12基因工程的基本操作程序

1 2基因工程的基本操作程序 第一步 目的基因的获取 第二步 基因表达载体的构建 第三步 将目的基因导入受体细胞 第四步 目的基因的检测与鉴定 1 从基因所在的生物体直接获取 利用PCR技术扩增目的基因 3 人工合成 2 mRNA反转录成cDNA 目的基因的获取 4 从基因文库中获取目的基因 用 切割目的基因 使其产生 用一定的切割质粒 使其出现一个切口 产生 基因工程的核心 将切下的目的基因片段插入质粒的 处 再加入适量 形成了一个重组DNA分子 重组质粒 限制酶 黏性末端 同种限制酶 同种黏性末端 切口 DNA连接酶 基因表达载体的构建 一 构建目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可遗传给下一代 同时 使目的基因能够表达和发挥作用 二 构建零件及其作用 目的基因 启动子 基因表达载体的组成 RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段 位于基因的首端 RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA 进而获得需要的蛋白质 终止子 标记基因 一段特殊结构的DNA片段 位于基因的尾端 作用是使转录在所需要的地方停止 鉴别受体细胞中是否含有目的基因 从而将含有目的基因的细胞筛选出来 常用的受体细胞 动植物细胞 大肠杆菌 土壤农杆菌 枯草杆菌等 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 转化 目的基因进入 内 并且在受体细胞内维持 和 的过程 受体细胞 稳定 表达 将目的基因导入受体细胞 方法 导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞吸收DNA分子 将目的基因导入受体细胞 检查是否成功 分子水平检测 个体水平鉴定 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 DNA分子杂交 DNA分子杂交 抗原 抗体杂交 目的基因的检测与鉴定 目的基因主要是指 编码蛋白质的结构基因 供体生物细胞 取出DNA 用限制酶剪去多余部分 目的基因 即 将需要的基因从供体生物细胞内提取出来 从基因所在的生物体直接获取 mRNA 互补DNA cDNA 双链DNA 即目的基因 反转录 合成 以目的基因转录成的mRNA为模板 反转录成互补的单链DNA 然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA 从而获得所需的基因 mRNA反转录成cDNA 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 目的基因核苷酸序列 目的基因 根据已知的氨基酸序列合成DNA 人工合成目的基因 从基因文库中获取目的基因 1 基因组文库 将含有某种生物不同基因的许多片段 导入受体菌的群体中储存 各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 称为基因文库 受体菌包含了某种生物所有的基因 该受体菌群体称为这种生物的基因组文库 2 部分基因文库 受体菌包含了一种生物部分基因 该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库 如cDNA文库 用适当限制酶切割 与载体连接导入受体菌群 与载体连接导入受体菌群 基因文库的构建 1 基因组文库的构建 提取某生物全部DNA 许多DNA片段 该生物基因组文库 每个受体菌含有一段不同的DNA片段 2 cDNA文库的构建 mRNA反转录形成 该生物cDNA文库 mRNA 互补DNA cDNA 双链DNA 即目的基因 PCR polymerasechainreaction PCR扩增仪 DNA双链复制的基本原理 一段已知目的基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 一对引物 热稳定DNA聚合酶 Taq酶 DNA的两条链为模板 温度控制 原理 前提 条件 聚合酶链式反应 PCR扩增过程 DNA变性 90 95 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 复性 55 60 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 从引物的5 端 3 端延伸 合成与模板链互补的 氢键 单链DNA 双链DNA DNA链 易感染双子叶植物和裸子植物 Ti质粒的T DNA可转移至受体细胞的染色体上 农杆菌特点 农杆菌转化法 显微注射法 含目的基因的表达载体 动物的受精卵 含目的基因的受精卵 早期胚胎 雌性动物输卵管或子宫 转基因动物 为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵 2 微生物作受体细胞原因 将目的基因导入微生物细胞 3 转化方法 繁殖快 多为单细胞 遗传物质相对少 处理细胞 细胞 表达载体与感受态细胞混合 细胞吸收DNA分子 Ca2 感受态 感受态 1 常用菌 大肠杆菌 枯草杆菌 土壤农杆菌等 该方法是根据碱基互补配对原则 把互补的双链DNA解开 把单链的DNA小片段用同位素 荧光分子或化学发光剂等进行标记 之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交 从而检出所要查明的DNA或基因 分子杂交技术 1 检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因 提取受体生物全部DNA DNA片段 表明目的基因已插入 分子杂交技术 显出杂交带 2 检测目的基因是否转录出了mRNA 显出杂交带 表明目的基因已转录出了m