在于葡萄球菌的表面，结合在细胞壁的粘肽部分，具有抗吞噬作用，称葡萄球菌A蛋白（SPA）。（2）多糖抗原：是半抗原，具有型特异性，有三种：A型多糖抗原；B型多糖抗原；C型多糖抗原。5.分类6.抵抗力：对理化因素抵抗力强，耐热，耐干燥，耐高盐，是抵抗力最强的无芽胞细菌。（三）致病性及临床意义 葡萄球菌感染的特点是感染部位组织的化脓、坏死和脓肿形成。金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌是引起临床感染最常见的葡萄球菌。1）金黄葡萄球菌2）表皮葡萄球菌是存在于皮肤的正常栖居菌，为医院感染的重要病原菌，它是导致血培养污染的常见细菌之一。3）腐生葡萄球菌是导致尿路感染的常见病原菌之一。（四）微生物学检验方法与原理1.标本采集：根据葡萄球菌感染所致的疾病不同，可采集脓汁、渗出液、伤口分泌物、血液、尿液、粪便、痰液以及脊髓液等。（不同疾病采集不同标本）2.检验方法及鉴定（1）直接镜检：无菌取脓汁、痰、渗出物和脑脊液（离心后取沉渣）涂片，经革兰染色后镜检，如为革兰阳性球菌呈葡萄状排列可初步报告为：“找到革兰阳性葡萄状排列球菌，疑为葡萄球菌”。（2）分离培养：血液标本（静脉血约5ml）注入50ml葡萄糖肉汤或含硫酸镁肉汤增菌培养，迅速摇匀，以防凝固，置35，一般于24h后开始观察有无细菌生长，若均匀混浊，溶血及胶胨状生长，则接种于血琼脂，进一步鉴定，若无细菌生长，于4872h后自行观察（一般以7天为限），并接种血琼脂，以确定有无细菌生长。血液标本也可注入商品血培养瓶培养。脓汁、尿道分泌物、脑脊液离心沉淀物，通常可直接接种血琼脂。351824h培养，可见直径23mm，产生不同色素的菌落。金黄色葡萄球菌在菌落周围有透明的溶血环。尿液标本，必要时作细菌菌落计数。粪便、呕吐物应接种高盐卵黄或高盐甘露醇琼脂平板，经351824h培养，可形成细小菌落，48h后形成典型菌落。（3）鉴定试验 金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌触酶+血浆凝固酶+-甘露醇发酵试验+-新生霉素敏感试验SSR报告：检出“XXX葡萄球菌”（4）耐药性检测：检测耐甲氧西林的金葡菌（MRSA），耐甲氧西林的表葡菌（MRSE），耐万古霉素的金黄色葡萄球菌（VRSA），耐万古霉素的表皮葡萄球菌（VRSE）。NCCLSCLSI推荐用头孢西丁纸片法检测对苯唑西林耐药的葡萄球菌。二、链球菌属（一）概念链球菌属为触酶阴性，兼性厌氧，呈圆形或卵圆形的革兰阳性球菌，在液体培养基中生长时易形成长链而表现为沉淀生长（但肺炎链球菌为混浊生长）。（二）生物学特性1.形态与染色：革兰染色阳性。菌体呈圆形，直径为0.81.0m，呈链状排列，在液体培养基中易成长链。在脓汁标本中为短链，成双或单个散在。无鞭毛、无芽胞、某些菌株在血清肉汤中可有荚膜。2.培养特性：本属细菌大多为需氧或兼性厌氧菌，少数微需氧及专性厌氧。营养要求较高，在含有腹水的培养基上生长良好。最适温度为3537，最适pH为7.47.6，在5%C02环境下生长更好。在血琼脂平板上，经35 1824h培养后可形成灰白色、圆形、凸起、直径为0.10.75mm细小菌落，菌落周围出现不同溶血环。3.生化反应：本属细菌触酶试验阴性（与葡萄球菌属鉴别）4.分类（1）根据溶血能力分类：利用链球菌在血平板上溶血情况分为三类，1）甲型（）溶血性链球菌：又称草绿色链球菌。本菌为条件致病菌。2）乙型（）溶血性链球菌：通称溶血性链球菌，透明溶血环。该型细菌致病性最强，常引起人和动物多种疾病。3）丙型（）链球菌：无溶血环。一般无致病性。（2）根据链球菌细胞壁抗原（即C抗原）分类：即常用Lancefield血清分型法，将链球菌分为A、B、C、DT等18个群（其中和J缺），对人类有致病性的90%属A群，B、C、D、G群链球菌感染较少见。5.对理化因素的抵抗力：不强。（三）致病性A群链球菌：草绿色链球菌：属条件致病菌，常与亚急性心内膜炎相关。B群链球菌：是新生儿肺炎、脑膜炎和败血症的病原体。D群链球菌：引起呼吸道和泌尿道感染。治疗原则：A群链球菌感染，青霉素G被列为首选。B群链球菌常采用青霉素G和一种氨基糖苷类合用。（四）微生物学检验方法与原理1.标本采集：不同疾病采集不同标本。2.检验方法及鉴定（1）直接镜检：革兰染色，镜检。如符合链球菌的形态特征可初报。（2）直接检测抗原。（3）分离培养：血液标本，以无菌操作取两份血液各810ml，分别注入肉汤培养基，分别置需氧和厌氧环境中增菌，有细菌生长，然后分别接种于两个血平板，置需氧和厌氧环境中培养。脓汁和咽拭标本接种血平板并涂片染色镜检，若形态酷似链球菌，并革兰阳性，可初报。上述的培养物经351824h培养后，观察菌落特征和溶血情况。链球菌的菌落通常较小，透明或半透明，似针尖大小、凸起，菌落周围可出现-溶血或-溶血，也可不出现溶血。然后取可疑菌落经涂片、染色镜检证实。甲型溶血性链球菌和肺炎链球菌可产生-溶血，它们的菌落形态非常相似，应予以区别。猪链球菌在羊血平板上为溶血，在兔血平板上呈溶血。（4）鉴定：见生化反应。三、肺炎链球菌（一）概念肺炎链球菌属链球菌科，链球菌属。（二）生物学特性1.形态与染色：革兰阳性，呈矛头状，成双排列，球菌。有荚膜（在人或动物体内易形成），无鞭毛，无芽胞。2.培养特性：需氧或兼性厌氧。最适的温度为3537，最适的pH7.68.0。营养要求较高。在血琼脂平板上可形成脐状菌落，周围有草绿色溶血圈。在液体培养基中培养时间过长，可因产生自溶，培养液可变澄清，管底沉淀。3.生化反应：菊糖、胆汁溶解试验阳性、0ptochin敏感试验阳性。（与草绿色链球菌的鉴别。）（三）致病性致病物质：荚膜。所致疾病主要有大叶性肺炎、支气管炎。（四）微生物学检验方法与原理1.标本采集2.试验方法及鉴定（1）直接涂片检查：经革兰染色，镜检见革兰阳性矛尖状双球菌。（2）分离培养：血液、脑脊液需增菌培养，经葡萄糖硫酸镁肉汤增菌后，肺炎链球菌可呈均匀混浊，而且有绿色荧光。无须增菌培养的脓汁或脑脊液沉渣接种于血琼脂，置5%10%C02环境中，经35 1824h培养后观察茵落，并取可疑菌落作进一步鉴定。（3）鉴定试验1）胆汁溶解试验：阳性。2）菊糖发酵试验：阳性。3）动物试验：小白鼠对肺炎链球菌极为敏感。4）荚膜肿胀试验：阳性。5）0ptochin敏感试验：阳性。6）快速乳胶凝集试验阳性。四、肠球菌属（一）概念肠球菌属是肠道的正常栖居菌。（二）生物学形状为革兰阳性，成双或短链状排列的卵圆形球菌，无芽胞，无荚膜，部分肠球菌有稀疏鞭毛。营养要求高，需氧及兼性厌氧，在胆汁七叶苷和含6.5%NaCl培养基中可以生长（此点可与链球菌鉴别）。在血平板上主要表现为-和-溶血。触酶阴性，多数肠球菌能水解吡咯烷酮-萘基酰胺（PYR）。与同科链球菌的显著区别在于肠球菌能在高盐（6.5%NaCl）、高碱（pH9.6）、40%胆汁培养基上和1045环境下生长，并对许多抗菌药物表现为固有耐药。目前，肠球菌是革兰阳性菌中仅次于葡萄球菌属的重要医院感染病原菌，其所致感染中最常见的为尿路感染，其次为腹部和盆腔等部位的创伤和外科术后感染。临床上分离率最高的是粪肠球菌，其次是屎肠球菌。粪肠球菌的某些菌株在马血、兔血平板上出现溶血。（三）微生物学检查方法与原理合理采取相应标本，如尿液、脓汁、胆汁、分泌物或血液等，以直接涂片进行初步检查。分离培养后，挑取可疑菌落，进行涂片、染色、镜检、触酶试验、胆汁七叶苷试验和6.5%NaCl耐受试验，可鉴定到属。如鉴定到种还需进行必要的生化试验。对具有临床意义的肠球菌应进行体外药敏试验，一般要测试对-内酰胺类尤其是青霉素类（如青霉素、氨苄西林）、万古霉素和氨基糖甙类（如庆大霉素）的敏感性，耐万古霉素肠球菌（VRE）国外检出率较国内高。 （四）治疗原则治疗肠球菌感染一般采用-内酰胺类和氨基糖甙类联合治疗。五、奈瑟菌属奈瑟菌属为一大群革兰阴性双球菌，无鞭毛，无芽胞，有菌毛。专性需氧，氧化酶阳性。本属主要有9个种。其中对人致病的是脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌。（一）脑膜炎奈瑟菌1.概念脑膜炎奈瑟菌简称脑膜炎球菌，是引起流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）的病原体。2.生物学特性（1）形态与染色：为革兰阴性双球菌，菌体呈肾形，成对排列，坦面相对，菌体直径0.61.5m，在患者的脑脊液中位于中性粒细胞内。（2）培养特性：营养要求高，属苛养菌，必须在含有血清或含有多种氨基酸，无机盐等物质的培养基上生长良好。（3）生化反应：绝大多数菌株能分解葡萄糖和麦芽糖，产酸不产气（因淋病奈瑟菌不分解麦芽糖，借此与之鉴别），触酶试验阳性，氧化酶试验阳性。（4）抗原及分型：主要有四种抗原：荚膜多糖群特异性抗原、外膜蛋白型特异性抗原、脂多糖抗原及核蛋白抗原。根据群特异性荚膜多糖抗原不同，采用凝集反应和琼脂扩散试验可将本菌分为A、B、C、D、X、Y、Z、1916、29E和W135等。目前，对人致病的主要是A群，偶见B群、C群及1916群引起散发病例。3.临床意义致病物质：菌毛，荚膜，内毒素。所致疾病：脑膜炎奈瑟菌是流行性脑脊髓膜炎的病原菌。主要表现发热，皮肤瘀斑，脑膜刺激症状。存在于携带者或病人的鼻咽部，借飞沫经空气传播，冬末春初为流行高峰。4.微生物学检验 （1）标本采集：血液；瘀斑渗出液；脑脊液；鼻咽分泌物。因本菌能产生自溶酶，易自溶，故采集的标本不宜置冰箱，应立即送检。（2）检验方法及鉴定：1）直接涂片检查：取脑脊液离心后沉淀物涂片或刺破瘀斑血印片，干燥固定后革兰染色。若发现中性粒细胞内（或胞外）革兰阴性双球菌，呈肾形成对排列，可初报。2）分离培养：将标本葡萄糖肉汤增菌培养液直接接种于血琼脂平板、巧克力琼脂或EPV琼脂，置5%10%C02环境中，35培养1824h后可见圆形、灰褐色、湿润、光滑、边缘整齐、直径12mm的小菌落，经涂片证实为草兰阴性双球菌，并进一步根据相应的生化反应等试验予以鉴定。3）鉴定：细菌染色形态；氧化酶试验阳性；触酶试验阳性；分解葡萄糖、麦芽糖产酸不产气；荚膜多糖抗原直接凝集试验。5.治疗原则：青霉素G为首选，三代头孢对脑膜炎奈瑟菌也具有很强的抗菌活性。青霉素过敏的病人可考虑选用三代头孢或氯霉素。（二）淋病奈瑟菌1.概念：淋病奈瑟菌简称淋球菌，是淋病的病原体，人类是其唯一的天然宿主和传染源。2.生物学特性（1）形态与染色：本菌的形态与脑膜炎奈瑟菌很相似。在脓汁标本中，此菌通常位于中性粒细胞内，而在慢性淋病时常位于细胞外。从患者体内新分离的菌株可有荚膜和菌毛，经人工培养后，呈卵圆形或球形，排列不规则。无芽胞和鞭毛。（2）培养特性：营养要求较高，须在含有血液、血清或多种氨基酸和无机盐类物质的培养基上生长良好。国内常用血液琼脂、巧克力琼脂、EPV琼脂等培养基。初次分离时，须置5%10%C02条件下才能生长。（3）生化反应：可发酵葡萄糖、产酸，但不酵解麦芽糖（常借此与脑膜炎奈瑟菌相鉴别）。氧化酶和触酶试验均阳性。主要有三种抗原：菌毛蛋白抗原、脂多糖抗原和外膜蛋白抗原。对外界抵抗力极低。3.微生物学检验（1）标本采集：脓性分泌物，尿道拭子，宫颈口分泌物，结膜分泌物，血液。（2）检验方法及鉴定：1）直接涂片检查：收集标本后立即涂片、革兰染色。镜检时见中性粒细胞内数对革兰阴性双球菌，可初报。2）分离培养：细菌培养仍是目前世界卫生组织推荐的筛选淋病患者的唯一方法。所采集的标本应及时接种含有两种以上抗生素（万古霉素和多粘菌素等）的营养培养基（EPV）上。淋球菌对培养基的营养要求很高，且对冷、热、干燥和消毒剂抵抗力低，故采样后须立即接种于预温的选择性培养基和非选择性培养基中，如巧克力平板，置于含5%10%的二氧化碳环境中，35培养48h。取小而透明似水滴状、无色素易乳化菌进一步鉴定。3）鉴定：取可疑菌落进行涂片，革兰染色镜检，若见革兰阴性双球形，生化反应：氧化酶阳性，仅分解葡萄糖产酸；免疫学方法：荧光抗体染色法、协同凝集试验；核酸探针杂交法。氧化酶试验阳性，可初判，并进行相关的生化反应，如仅发酵葡萄糖而不发酵麦芽糖与蔗糖，以及30%H2O2试验阳性可与脑膜炎奈瑟菌等相鉴别。4.临床意义：淋病奈瑟菌是常见的性传播疾病淋病的病原菌，主要通过性接触直接侵袭感染泌尿生殖道，口咽部及肛门直肠的黏膜。如单纯性淋病、盆腔炎、淋菌型结膜炎。5.治疗原则：一般为三