天然药物化学实验指导全文

天然药物化学实验指导天然药物化学实验注意事项天然药物化学试验的特点是实验周期长,所用溶剂和试剂品种多,而且用量较大。许多有机溶剂具有易燃、有毒、腐蚀性,刺激性和爆炸性等特点。在实验操作过程中又经常需要加热或减压等操作,学生将接触各种热源和电器。如果操作不慎,易引起中毒、触电、烧伤、烫伤、火灾、爆炸等事故。所以要求每个实验操作者,必须加强爱护国家财产和保障人民生命安全的责任心,严格遵守操作规程,树立严密的科学实验态度,提高警惕,消除隐患,预防事故的发生。为了确保实验的安全进行,特作如下要求:一、实验前要必须充分预习实验内容,明确实验原理、操作步骤及注意事项。实验开始前应检查仪器是否完整无损,装置是否正确,经检查合格后方可开始实验。二、实验时要保持室内整齐、清洁、安静。不准做与实验无关的事情,不得擅自离开岗位。在实验过程中应密切观察实验进程是否正常,仪器又无漏气,破裂等现象。三、倒取和存放易燃性有机溶剂时,要远离火源。不得随意将易燃性、易爆性的有机溶剂及药品倒入水槽或污水缸内。不得在烤箱内烘烤留有易燃性有机溶剂的仪器或物品。四、使用精密仪器及电气设备时,应先了解其原理及操作规程,检查好电路,按操作规程进行。遇到不明了的问题应及时向老师请教,切忌自作主张,乱倒以仪器。电线及仪器不应放在潮湿处,不要用湿手接触电器。电器用完后,应立即清理,关好电源。五、回流或蒸馏易燃性有机溶剂时,应检查冷凝水是否畅通,仪器装置是否漏气。不得用明火直接加热,应根据其沸点选用水浴、油浴或砂浴。蒸馏溶剂时要加入沸石,否则将发生爆沸。添加溶剂时要移开水浴,待溶剂冷却后再加,并应重新加沸石。六、实验室中常用的苯、卤代苯、苯酚、苯胺、甲醇、二硫化碳、氰化物、汞和铅盐等化合物均为有毒或剧毒药品。人体中毒的途径一般为消化道、呼吸道或皮肤吸收。所以取用毒剧药时要注意切勿洒在容器外,不要接触皮肤或口腔。室内要通风良好,产生毒气的操作应在通风厨内进行。毒物及废液不得随意乱倒。实验室内严禁进食。七、实验结束时,应将水、电、门窗关妥后,方能离开实验室。八、实验时一旦不慎起火,应沉着冷静,积极灭火。首先立即切断实验室内所有电源及火源,搬走易燃易爆物品,同时针对起火点情况,选用适当灭火器材进行灭火。九、急救常识。(一)外伤:及时取出伤口中的碎玻璃屑或固体物质,用蒸馏水冲洗后涂上红药水,用消毒纱布包扎。大伤口则先按紧主血管,急送医院治疗。(二)火伤:轻伤可在伤面涂以硼酸凡士林。重伤则须请医生诊治。(三)试剂灼伤:1.酸灼伤:立即用大量水冲洗,然后用3%碳酸氢钠溶液蘸洗。2.碱灼伤:立即用大量水冲洗,然后用1%醋酸溶液蘸洗。实验一 薄层板的制备、活度测定及薄层层析、纸层析的应用一、 实验的目的要求：1. 掌握TLC、PC的原理。2. 掌握薄层层析板的制备及薄层层析、纸层析操作的基本方法。了解展开剂、吸附剂的选择以及与被分离物质的关系。3. 应用薄层层析法、纸层析法检识中药草中的化学成分。二、 层析分类与应用概述中草药的研究、鉴定工作中，对探讨中草药中含有哪些化学成分，如何将中草药中的有效成分提取、分离、精制，并鉴定结晶纯度等等。除常用的经典方法外，仍因中草药中化学成分复杂，许多成分结构类似，有效成分含量极少，仅仅采用经典方法往往难以达到分离的目的，所以必须配合各种近代的分离方法，其中常用分离效率高、操作较简便的层析分离法（Chromatography）。由于有效成分的类型不同、性质不同，因此选择层析法的种类也不同。可参阅教科书第二章第二节层析法的内容。本实验着重介绍薄层层析法（Thin-Layer Chromatograp-hy,TLC）以及纸层析法(Paper Chromatograp、PC)的应用。这些方法主要用于选择粗提取物的分离条件;化合物纯度的鉴定;制备一定量的某些化合物;或在薄层选用不同配比的混合溶剂。吸附层析主要考虑的是展开剂的极性;但被分离物质在展开剂中的溶解度也要影响到它的层析行为。在一种吸附上用多种展开剂试验后如果分离不成功,可改用另一种吸附剂来试验。分离的化合物在板上的比移值(Rf)在0.2-0.8之间为好。二组分之间Rf差值0.05,以免斑点重叠。(展开剂选用举例见教科书第19页表2-8)。在吸附层析中，吸附剂的活度，展开剂的极性，被分离物质的极性，是层析条件三要素，这三者的关系是相互联系的，见图。当A指向中极性物质时，则B就指向选用中等活度的吸附剂，C就指向选用中等极性的展开剂。如分别转到ABC的位置，则又是另一种情况。分配薄层层析有些强极性化合物，能被吸附剂强烈吸附，用洗脱能力很强的溶剂仍很难推动。这时就必须选用分配层析。它是利用被分离物质在两相中（如水和非极性有机溶剂中）分配系数的不同而达到分离的目的。分配薄层层析常用的担体有硅胶、硅藻土、纤维素等。选择展开剂的根据是被分离的物质在展开剂（固定相、流动相）中的溶解度相差最大的溶剂组成不同的比例，为首用试剂。化合物在流动相中的溶解度愈大，则它在分配层上移动得愈远，比移值就愈大。流动相应先用固定相饱和，固定相种类有水、不同PH的缓冲溶液、亲水有机相（甲酰胺、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇等）。流动相为含固定相（常用如水）的有机溶剂，有时为了防止弱酸、弱碱的解离，加入少量的酸和碱。薄层层析展开后的斑点检出，通常先在可见光下观察，划出有色物质的斑点位置，然后在紫外光分析灯下观察有无吸收或荧光斑点，并记录其颜色、位置及强弱，最后利用各化合物的特性反应，用喷雾器均匀地喷洒适当的显色剂，使层析谱显色。各类化合物所用的显色剂见附录4。络合薄层层析在络合剂处理的吸附剂上进行吸附薄层层析行为时，不饱和化合物（络合物的供体）与络合剂（金属离子既络合物的受体）形成络合物。在层析时可按照被分离的化合物不饱和度的位置、几何异构等情况，所形成络合物的络合强度不一，导致比值不同达到相互分离的目的。饱和脂肪酸不与受体络合，推向薄层的最前沿；含双键的比含三键的吸附牢；末端双键 或环外双键比不是这种类型的吸附牢。 由于硝酸银的存在影响一些显色剂的灵敏度，如碘蒸气很少用于该法的显色。有关络合层析各类化合物的溶剂系统及显色剂见附录4。三、 一般操作技术（一）薄层层析薄层板的制备1. 不加粘合剂的薄层板涂布法（1） 氧化铝薄层将吸附剂置于薄层涂布器中，调节涂布器的高度，向前推动，即得均匀薄层。本实验主要用下述简易操作涂布薄层，取表面光滑，直径均一的玻璃棒一支，依据所制备薄层的宽度、厚度要求，在玻璃棒套上厚度为0.3-1mm的塑料圈或金属环，以使玻璃棒向前推动时能保持平行方向，操作时，将氧化铝粉均匀地铺在玻璃板上，按下图所示方式推动。2413（2）纤维素薄层，一般取纤维素粉1份加水约5份，在研缸中混合均匀后，倒在玻璃板上，轻轻振动，使涂布均匀，水平放置，待水分蒸发至近干，于1002干燥30-60分钟即得。（3）聚酰胺薄层，取锦纶丝（无色干净废丝即可）用乙醇加热浸泡2-3次，除去蜡质等。称取洗净得锦纶丝1g，加85%甲酸5ml，在水浴上加热使溶，再加70%乙醇6ml，继续加热使完全溶解成透明胶状溶液。将此溶液适量倒在水平放置的、用清洁液洗净的玻璃片上，并自然向周围摊匀，厚度约为0.3mm，薄层太厚时，干后会裂开。将铺好的薄层水平放在盛温水的盘上，使盘中的水蒸气能熏湿薄层，盘子加玻璃板盖严密。薄层放置1小时完全固化变不透明白色，再放数小时后，再泡在流水中洗去甲酸，先在空气中晾干，后在烘箱中80恒温加热活化15分钟，冷后置干燥器中贮存备用。2. 加粘合剂薄层的涂布法（1）硅胶G薄层，取硅胶G或硅胶GF1份，置研钵中加水约5份，研磨均匀，放置片刻，随即用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推动涂布）均匀涂布成0.25-0.5mm厚度，轻轻震动下玻璃板，使薄层面平整均匀，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中110烘干活化1-2小时，冷后贮于干燥器中备用。活化烘干温度时间可依据需要调整。一般鉴识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。（2）硅胶（H）羧甲基纤维素（CMCNa）薄层，取羧甲基纤维素0.2g，溶于25ml水中，在水浴上加热搅拌，使完全溶解，倒入研钵中加硅胶细粉（一般硅胶细粉过300目筛的，约6-8g，过200目筛的，约需10-20g，）研磨成稀糊，照硅胶G薄层涂布法制备薄层。或取2块2.5mm厚度的玻璃长板，中间夹一至几块2.2mm厚的薄层用玻璃片，将适量硅胶糊倒在中间，用药匙适当涂匀，另取一块边缘较平整的玻璃片将硅胶糊刮平，推出薄层板，水平放置，自然晾干后再活化贮存。 氧化铝G薄层、氧化铝羧甲基纤维素钠薄层的制备方法同上，一般所需氧化铝量比硅胶稍多。硅胶烧结薄层采用硅胶细粉混合一定量的玻璃细粉，涂布在玻璃板上，在高温下将薄层烧结在玻璃板上，一般薄层厚度0.25mm，薄层用后经过处理，可以多次重复使用。3.特制薄层的制备根据分离工作的特殊需要，可制成以下几种特制薄层。（1）酸、碱薄层和PH缓冲薄层为了改变吸附剂的酸碱性，以改进分离效果，可在吸附剂中加入稀酸溶液（如0.1N-0.2N草酸溶液）代替水制成酸性氧化铝薄层使用。硅胶微呈酸性，可在铺层时用稀碱溶液（如0.1N-0.5N氢氧化钠溶液）代替水制成碱性的硅胶薄层。当用乙酸钠，磷酸盐等不同PH的缓冲薄层。（2）络合薄层硝酸银薄层的制法，可在吸附剂中加入5-25%硝酸银水溶液代替水制成均匀糊状，在按常法铺成薄层。制成薄层避光阴干，于105活化半小时后避光贮存。制成的薄层以不变成灰色为好，可保存三天内应用。也可先把硝酸银用少量水溶解，再用甲醇稀释成10%溶液。把预先制好的硅胶G薄层浸入此溶液中约1分钟，取出避光阴干按上法活化、贮存。（二）点样 将样品溶液滴到已制备好的薄层上，点的直径不大于2-3mm，样品滴加在距离薄层一端1-1.5cm的起始线上，点与点之间距离0.5-1cm，展开剂用量以浸没薄层起始线这边约为0.5cm的高度的量。 一般定性时可用普通毛细管，定量可用微量注射器（1、10、50l）。 样品溶液应尽量选用易挥发的有机溶剂，以便点样后溶剂迅速挥发，以减少空气中水分对吸附剂活度的影响。如果样品为水溶液或不易挥发的溶剂，此时可用电吹风或红外灯加热，要注意遇热不要破坏化合物。 点样量一般为几到几十微克。斑点要集中，所以点样时应点在原点上，直径要小。（三）展开剂选择的方法 前面已提到选择展开剂的原则。在实际工作中大都还要经过实验而确定合适的展开剂。微量圆球技术（见柱层析）可对吸附薄层的展开剂进行初选。好的展开剂应要求是能把混合物的成分很好的分离。 展开剂的质量对于展开结果的影响较大。溶剂要用三级（CP）或二级（AR）纯规则的溶剂。或将工业级的溶剂精制后应用。 薄层的展开必须在一个密闭的层析缸中进行。层析缸内预先用展开剂蒸气饱和，饱和后才能进行展开。实际应用小层析缸时由于空间较小很快达到了饱和，同时展开时间短，对分离效果影响较小。边缘效应不明显。 常用溶剂性质表（附录3）、共沸混合溶剂表（附录5）。供选择展开剂时参考。 展开方式最常用的是上行法，它比下行法分离效果好，因展开剂移得较慢，除了单向展开外，由于单向展开第一次展开后几种成分分离得不太开，经过第二次转向展开后，就有可能分得更开些。对成分复杂和化学结构相近的混合物，常用这种双向展开法来分离。 展开时一般在室温进行。当被分离物质见光易分解，则应用黑布（纸）罩上避光展开。 展开完毕后，取出薄层板，用铅笔或小针划出展开剂的前沿位置，待展开剂挥散后进行斑点检出。羧甲基纤维素钠的溶液一般用0.5-1%浓度，宜预先配制后静置，取其上层澄清溶液应用，则所制备的薄层表面较为细腻平滑。 鉴定未知成分时是用已知的标准品对照，书本上常见的Rf值 都是多次实验的平均值，只有在基本相同的实验条件下进行层析，才能得到相近的Rf值。书本上的Rf值可以作为一系列化合物在薄层上的相应位置以及它们之间分离的难易程度的参考。（四）氧化铝、硅胶活度的测定1.氧化铝活度的测定：一般可用4-5种偶氮染料以薄层层析法进行测定。（1）染料试剂的配制 取偶氮苯（Azobenzene）60mg,对甲氧基偶氮苯（Pnethoxyazobenzene），苏丹黄（ Sutdan I Benene-azo-naphthol），苏丹红（ Sudan Tetrazo-benzol-naphthel），对氨基偶氮苯（P-Aminc-azcbenzene）各40mg，分别溶于100ml重蒸的四氯化碳中。（2） 实验方法 常用制备氧化铝薄层，以铅笔尖或毛细管尖在薄层板一端2-3cm处间隔1cm左右点上5个可以看清的小点，各吸取约0.02ml染料试剂分别点滴于原点上，以四氯化碳为展开剂，展开时薄层板与容器底部交角为10-40研究空间。展开后测出各斑点的Rf值，从表确定氧化铝活度（一般高活度氧化铝使用本法时，结果往往偏低）。 另取氧化铝薄层板一块，置于水蒸气饱和的容器2、3小时后取出，按下述方法测定活度，观察有无变化。表1 氧化铝活度与偶氮染料Rf值关系偶氮染料氧化铝活度纯Rf值级级级级偶氮苯0.590.740.850.95对甲氨基偶氮苯0.160.490.690.89苏丹黄0.010.250.570.78苏丹红0.000.100.530.50对氨基偶氮苯0.000.030.080.192.硅胶活度的测定一般选用三种染料，用薄层层析法进行测定。欧洲药典1969年记载用0.01%二甲基黄（Methyl-yellow,P-Dimethylaminoazobenzene）,苏丹红（Sudan），靛酚兰（Indophenolblue,1,4-Naphoquinone-4-Naphthoq-unione-4-dimethyl amine aniline）的苯溶液各10l，点滴于硅胶G或硅胶H薄层上，以苯为展开剂，展开10cm（约20分钟），三种染料应明显分离。靛酚兰斑点接近于起始线，二甲基黄斑点在薄层的当中，苏丹红斑点在靛酚兰斑点与二甲基黄斑点之间，则认为薄层板活性符合要求。3.毛细管测定氧化铝、硅胶活度的测定法取1.075mm的毛细管，将毛细管的一端封闭，另一端开口，另取一个滴帽在底部打个小洞，将毛细管开口端穿入滴帽内部，然后将滴帽内充满吸附剂，轻轻拍打滴帽，使毛细管很快充满吸附剂（或似装测熔点法加入吸附剂），滴一滴苯在毛细管开口端（目的防止吸附剂从毛细管中掉出来），将毛细管倒转，并切掉封尾端，湿端以0.5%适当染料的苯溶液中沾一下，直至一滴染料溶液被吸附，然后将毛细管放入含有几毫升的苯溶液中，展开计算Rf值，从表中查出活性级别。染料 对氨基偶氮苯（P-Aminc-azcbenzene）用于氧化铝 对二氨甲基偶氮苯（P-dimethyl-aminc-azcbenzene）用于硅酸。氧化铝含水量（%）Rf值级别硅胶含水量（%）Rf值级别03681000.120.240.460.54036912150.150.220.330.440.550.66国内青岛海洋化工厂出售层析用的硅胶在吸附剂名称之后加几个字标明的意思是：硅胶G（G是Gypsu石膏的缩写，表示加了石膏）、硅胶H（H表示不加石膏）、硅胶GF（GF表示加石膏和波长为254nm显绿色荧光的硅胶锌锰）、硅胶GF（GF表示加石膏和波长为365nm显黄色荧光的硫化锌）。氧化铝则类推。四、 薄层层析应用实例（一）定性点滴反应1.样品（1）氨基酸混合液 （2）薄荷油（3）苦参乙醇液 （4）芦丁甲醇溶液 甘草次酸乙醇液 大黄乙醇液2.检出试剂（1）三氯化铁 （2）氨性硝酸盐 （3）氢氧化钾（4）茚三酮 （5）碘化铋钾 （7）香草醛硫酸（应在薄层板或白磁板穴内进行）3.实验方法取硅胶CMC-Na薄层板1-2块或滤纸片一方条，用软铅笔按下图划线，将各样品滴加于相应的格子中，再将各试剂分别自空白起逐格滴加试剂，观察并记录反应变化。具腐蚀性试剂也可用带穴白磁板，有的检出在试管中进行实验。试剂样品（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（1）（2）（3）（4）（二）鉴别中草药中的化学成分1. 单向展层例一 （1）硅胶 CMC-Na薄层（载玻片板）（2）样品 薄荷油 薄荷脑的乙醇溶液（3）展开剂 石油醚 乙酸乙酯 石油醚乙酸乙酯（85：15）（4）显色剂 香草醛硫酸（压板法）点样展开后，稍干，反扣在一块同样大小并已涂布一层显色剂的玻璃板上，稍稍转一下，连玻璃片反转，使薄层面向上，观察颜色变化。由结果判断何种展开剂最适合分离薄荷油。例二 （1）硅胶 CMC-Na薄层（载玻片板）（2）样品龙胆提取物（3）展开剂 石油醚 氯仿 甲醇 氯仿丙酮（8：2）氯仿乙酸乙酯甲醇水（35：5：10：0.5）（4）显色 UV254下观察由展开结果判断选用何种展开剂最为合适。香草醛硫酸为1g香草醛溶于100ml浓硫酸，或0.5g香草醛溶于100ml硫酸乙醇（4：1）中，喷洒时须加热至120观察颜色变化。2. 双向展层 （1）硅胶CMC-Na薄层板（88cm），不活化，在薄层板距两边各1.5cm交点的地方点样品。（2）样品 混合氨基酸（精氨酸、脯氨酸、亮氨酸的1%水溶液）。（3）展开剂 第向为正丁醇醋酸水（4：1：1）（V/V） 第向为苯酚水（75：25） （W/W）第向展开剂展层后，加热风使溶剂挥发，再将样品已展层的一向作起始线，在第向溶剂系统中展层。（4）显色剂 0.2%茚三酮乙醇液，喷洒后，以电吹风加热（60-100）显色，观察各斑点的颜色变化。最后喷洒2%硫酸镍水溶液显色。3.硝酸银硅胶薄层（1）硝酸银硅胶糊的制备：用20g硅胶G和55ml水中含5g硝酸银（8%）的溶液调制成，按常法铺成板（47cm、约30块）。避光阴干后，于105活化半小时避光贮存备用。（2）样品 转化后的细辛醚粗品（3）展开剂 环己烷醋酸乙酯（1：1或7：3）（4）显色点 将薄层板展层后置红外灯下加热使其出现黑色斑点检出。（三）原位反应薄层本法使直接在薄层上进行有机反应。先将样品滴加在薄层板上，然后再滴上试剂进行反应，再用适当的溶剂展开反应物。有时先在试管内进行反应。而后在薄层板上进行层析检识。根据原来化合物的Rf值、再联系反应产物的层析行为、Rf值，可供鉴别一个化合物或者提供鉴定一个化合物极有价值的线索。应用这些特殊反应只消耗未知物极微量的样品却提供了大量的有关结构鉴别的情报，操作简单。如氧化、还原、脱水、水解、卤代、酶的催化作用、酯化、硝化、衍生物的制备、混合反应等均可在薄层板上进行。1.酯化反应（1）取原儿茶酸乙醇溶液，在薄层上点加两个相同样点，其中一份点在原点上，再点加试剂：醋酐吡啶（3：1），待溶剂挥散，再重复点加试剂几次，干后，以氯仿丙酮（8：2）展层，（用碘蒸气熏显色，可见其中点加醋酐吡啶试剂的样点已展开在前，而未加试剂的样点仍近起始线）。（2）取原儿茶酸乙醇溶液，在同一薄层上点加两个相同样点，其中一份样点在原点上，再点加醋酐吡啶（3：1），待试剂挥发后，再重复点加试剂数次，用氯仿丙酮（8：2）展层。用2，4二硝基苯肼显色。2.成盐反应取原儿茶酸乙醇溶液，在同一薄层板上的起始线上点加两个相同样点，其中一份样点在原点上，再点加10%碳酸氢钠溶液（另一份不加），以氯仿丙酮甲醇（8：2：1）展层，并用三氯化铁乙醇溶液喷雾显色，可见其中点加碳酸氢钠的样点的Rf值已有明显变化，未加碱的样点照常展开。3. 苯腙反应取原儿茶酸乙醇溶液，在同一薄层上点加两个相同样点，其中一份样点在原点上，再点加2，4二硝基苯肼试剂，给以热风以促进成腙反应，然后以氯仿丙酮（8：2）展层，可见出现两个棕红色斑点。在红棕色斑点下，再喷以三氯化铁试剂，又出现紫蓝色斑点。上面的红色斑点是原儿茶醛与2，4二硝基苯肼所形成的，下面的紫蓝色斑点是剩下的部分未成腙的原儿茶醛。 由原位反应的结果判断原来化合物的结构上有何基团特征？并绘出图谱。五、 纸层析原理、一般操作及运用纸层析是以滤纸为支持剂，样品点样后在固定相与流动相通过毛细现象向另一端展开。被分离物质在两相间分配系数不同而达到分离的层析方法。 展开剂选择与分配薄层层析类似。被分离物质在展开剂系统中Rf值在0.05-0.85之间，两个化合物之间Rf值之差最好大于0.05。单个化合物的Rf值最好在0.4-0.6之间。一般操作按展开剂展开剂展开方向可分为上行、下行、径向。上行法又分为单向、双向。点样用的毛细管应细些使点样斑点呈小圆形，直径在2-3mm。点样浓度、数量不宜过大，防止斑点拉长、Rf值偏低。可用标本缸展开，必须使缸内为展开剂饱和后再将滤纸放入（展开剂用量以浸没滤纸起始线一边约为1cm高度的量）展开。展开完毕，取出，溶剂前沿用铅笔划线作记号，滤纸阴干后斑点检测，除了不可用腐蚀性显色剂外其余同薄层层析。应用在中草药化学成分的定性点滴反应同薄层层析（腐蚀性酸不可在滤纸上检出） 苯胺邻苯二甲酸试液为苯胺0.93g和邻苯二甲酸1.66g溶于100ml正丁醇（用水饱和）中。鉴别中草药中化学成分5%NaOH5%NaCO3/5%NaOH PH9 PH8 PH5 1.5cm 2.0cm第一 混合单糖的PC（1） 层析滤纸按纤维长丝方向（纵向）切成适当大小的纸条，在一端2cm处用铅笔划一条线为起始线，在起始线上点样，点样斑点直径小于0.3cm，点之间间距1-1.5cm。（2）样品：2.5%葡萄糖，鼠李糖混合水溶液。（3）展开剂：正丁醇醋酸水（4：1：1或4：1：5上层）。（4）显色剂：邻苯二甲酸苯胺试剂，喷雾后于105，加热10分钟。第二 多缓冲液和碱液纸层析（1）缓冲滤纸的制备：取新华滤纸（312cm）一张，距下端2cm处划一起始线，向上每隔1.5cm划一平行线按右图在各条带上涂布PH缓冲液和碱液，然后将其夹在两片滤纸中吸至半干使湿润指数为1.5（指湿滤纸为干滤纸重的1.5倍）备用。（2）样品：大黄素，大黄素甲醚，芦荟大黄素，大黄酸的氯仿溶液（3）展开剂：氯仿（4）显色剂：荧光检出；氨熏（5）结果：记录图谱，并说明这些化合物酸度的强弱。涂缓冲溶液时，PH顺序相反会怎样？附PH缓冲溶液的配制：PH3：取0.2M磷酸氢二钠溶液4.1ml加0.1M柠檬酸15.89ml配成。PH5：取0.2M磷酸氢二钠溶液10.30 ml加0.1M柠檬酸9.70ml配成。PH8：取0.2M磷酸氢二钠溶液19.45 ml加0.1M柠檬酸0.55ml配成。PH9.9：取0.1M碳酸钠溶液5ml加0.1M碳酸氢钠5ml配成。0.2M磷酸氢二钠溶液含35.61g/L0.1M柠檬酸溶液含21.01 g/L0.1M碳酸钠溶液含28.62 g/L0.1M碳酸氢钠溶液含8.40 g/L六、参考文献1、上海药物研究所 中草药有效成分的提取和分离 上海人民出版社2、中国医科学院药物研究所 薄层层离及其在中草药分析中的应用科学出版社3、北京医学院等 中草药成分分析 人民卫生出版社实验二 洋金花生物碱的提取分离洋金花又称山茄花、曼佗罗花、马兰花等。洋金花为茄科曼佗罗属植物白曼佗罗（Datura metel L）及毛曼佗罗（Dinnoxia Miu）的花。所含成分主要有东莨菪碱、莨菪碱等。 本草纲目中记载：诸风及寒湿脚气，煎汤洗之。又主惊厥及脱肛，并入麻药。现代民间用于止咳平喘、解痉止痛作用，还用于外科手术麻醉剂。一、 实验的目的要求1. 掌握莨菪碱、东莨菪碱的提取分离方法。2. 掌握生物碱的一般理化性质及其结构与性质的关系。3. 掌握生物碱及其盐类溶解度规律及其应用。4. 掌握反流分布法（CCD）的原理及基本操作。5. 掌握纸层析及沉淀反应在生物碱检识中的应用。二、 洋金花中已知成分的理化性质1. 东莨菪碱（Scopolamine、 Hyosine）为黏稠的液体，其一分子水合物为针状结构，熔点59，溶于冷水（1：95），易溶于热水、乙醇、乙醚、氯仿或酮中，难溶于苯、石油醚中。碱性较弱，Pka=7.50。被碱水解时，生成异东莨菪醇和（一）莨菪酸。2. 莨菪碱（Hyoscyamine）为四角针晶，熔点108.5，-210（乙醇）难溶于碱水（1：281），能溶于苯（1：150）、醚（1：69），易溶于氯仿（1：1）及醇和稀酸中。莨菪碱在光、热和碱的作用下，易消旋化成阿托品。与酸水或碱水共热时，则极易水解，生成莨菪醇和（一）莨菪酸。三、 生物碱的提取分离1. 原理利用脂溶性生物碱在酸性条件下成盐后，溶于水不溶于极性小的有机溶剂，在碱性条件下成游离生物碱，溶于极性小的有机溶剂，不溶于水，反复处理，籍以使脂溶性的莨菪碱和东莨菪碱与杂质分开。2. 工艺 洋金花（磋碎）10g 置100ml烧杯中，加水80ml，用浓盐酸调 PH为2左右，浸泡24小时，过滤。滤液留5-7ml（A）做生物碱沉淀反应 用浓氨水碱化至PH8-9，分别用氯仿20、 15、15ml振摇提取三次。 氯仿液 水液留取15ml（B）供层析用 其余氯仿液 回收氯仿总碱（C）注：1 PH8-9足可以使莨菪碱和东莨菪碱游离，切不可使PH值过高，以尽量减少生物碱的水解速度。此步操作最好是先将溶液和氯仿加入分液漏斗中，然后再碱化，振摇，以减少生物碱在碱水中的停留时间。2 振摇时注意防止乳化，不宜做猛烈振摇，以适度旋转式萃取为以宜，一旦乳化，可用加热或用玻璃棒摩擦容器内壁，以破坏乳化层，3 所得总碱（C）用5ml氯仿（预先已用PH6.5缓冲液饱和）分次冲洗转移到小锥形瓶中，供分离用。3.莨菪碱和东莨菪碱的分离（1）分离条件的考察取一条155cm层析滤纸，用铅笔划出起 始线（距底端2cm）、垂直于起始线再划三条纵线，将滤纸分四等分（如图2-1）。用棉球蘸取不同的PH缓冲液，依次（按PH5、6.5、7.5、9）的顺序，涂布于滤纸条带上，涂布操作要求均匀、快速、尽量减少缓冲液向邻近区间扩散。涂毕，将湿滤纸夹于两张干滤纸之间，吸取多余的水分。然后用毛细管取总碱溶液图2-1（B），点于各条的原点处以水饱和过的氯仿展开5-10cm，取出，以改良碘化铋钾试剂喷雾显色。记录各种PH条件下的Rf值，并据此选择分离这两种生物碱的适宜PH值。（2）CCD法操作方法 取三支小分液漏斗，分别编号，每只内盛PH6.5的缓冲溶液或PH6.5的水（它们要和流动相相互饱和）5ml，然后将总碱（C）的氯仿溶液5ml转入第一个分液漏斗中，振摇，分层，然后将氯仿层再转移到第二部分分液漏斗中，此时，第一个分液漏斗加入新的流动相氯仿（用缓冲溶液饱和过的）。二个漏斗分别振摇，分层转移。分别将第一、二漏斗中的流动相转移到第二、三个漏斗中，那么第一个漏斗中再加新的流动相氯仿5ml，再振摇，如此完成了CDD基本操作。以后的操作继续同上转移，但在第一个漏斗中不再加入新的流动相。从第三个分液漏斗转移出的流动相放入收集瓶中，如此进行三次，即可得到三个氯仿相及三个水相。 流动相（氯仿）（分液漏斗）固定相（PH6.5缓冲液） 收集瓶图2-2四.生物碱的检识1. 生物碱的沉淀反应取洋金花酸水液（A）每份1ml，置于试管中，分别滴加下列各试剂2-4滴，观察并记录有无沉淀产生及颜色变化。（1）碘化铋钾试剂（2）硅钨酸试剂（3）苦味酸试剂（样品液需调至中性）（4）鞣酸试剂2.薄层层析硅胶吸附剂硅胶G薄板展开剂氯仿：甲醇（8：2）样品：3个水相，3个氯仿相，总生物碱（B）对照品：东莨菪碱氯仿液 莨菪碱氯仿液显色剂：改良碘化铋钾记录：薄层层析图谱，并根据实验结果说明：总碱中含有何种生物碱，哪种含量高些？CCD法中东莨菪碱和莨菪碱各集中于哪些符号中？该分离结果与其纸层析值的大小有何相关性？五.预习要求及思考题：1. 预习要求充分预习实验提纲，领会各项实验内容的操作方法及其原理，并能初步判断其可能出现的结果。结合教材有关内容：（1）生物碱及其盐类溶解度的规律及其在提取分离工作中的应用，（2）CCD法的原理及操作，它与PPC的关系。2. 思考题（1）莨菪碱与东莨菪碱的碱性何者较强？试在理论上进行解释，并提出实验根据。（2）CCD法的基本原理是什么？怎样加入样品？怎样转移？怎样鉴定分离结果？怎样选择适当的CCD条件（包括固定相和流动相）？（3）本实验中用水提总碱时，为什么调PH2-3？用氯仿提总碱时为什么调PH8-9，分离总碱时为什么又调PH6.5？（4）生物碱沉淀反应时，应注意哪些事项？在下结论时应注意哪些问题？六、记录及实验报告1. 记录总碱的提取工艺（流程式），总碱的沉淀反应现象及总碱的层析结果。2. 记录分离条件考察结果（绘层析图），说明分离莨菪碱和东莨菪碱的最佳条件为何？3. 记录分离结果4. 记录在实验操作中出现的异常现象。实验三 大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum Palmatclml,唐古特大黄R.tangutium Maxim.etRegll及药用大黄R.officinale Baill的干燥根及根茎。 大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物及它们与糖结合成的甙。其中主要有大黄酸（Rhein）、大黄素（Emodin），芦荟大黄素（Aloe-emodin）、大黄素甲醚（Physcion）、大黄酚（Chry so-phanal）。大黄记载于神农本草经等许多文献中，用于泻下、健胃、清热、解毒等。一、实验目的要求1. 学习缓冲纸层析的基本操作技术，并能根据纸层析结果，设计液液萃取法分离混合物的实验方案。2. 掌握PH梯度萃取法的原理及操作技术。3. 学习蒽醌类化合物的鉴定方法。二、大黄中已知主要成分的理化性质 名称晶形熔点-H-COOH大黄酸（Rhein）黄色针晶318-320-CH-OH大黄素（Emodin）橙色针晶256-257-H芦荟大黄素（Aloe-emodin）橙色细针晶216-220-CH大黄素甲醚（Physcion）砖红色针晶207-H大黄酚（Chry so-phanal）金色片状细晶196大黄中蒽醌甙元，其结构不同，因而酸性强弱不同。大黄酸联有，酸性最强；大黄素联有，酸性第二；芦荟大黄素联有，酸性第三；大黄素甲醚联有，大黄酚联有，该基团不为酸性基团，但因母核中具有1，8二酚羟基，也具有一定的酸性，酸性第四。蒽醌类化合物在植物体内主要以甙的形式存在，有单糖甙，也有二糖甙。其中主要有大黄酸葡萄糖甙，大黄素-1-O-D葡萄糖甙、芦荟大黄素-O-D葡萄糖甙、大黄酚双葡萄糖甙，大黄素甲醚葡萄糖甙。此外，新鲜大黄中还有属于双蒽醌的番泻甙A及番泻甙B等。本实验先用酸水将蒽醌甙充分水解成总蒽醌甙元，再用不同PH缓冲纸层析为先导，选用适宜的不同的PH缓冲液分步萃取，以分离不同酸度的蒽醌甙元。三、大黄中蒽醌类成分的提取分离1. 原理大黄中的蒽醌类成分大部分和糖结合，以蒽醌甙的形式存在于植物组织中，所以要用酸水水解使其生成甙元，蒽醌甙元可溶于苯，故用苯提取。2. 工艺（1）大黄中总蒽醌甙元的提取 大黄粗粉（100g）加20%30ml，苯40ml，水浴回流2小时，用棉花过滤残渣苯提取液（2）总蒽醌甙元分离方法的设计大黄总蒽醌甙元的纸层析为了了解总蒽醌甙元所含成分，进行如下纸层析实验取新华滤纸，距离下端2cm处划一起始线，点加总提取液，用甲苯为展开剂上行展开，用0.5%醋酸镁甲醇液喷雾，并在100下加热5分钟显色，结果如图1。从图1可以看出共有4个组分，经与标准品对照得知，Rf=0.96是大黄酚和大黄素甲醚的混合物；Rf=0.78是芦荟大黄素；Rf=0.58是大黄素；Rf=0.18是大黄酸。蒽醌类成分的缓冲纸层析实验为了分离以上四种化合物，进行缓冲纸层析实验，以确定最佳分离条件。缓冲滤纸制备：取新华滤纸，2214cm离下端2cm处划一起始线，再每隔1cm划纵向平行线称重，在每一条带处顺次涂布不同PH的缓冲液和碱液，涂完后，将湿滤纸夹在两张滤纸中间，然后取出称重，使其湿润指数为1.5（即湿重为干重1.5倍）。在每一条带原点处，点总蒽醌甙元提取液，用水饱和过的氯仿为展开剂上行展开，当展开剂上升至5-7cm时，取出，烘干，其结果如图-2所示。在图-2中，可以看到有三条“S”形曲线，其中为大黄酸；为大黄素；为芦荟大黄素；余下的是大黄素甲醚和大黄酚的混合物。 缓冲滤纸各条分别依次用下述缓冲液或碱液处理：1PH3.20， 2PH1.68，3PH5.80， 4PH6.01， 5PH6.55， 6PH7.12， 7PH7.88（以上为柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液），8PH9.18（硼酸缓冲液），95%，10PH9.90，11PH10.50（10、11为缓冲液），120.5%，132.5%，145%，15、16、17分别为5%：5%（9：1，1：1，1：9），185%水溶液。 注：配好的缓冲溶液，用PH酸度计测定PH值。最佳萃取剂的确定根据图-2纸层析结果可以确定a.萃取大黄酸时以PH7.12缓冲液最为合适，因为在此条件下，总蒽醌中的大黄酸留在原点不动，而其它成分几乎被推至前沿，说明大黄酸对PH7.12缓冲液亲合力强，在萃取时易转溶于缓冲液中，其余成分对苯亲合力大，萃取时仍留在苯液中，从而得到分离。b.萃取大黄素时，以PH9.90缓冲液为宜，理由同上。c.萃取芦荟大黄素时，则以5%：5%（9：1）为宜。d.大黄酚和大黄素甲醚留在苯母液中，可被5%提出。各种萃取剂用量的计算确定a.分离组分（大黄酸），PH7.12缓冲液的用量计算如下：在PH7.12条带处，号组分（大黄酸）=0.02，以上（其余甙元）=0.90大黄酸的分配系数：=0.01其余的甙元分配系数：=4.5由此计算容积比：分离因子： =450R=1/0.21说明在分离大黄酸时，苯总提取液与萃取剂的容积比应为1：0.21，又由于值很大（450），因此可做一次简单萃取。b.分离组分（大黄素），PH=9.90缓冲液的用量计算如下：在PH9.90条带处，号组分（大黄素），号以上成分大黄素的分配系数：=0.02其余的甙元分配系数：=4.5由此计算容积比：分离因子： =225由此可知，用PH9.90缓冲液萃取大黄素时，用量应为苯萃取液的0.3倍，又由于值很大（225），因此可做一次简单萃取。c.分离组分（芦荟大黄素），碱液用量计算如下：在5%：5%（9：1）条带处：号组分（芦荟大黄素）=0.21号以上组分=0.96芦荟大黄素的分配系数：=0.131=12由此计算容积比：分离因子： =91.6由此可知，用5%：5%（9：1）的碱液萃取芦荟大黄素时，用量应为苯总提取液的1.25倍，又50，仍做简单萃取，（3）蒽醌类成分的分离和精制a) 工艺 苯总提取液（30ml）加PH=7.12缓冲液15ml，振摇萃取一次。缓冲液层（下层）苯层（上层）加盐酸酸化至 加PH=9.90缓冲液20ml， PH=3沉淀过滤振摇萃取一次滤液沉淀（）苯层缓冲液层干燥后用 用5%KOH15ml加盐酸酸化至2ml冰乙酸 萃取2次PH=3沉淀过滤结晶大黄酸苯液碱水层滤液沉淀（）（黄色针晶）用少量用盐酸酸化冰乙酸至PH=3沉淀结晶经磷酸氢钙层析过滤大黄素石油醚洗脱（橙色结晶）滤液沉淀（）先流出部分后流出部分干燥后，用乙酸（大黄酚）（大黄素甲醚）乙酯结晶芦荟大黄素（黄色针晶）注：由于温度对分配系数影响很大，所以最佳萃取剂的确定要以实验温度下纸层析结果为准，选择和计算。一般萃取大黄酸时在PH7-8范围，萃取大黄素则在PH9.5-11范围内均可。2、操作方法a、大黄酸的分离与精制将含有总游离蒽醌的苯提取液移置200ml的分液漏斗中，加7.12缓冲液15ml，充分振摇，静置至彻底分层，放出苯液后，倒出缓冲液置烧瓶中，加HCL酸化至PH3，黄色沉淀析出完全后，过滤、沉淀、干燥，干燥后的样品加少量醋酸加热使其溶解，趁热过滤，滤液静置，析出黄色针晶为大黄酸，过滤得到纯品，可供鉴定。b.大黄素的分离与精制将提过大黄酸的苯液继续移置分液漏斗中，用PH9.9缓冲液21ml振摇萃取，彻底分层后，分出缓冲液层，用HCL酸化至PH3,析出棕黄色沉淀，过滤，沉淀经干燥后，用少量冰醋酸加热使其溶解，趁热过滤，滤液静置，析出橙色大针晶，过滤后，即得到大黄素纯品，可供鉴定用。大黄素的结晶溶剂最好是吡啶，但因吡啶臭味难闻，故用冰醋酸。C、芦荟大黄素的分离与精制余下苯液移置分液漏斗后，用5%Na2CO3:5%NaOH(9:1)碱水液88ml分两次萃取或用0.5%KOH88ml分两次振摇萃取，分出碱水液加HCL酸化，析出的沉淀过滤干燥，用少量的乙酸乙酮结晶，得到黄色针晶的芦荟大黄素纯品，可供鉴定用。D、大黄酚和大黄素甲醚的分离磷酸氢钙柱层析（1）装柱：取115活化10小时的磷酸氢钙5g放入100ml烧瓶中，加入一定体积的石油醚，搅拌均匀，取一洁净的层析柱，底部放入一小块脱脂纱布，松紧适宜，稍稍打开底部的螺旋夹，将伴有溶剂的CaHP4，缓缓加入层析柱中，一面沉降，一面添加，直到加完为止，注意，加入速度不宜太快，以免带入气泡，破坏柱床。加完吸附剂后，有底部放出多余的溶剂，当液面比吸附剂平面稍高时，关紧螺旋夹，待样品上柱。（2）样品上柱：将萃取后余下的氯仿液，回收至2-3ml，左右，过滤，滤液加适量的CaHP4拌匀，并于红外灯下挥散溶剂，然后加入层析柱的顶端，滴加石油醚，是样品均匀湿润，然后加少量CaHP4至柱顶，再加一小片滤纸至顶部，以防加入吸脱剂是将样品冲起。（3）洗脱：由柱顶加入石油醚洗脱，先洗出的浅黄色流份为大黄酚，后流出的黄色流份为大黄素甲醚，分段手机，交叉段弃去。将收集的两组溶剂回收至小体积时，可分别析出大黄酚，和大黄素甲醚，用乙酸乙酯结晶得到大黄酚的片状结晶，供鉴定用。大黄素甲醚如混有大黄酚时，可多次重结晶，即可得到大黄素甲醚纯品。说明 1.进行洗脱操作时，应注意控制洗脱液的流速，如流速太快，难以建立平衡，太慢则谱带容易扩散，都影响分离效果。2.应选用层析规格。四、蒽醌类成分的鉴定本实验练习用PC的熔点及IR鉴定蒽醌类成分。1.纸层析鉴定取样品的氯仿溶液，用新华滤纸上行展开，用0.5%的甲醇溶液喷雾，并在100下加热5分钟。展开剂：石油醚（60-70），以97%甲醇饱和。：石油醚，以水