柑橘的组织培养.doc

柑橘的组织培养柑橘的组织培养是柑橘生物技术研究的重要组成部分。上个世纪70 年代以来,柑橘组织培养技术在器官的发生、发育以及生理机制等基础性问题到应用性课题如种苗快速繁殖、无病毒苗木获得、种质资源离体保存等方面的研究都取得了一定的成绩，尤其在品种改良、新品种育成以及遗传转化等相关领域都取得了不少成果，组织培养实际上是应用现代生物技术进行柑橘育种的最基本也是最重要的的平台，虽然在成果转化和应用方面还有需要解决的问题，但是以生物技术提升柑橘科研水平，进而转化应用，依此加速柑橘产业的全面升级的目标应该是明确的。1 成年态柑橘茎尖诱导和微芽嫁接 成年态柑橘茎尖诱导指从柑橘成年树上获取茎段芽的茎尖作组培外植体，诱导成苗的技术途径。目的是：是用再生苗的茎尖微芽嫁接达到柑橘脱毒或用于种质资源离体保存等。尤其在遗传转化的研发中，一般用无菌播种的实生苗节间及上胚轴切段作为外植体,虽有再生率高,其耐受性好,操作比较简单,是较理想的转化受体的优点,但是这类外植体用于再生体系及转化往往处于幼龄阶段,转基因植株需经过一个相当长的童期才能开花结果,这使得对转基因植株性状的评价和利用周期太长，而以成年态茎段为外植体离体培养再生苗可以克服童期长的问题。（1） 外植体消毒方法间二消毒法成年态柑橘茎段或其它器官、组织作组培培养物，初代培养材料取自自然生长的植株,都带有各种各样的微生物,若消毒不成功就导会致失败，只有对这些材料进行成功的消毒,才能进行进一步的培养研究. 材料消毒措施的力度越大,灭菌效果越好,但是消毒剂对植物材料又具有毒害作用,特别是常用的升汞,不但有残毒,而且对环境的污染也比较严重.有研究报道，0. 5 cm长的柑橘纵切茎段外植体污染率较低，用70 %的酒精处理30 s, 10 %的次氯酸钠溶液处理30min,放置48 h后,再用10 %的次氯酸钠溶液处理30min,成功率最高。高温干燥季节取材,污染率较低。这种消毒方法的优点在于:用次氯酸钠作为消毒剂,处理以后残毒能够自然降解,避免了对环境的污染,因而优于用升汞处理；间隔2 d再进行第二次灭菌处理,残存的微生物孢子萌发后被杀死,不仅大大降低了污染率,同时也没有对材料造成大的损伤,因而成功率较高.称之为“间二消毒法”.（2） 成年态柑橘茎段再生体系 鱼橙等成年态茎段培养技术 材料与方法： 供试柑橘品种是GL橙、AW 橙、鱼橙和霜橙四个杂交种，树龄约15 年。春、秋季在柑橘树上选取长1020 cm 且长势一致的半木质化枝条，去掉叶片（保留叶柄基部）和刺，用0.1%洗衣粉溶液清洗干净，再用自来水冲洗10 min，备用。在超净工作台上将枝条切成含腋芽约1 cm 的茎段外植体，并用0.1%升汞溶液消毒表面2 次，2次消毒间隔时间为1 d。茎段消毒后进行纵切或横切，将含腋芽的部分作外植体进行培养。 培养基： 腋芽诱导培养基。基本培养基为MT7.0 g/L 琼脂30 g/L 蔗糖，pH 5.70.1 GL橙为MT+ BAP（6-苯甲基腺嘌呤）1.0 mg/L+IBA（吲哚-3-丁酸）0.1 mg/L；AW橙和霜橙为MT+BAP1.0 mg/L+IBA0.2 mg/L；鱼橙为MT+BAP0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L。 结果观察： 诱导启动、继代培养。 将柑橘成年态茎段接种在以MT 为基本培养基， 培养温度261，相对湿度60%，光照强度2 000lx、光照14 h/d。诱导培养4 周后，将整个茎段外植体转接于新的培养基增殖扩繁培养（培养条件与诱导培养相同），每隔45 周继代1 次，并在继代培养过程中逐步除去老茎段组织。结果表明：GL 橙成年态茎段在BAP 1.0mg/L+IBA0.1 mg/L 培养基中的诱导效果最好， 腋芽萌发率达82%以上，且诱导的腋芽数多、长势强；在BAP0.5 mg/L+IBA0.2 mg/L 培养基中，鱼橙成年态茎段的腋芽诱导效果最好；而BAP1.0 mg/L+IBA0.2 mg/L培养基最适合于霜橙和AW 橙成年态茎段腋芽的诱导和生长。增殖扩繁。为了减少诱导腋芽的愈伤化，在继代培养过程中逐步除去老茎段组织。调查结果显示， 将GL 橙、AW 橙和霜橙3 个柑橘品种的成年态茎段接种在8 个不同植物生长调节剂配比的继代培养基中均不能增殖，腋芽愈伤化严重，导致大量腋芽从基部脱落，随后植株逐渐死亡。调查结果还显示， 将鱼橙成年态茎段接种，当BAP 浓度高于0.2 mg/L时腋芽的增殖系数较大（510 倍），但愈伤化程度严重；当BAP 浓度较低于0.1 mg/L时，腋芽增殖系数仅为13 倍，但腋芽生长势强；而IBA 添加浓度无论是0.1 mg/L 还是0.2 mg/L，对鱼橙成年态茎段接种后的腋芽分化影响均不大。说明鱼橙离体植株的增殖对BAP 浓度较敏感，但对IBA 浓度不敏感，在MT+BAP0.1 mg/L+IBA0.1 mg/L 培养基中的增殖效率最高。生根培养。 未筛选出适合的培养基。但在生产上通常可采用微芽或试管嫁接等方法获得生根的柑橘离体小植株。正毛化州橘红成年态茎段培养 化州橘红是芸香科植物化州柚的未成熟或近成熟的干燥果及外层果皮，是广东的中药材。化州橘红的品种按照柚果外观的不同分为正毛、副毛、青光3 类， 其中以正毛化州橘红的柚果价值最高材料与方法： 材料为2 年生正毛化州橘红的成年态半木质化新梢茎段。在晴天下午15：00 采集化州橘红成年态半木质化新梢，将叶片去除，切成约5 cm 长的茎段。将茎段先用75%酒精浸湿的棉球仔细擦拭，再用自来水轻轻冲洗2 h，然后再将其切成约2 cm 长的带芽茎段，用2.5%次氯酸钠20min（活性氯浓度7.5%，稀释到1/3 浓度使用）+0.2%升汞8min（加入23 滴吐温-20）进行灭菌处理，然后将外植体接种到诱导培养基上，10 d 后统计外植体的污染率、死亡率和萌芽率。 培养基： 诱导培养基。MT+BA1.0 mg/L+NAA0.4 mg/L3%蔗糖5.0 g/L 琼脂5%CW（椰子水），pH 5.8。 增殖培养基。MT+BA0.25 mg/L+NAA1.0 mg/L+GA3 0.3 mg/L蔗糖5% 结果观察： 灭菌效果。用2.5%次氯酸钠溶液浸泡20 min、无菌水冲洗4 次后，再将材料放入0.2%升汞溶液中轻轻摇晃后浸泡8 min， 再用无菌水冲洗4 次，可将污染率控制在15%以下、死亡率小于5%、萌芽率达60%以上，其他未污染材料在培养基上40 d 后仍然保持绿色，但没有腋芽萌发，这可能是灭菌时芽点受到了损伤。 诱导培养。将经消毒处理的化州橘红节间茎段削取稍带木质部的腋芽部分， 分别接种到诱导培养基中，培养温度27，光照强度1 8002 000lx、光照12 h/d，光暗交替培养2 周，接种57 d 后开始逐渐有腋芽萌发，每个外植体可长出34 个芽，而且后续生长良好。腋芽萌发后， 待最高的腋芽长至23 cm 高时要及时进行分芽并移植至增殖培养基上， 否则壮芽会抑制其他芽的进一步生长。 增殖培养。当幼苗长至4 cm 时，叶片已经完全展开，此时要更换新的培养基进行增殖培养，在添加BA0.25 mg/L+NAA1.0 mg/L+GA30.3 mg/L 时， 幼苗生长良好，得到了较多茁壮且分枝多的增殖苗。在40d 内壮芽茎段可生长34 cm，而丛生芽中分离出的小芽生长较慢，但是继续更换新的培养基后可逐渐长大成苗。增加蔗糖浓度对化州橘红的增殖培养是非常重要，蔗糖浓度5%，增殖培养60 d 以上不更换培养基，幼苗仍然不出现落叶现象，生长正常。 生根培养。未筛选出适合的培养基。其茎尖可用于微芽嫁接脱毒。几例柑橘品种的成年态茎段培养 朋娜脐橙、纽荷尔脐橙、冰糖橙、隆园早温州蜜柑成年树。 以半木质化茎段的节间、节段为材料，茎段经70 %酒精消毒30 s ,0. 1 %升汞消毒8 min ,再用无菌水冲洗34 次,接种于分化培养基上。先暗培养7 d ,然后每天置于26 ,光照2 000 lux 16 h 下培养，基本培养基:改良的MS 培养基，即MS 无机盐+ 100 mg/ L 肌醇+ 0. 2 mg/ L VB1 + 1 mg/L VB6 + 1 mg/ L 烟酸+ 3 mg/ L 6 - BA + 30 g 蔗糖。培养至3 周后，朋娜脐橙、纽荷尔脐橙和冰糖橙田间成年树节间接种在添加6-BA的培养基，能分化出不定芽,而隆园早温州蜜柑不能分化出不定芽。其中，一年生纽荷尔脐橙的半木质化节间和节段，取材相同时,以3 mg/ L 6 - BA 的分化率比1 mg/ L 6 - BA 和5 mg/ L 6 - BA 的高。当6 - BA浓度相同时,节段比节间要高,最高的为节段在3mg/ L 6 - BA 的分化率,为40. 0 %。 雪柑、晚熟芦柑成年态茎尖培养。 取0.5-0.8cm顶芽经常规消毒后取1mm左右茎尖为材料，基本培养基为MS，蔗糖3-5 %，琼脂0.5-0.7 %，pH5.6-6.2。培养条件，温度25-28，光照10-02h/d，强度1200lx。结果：分化诱导，雪柑以附加6-BA1.0、NAA0.2-0.3、GA30.2-0.4mg/L最好，分化率为73-84%，生长正常叶色绿，生理状态以春、夏梢开始萌芽时最好。增殖培养以附加6-BA1.0、KT0.5、GA30.2、VH0.2（生物素、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族），30d后增殖7.8倍。晚熟芦柑在相同条件下增殖4.5倍。壮芽诱根，壮芽用MS附加浓度很低的6-BA、NAA及VH ，10d达到壮苗效果，将苗用IBA（吲哚-3-丁酸）或ABT（生根粉）100mg/L浸基部数小时再转至1/2MS培养可以生根。 枳和枳橙的茎尖培养与增殖。 用枳(实生树)和枳橙(嫁接树)的茎尖接在MS+Kt2.0mg/L+NAA0.1mg/L+蛋白胨300 mg/L+GA30.2mg/L培养基上具有良好的分化效果,可诱导大量丛生芽,分化出根、茎、叶俱全的完整植株.Kt能克服顶端优势,促进腋芽萌发,对于茎尖繁殖的最适浓度为Kt2.0mg/L.适量的蛋白陈可促进茎尖抽枝成苗.用100mg/LIBA（吲哚-3-丁酸）浸泡新梢基部46h,有利于试管内生根.200mg/L ABT（生根粉）和100mg/LIBA处理无根试管苗,成功地在试管外诱导生根,简化了试管苗繁殖的步骤.2 柑橘茎尖微芽嫁接脱毒（1）提高柑橘茎尖微芽嫁接成活率的嫁接法 材料与方法 接穗：蕉柑1号、化州橙，华化l号，红江橙，香水橙、新光无棱雪柑等9个优良主裁品种。 当春、夏梢长至0.5 3cm 时取茎尖常规灭菌，在解剖镜下取0.140.l8mm大小(含2 3个叶原基)茎尖作接穗 砧木：采集酸橙和甜橙果实贮藏，用时剥取新鲜种子，常规消毒，播种于MS固体培养基，置于2705 暗培养13 16d，黄化苗置于自然光下24小时后用作砧术 嫁接方法：在无菌条件下切去砧木端部，留茎长152cm,留根长4 6cm,距顶端2 5mm处 纵切一刀并与之垂直横切一刀，深达术质部形成“L” 型切口，在两刀交叉处轻压一下，使留一小空间，再用刀尖将垂直交叉处的韧皮部挑开成450角，然后将茎尖在05mg/L6-BAP中浸泡l0min后，立即取适宜大小的茎尖嵌入在切口交叉处，挑起的韧皮部自然复住茎尖，嫁接完成，称垂直压法（如图）5-65555温州蜜柑3.1.1个世纪年代以来, 组织培养技术在柑橘研究和应用上一直起着重要作用。从器官的发生、发育以及生用刀尖在垂直交叉处挑成450角 茎尖嵌入在切口交叉处础性问题到生产育种的实图 垂直压法图示际工作都得究和发展。柑橘组织培养研究主要图示图图 图药培养、胚培养、胚乳培养、茎段培养、原生质体培养药培养 结果 用“垂直压法”，茎尖放置在交叉处既不易脱落，又保持一定湿度，茎尖不易干枯，伤口小，萌蘖少，撇作方便。垂直压法嫁接后6 10天接芽迅速生长，成活牢均在60 80。茎尖嫁接一般操作速度为25 30株h，如果茎尖一次消毒待用，容易产生褐变，应分次消毒，每次消毒10芽，再进行05mg/L 6-BAP预处理茎尖l0分钟，置含MS营养液的滤纸上，培养皿上加盖，防止茎尖氧化褐变。 嫁接苗成活并生长后可以驯化移栽。试管苗移栽之前耍转试管并除萌转管培养基要添加一定浓度的GA3，使苗迅速生长，大苗更易移栽成恬，移栽前将试管苗放在自然光下锻炼一周，清洁根部，然后移入“二合一”（砖土:砂1:1，高压灭菌后使用） 培养土塑料盆中，每周浇一次的Hoagland营养液和01 尿索，罩上烧杯，二周后使烧杯斜罩在盆内，既可以防止病虫害的侵人和风雨冲刷，又能改善通气条件冬季要移人温室或双层塑料棚，春季移入网室 换土，注意防治红蜘蛛为害和适当补充肥料，这样苗术可获得较高的成活率。15个月苗可达3050cm高，无异常症状表现，经检测无病毒。（2）柑橘微芽二次嫁接脱毒法 据报道，柑橘己鉴定出15种病毒、类病毒和类菌原体病害，巳确认危害严重的有柑橘裂皮病、柑橘黄龙病、柑橘碎叶病和柑橘衰退病，主要的脱毒途径就是微芽嫁接脱毒或热处理和微芽嫁接结合脱毒 材料与方法 供试品种。接穗：锦橙、夏橙、脐橙、温州蜜柑、酸桔自果园取1-3cm嫩梢，去叶，留1cm芽尖，用0.25次氯酸钠消毒5min，无菌水冲洗4-5次备用。砧木：枳。种子去种皮，用0.5次氯酸钠消毒10min，播于MS培养基，pH5.7，27暗培养13-15d。微芽嫁接：取接穗芽的0.14-0.18mm茎尖微芽用“垂直压法”嫁接，将嫁接苗直接植入培养钵内，培养基质为腐熟锯木屑:河沙:果园壤土=1:1:1（V），用不含糖的MS培养液浇湿，薄膜保湿，温度28，光照1000-1500lx，3-4d喷浇MS培养液1次，经7-10嫁接苗萌芽，自然光培养60d苗长出2-4片叶，高1-1.5cm。二次嫁接，即用茎尖微芽嫁接所获苗，连同砧木一起，腹接于大的砧木上，薄膜保湿，20d后可去膜移入温室培养。 结果。采用二次嫁接法，成功率相当高，除脐橙较低外，其它品种第一次嫁接可达到50以上，第二次嫁接可达到80以上，为柑橘微芽嫁接脱毒开创了新途径。（3）成龄态柑橘茎尖诱导和微芽嫁接脱毒 材料与方法 砧木。冰糖橙，将种子自来水冲洗后用1mol/L的NaOH浸泡3-5min，无菌水冲洗4-5次，2%次氯酸钠振荡消毒5-7min，无菌水冲洗4-5次，去外种皮，接种于MT培养基，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，pH5.8-6.0，25暗培养14-15d，嫁接前转自然光1-2d作砧木。 接穗。晴天午后取具典型黄龙病症状的纽荷尔脐橙新梢茎段为材料，自来水冲半小时，洗洁剂清洗3-5min，70%酒精30s加入吐温-80几滴，新梢茎段分别来自1年生秋梢茎段、当年生木质化茎段、当年生未木质化茎段、当年生半木质化茎段，用0.2%升汞振荡消毒10-30min，无菌水冲洗4次。将材料切成0.5cm的茎段，除腋芽接种于培养基中，25暗培养3周转光照培养。微芽嫁接。用来自组培诱导的茎尖进行微芽嫁接。移栽基质。细沙:泥炭:蛏石为1:1:1，灭菌后使用黄龙病检测。PCR法 结果污染率：半木质化茎段污染率低最宜作外植体。最适茎段诱导培养基：MT+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+GA3mg/L，平均增3倍。微芽嫁接成活率：来自组培诱导的茎尖进行微芽嫁接成活率80%以上。移栽：当试管嫁接苗具3-4片真叶时可移栽至基质，移栽前驯化移栽后加罩保温保湿加强管理成活率达90%以上。脱毒：PCR检测未检出黄龙病。3 柑橘种质离体保存柑桔种质的离体保存（作物种质资源是作物育种的物质基础，农业生产在很大程度上依赖于对种质资源的占有和利用程度,随着现代果品业的发展,种质资源的重要性越来越被重视。传统的果树种质资源保存方法是原境保存或将搜集或引入的品种进行集中栽培,建立品种园或资源圃，这种方法存在的缺陷是显而易见的，首先,大量的种质栽培需占用大面积的土地,管理投入的人、财、物相当大。其次,容易发生自然变异和种质退化,从而影响种质的遗传品质。现代生物技术的发展可以改变这种状况，主要采有两种途径： 一是液氮中超低温( 一般指液氮低温, - 196 ) 长期保存植物，可以进行超低温保存的材料种类很多, 主要是： 茎尖和侧生分生组织、原生质体、悬浮培养物、愈伤组织和体细胞胚。其他植物器官如胚、子房、花粉、花药、种子等。在超低温条件下几乎所有的细胞代谢活动和生长过程都停止进行,而细胞活力和形态发生的潜能可保存。植物材料处于相对稳定的生物学状态,从而可以达到长期保存种质的目的 。溶液在降温时,如果缺乏均一晶核生长条件或生长所需的足够时间,就首先成为过冷的溶液,它是低于冰点而不结冰的液态。继续降温,均一晶核开始形成,此时的温度称为均一晶核形成温度,也称为过冷点。继续降温过程中如果降温速度不够快,则在保存的植物材料中形成尖锐的冰晶，若快速降温,植物材料中的均一晶核就很少或几乎没有形成,溶液就进入一种无定型的玻璃化状态。此状态下既没有溶液效应对细胞的损伤,也没有冰晶对细胞的损伤,因而植物材料的存活率大大提高。依此原理进行的保存方法称作玻璃化超低温保存。玻璃化法超低温保存作为一种植物种质保存技术中理想的方法,以其设备要求简单,处理步骤简便,效果和重演性好等优点。 另一条途径则是在植物微繁殖技术的基础上, 通过理化因素处理, 降低外植体或试管苗的生长速度, 使其达到最低量生长, 从而建立试管苗种质库, 达到中长期保存的目的. （1） 玻璃化法对柑橘茎尖的离体超低温保存 茎尖分生组织细胞分化程度小,在植物保存后的再生过程中比其它细胞培养物的遗传性相对稳定,所以茎尖分生组织是超低温保存的一种理想材料。选择在最适生长阶段的材料是很重要的。茎尖细胞的生长年龄与抗冻性的提高有密切关系,而且也是决定冻存后细胞存活率的重要因素之一，同时茎尖的生理状态对存活率有非常显著的影响，不同基因型植物材料的茎尖对超低温保存的反应各不相同,冻后存活率的显著差异不仅存在于种间,也存在于不同品系间。柑橘茎尖超低温保存的过程是：茎尖低温锻炼预培养加冰冻保护剂冻存解冻及洗涤活性检测和恢复培养冻存成活后遗传稳定性的检测。材料与方法 品种或类型：枳壳、439 瓯柑改良橙、 红肉脐橙和椪柑。 胚状体诱导培养：从成熟果实中取未受精胚珠, 经表面消毒后, 接种于胚状体诱导培养基MT +硫酸腺嘌呤（SAD）40 mg/ L + GA3 1 mg/ L +麦芽提取物（ME） 500 mg/ L 的培养基 上, 于26 暗培养箱中进行培养, 获得胚状体, 并再生成株。切取茎段, 每40 d 继代1 次。培养基为MT基本培养基附加BA 0. 5 mg/ L , NAA 0. 1 mg/ L , GA3 0. 3 mg/ L 和蔗糖30 g/ L (生芽培养基) ,培养温度26 , 光照12 h/ d , 光照强度2 000 lx 预培养：继代2030 d 的柑桔茎尖, 长度为10 mm 左右, 于5 %二甲基亚砜（DMSO) + 5 %蔗糖+MT 基本培养基上, 在上述培养条件下预培养, 然后再切取茎尖, 转移于1. 8 mL 冷冻管中, 每管10 个茎尖。室温下60 %玻璃化溶液2 (PVS2) (0. 15 mol/ L 蔗糖液体培养基与PVS2 溶液体积比为4060)溶液处理不同时间, 再用PVS2 (30 %甘油, 15 %乙二醇, 15 % DMSO ,0. 4 mol/L 的蔗糖) 于不同温度下处理。 冰冻冻存：移去原液, 装入新鲜的保护液, 将冷冻管装入自制的纱布袋中, 每袋23 管, 然后迅速将冷冻管投入液氮中。化冻、成活检测与再培养：保存24 h 后, 从液氮中取出冷冻管, 在40 下迅速化冻, 分别用无菌水、蔗糖1. 2 mol/ L +MT 基本培养基洗涤2 次, 每次10 min。氯化三苯基四氮唑法检测成活率(TTC即用2,3,5氯化三苯基四氮唑对根样品进行染色来辨别死根与活根的一种方法。TTC 染色的程度受温度、pH、溶液浓度和处理时间的影响。一般温度3035为宜,pH6.57.5最适。) , 或转入继代培养基进行培养, 以检测再生率。将培养成活的材料接种于生根培养基(1/ 2 MT + NAA 0. 5 mg/ L + 蔗糖25 g/ L) 进行生根培养, 生根以后移栽至温室。结果 未受精胚珠培养：未受精胚珠在胚状体诱导培养基上培养2 个月内均可获得再生胚状体, 除439发生率为25外, 其它3 个品种或类型胚状体发生率均超过50 %。 预培养结果：用5 % DMSO（二甲基亚砜） 进行预培养, 则可大幅度提高成活率，预培养3 d 后, 枳壳和红肉脐橙的超低温保存后成活率均达到100 % , 分别预培养4 d和6 d 后, 椪柑和439 亦有100 %的成活率（用TTC法检测），综合考虑, 预培养时间以36 d 为好, 最多不能超过1 周。 预处理时间：植物茎尖在用玻璃化溶液( PVS) 快速脱水之前, 有一个所谓装载(loading) 的过程，即用一个较高浓度的冷冻保护剂混合液于室温下预处理一定时间, 以进一步降低组织含水量, 避免由于渗透压变化剧烈对材料所造成的伤害。用60 %PVS2 进行装载,在30 min 的预处理中获得最大的成活率, TTC 检测成活率达到100 %; 低于20 min ,由于装载时间过短而未能完全达到缓冲的作用, 材料不易成活; 超过40 min , 则由于溶液对材料的毒害而使成活率又有所下降。一般来讲, 室温较高时20 min 较为适宜, 室温低时(冬季) 可适当延长为30 min。在0 用PVS2 处理（低温锻炼），枳壳和439 在50 和60 min 两个处理时间内都达到100 %的成活率, 而红肉脐橙和椪柑也在60 min的处理时间下达到最高的成活率。 处理时间少于50 min , 则材料脱水不够, 在降温过程中不能迅速达到玻璃化状态, 因而不易成活; 处理时间超过60 min , 材料由于受PVS 的毒害, 成活率反而又有所降低。不同材料对PVS 的忍受力不同, 其中枳壳较能忍受, 时间延长至80 min 仍有88. 67 %的成活率。 材料大小：材料大小对脱水的难易影响很大。材料体积大, 不利于脱水, 但容易再生; 体积小,易于脱水, 但不易再生, 而且冷冻保护剂对材料的毒害较大, 从而影响成活率。上述4 个品种或类型茎尖长度在22. 5 mm 范围内均得到较高的成活率, 平均达96. 25 %，因此, 在进行保存时, 一定要注意材料的大小。 再生及其形态发生：材料成活和再生率因品种不同差异很大。一般来说, 同一品种比较健壮的材料较易成活和再生。进行再生培养时, 如果保存后未用蔗糖1. 2 mol/ L 洗涤, 则材料全部死亡, 如用无菌水洗涤, 则再生率较用蔗糖洗涤的低。如果培养基中不加细胞分裂素,则再生率很低。保存后暗培养一段时间,有利于材料的恢复生长。对培养成活的植株形态发生进行观察,50 %是从茎尖萌发成株, 10 %侧芽再生, 40 %的顶芽和侧芽均萌发, 大部分材料除芽成活外, 其它部分在培养过程中褐化死亡, 这与在用TTC 检测时发现有的茎尖只是顶芽或侧芽的部位变红, 而其它部分仍保持绿色相一致。再生是通过器官发生途径, 未经过愈伤阶段, 因此发生变异的机率较小。按优化的方法, 即预培养3 d , 取2. 5 mm长的茎尖, 用60 % PVS2装载30 min , PVS2 处理60 min , 换上新鲜的PVS2 , 然后投入液氮中, 24 h 后化冻,用蔗糖1. 2 mol/ L 培养基洗涤, 进行再生培养, 实际培养再生率, 枳壳90 % , 红肉脐橙30 % , 椪柑 25 % , 439 为20 %。再生苗移入生根培养基后能正常生根, 尚未观察到形态变异的发生, 再生苗移栽于温室后能够成活。大多数柑桔品种的成熟果实中都有未受精胚珠存在, 通过培养这些未受精胚珠获得离体材料, 利于种质的采集和交流, 而且未受精的胚珠是通过体细胞胚胎发生途径再生植株, 能够保持原来品种的特性。通过未受精胚珠离体培养, 大多数柑桔品种能够通过胚状体途径获得再生材料, 且不携带病毒。所以, 用成熟果实未受精胚珠培养获得胚状体并再培养成株,进行柑桔离体保存时获得离体材料理想途径。（2）理化处理降低外植体生长速度 材料与方法 锦橙和红桔均为枳砧成年结果树. 选取生长较一致的半木质化春梢, 剪去叶片, 用洗洁精水洗净, 在超净工作台上用10 %NaOCl水溶液(加几滴吐温20) 消毒10 min , 以无菌的0.5 % KCl 水溶液漂洗3 次. 无菌滤纸吸干后, 切取长1 cm 左右带腋芽的节段和顶芽, 分别接种到培养基上分化和抽发. 基本培养基为MS , 蔗糖4 % , 琼脂019 % , 附加不同浓度的BA , KT 和IAA , pH5.8 , 灭菌, 培养温度均为(28 1) , 光照14 h/ d , 光强度2 000 lx.将由腋芽分化的丛芽和顶芽抽发的幼芽分别接种到MS + BA 2 mg/ L + IAA 0.1 mg/ L的培养基上继代培养1 月左右, 待生长正常后随机取丛芽和幼芽进行保存。在保存过程中, 定期调查培养材料的存活率. 1 年后, 将保存后存活的丛芽转移到MS +BA 2 mg/ L + IAA 0.1 mg/ L 新鲜培养基上, 常规条件下培养, 使其重新恢复生长; 再将丛芽嫁接到温室中的枳砧上, 待嫁接苗长至30 cm 高时, 取叶片采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法测其同工酶. 取茎尖采用Giemsa 法检查其染色体数目. 通过这两个指标考察试管离体保存的柑桔种质的遗传稳定性.结果 外植体的培养：将带腋芽的节段和顶芽分别接种到附加不同浓度的BA、KT 和IAA 的MS 培养基上使其分化和抽发. 30 d 左右, 供试两个品种节段腋芽的芽原基均开始萌动, 分化出数量不等的浅绿色芽状突起, 即“芽点”。 1 个半月后逐渐抽出真叶形成丛芽, 且有不同程度的伸长, 生长状况良好, 绿芽粗壮, 生长较快, 长约1.5 cm 左右.当培养基中IAA 浓度一定(0.1 mg/ L) 时, 附加BA 比附加相同浓度的KT 诱导丛芽效果好， BA(或KT) 的最适浓度为2 mg/ L. 另外, 少数节段的两端切口处有极少量淡黄色愈伤组织出现, 但是不影响丛芽生长. 顶芽的抽发与腋芽的分化情况相反, 红桔比锦橙生长好, 不但存活率高, 生长较快, 而且质量较好的幼芽所占比例较大。 两品种的顶芽均能在1 个半月后不同程度地抽发出新叶, 展叶较正常, 幼芽逐渐变粗增高, 成为健壮的无根苗, 但很难产生丛芽。带腋芽的节段和顶芽培养的最适培养基为MS + BA2 mg/L + IAA 0.1 mg/ L。红桔腋芽增殖率30%，锦橙腋芽增殖率50%，.红桔顶芽存活率66.7%，.锦橙顶芽存活率36.7%试管丛芽和幼芽离体保存： 试管封口材料：封口膜透气性适中, 培养基水分损耗少, 且能保证试管内外必要的气体交换, 有适量的CO2 进行光合作用, 因而保存材料的存活率较高. 封口膜对中长期保存是一种最理想的封口材料.锦橙在保存280d和365d后存活率分别是79.0和55.6，红桔在保存280d和365d后存活率分别是66.7和52.9。 保存期的影响因素： 锦橙。影响存活率的最主要因素是光强度, 培养基和甘露醇对存活率也有较大影响, 温度的影响较小，主次顺序是: 光强度 培养基 甘露醇 温度。培养基最佳组合为:MS + 2 %甘露醇, 在15 、500 lux 条件下培养. 红桔。影响存活率因素的主次顺序是:光强度 甘露醇，培养基的最佳组合为:MS +BA2 mg/ L + IAA0.1 mg/ L + 2 %甘露醇, 在15 , 500 lx 条件下培养.由顶芽抽发的幼芽在保存过程中, 随时间的推移, 大部分从叶片开始发黄, 而后逐渐黄化、枯死。保存材料的遗传稳定性： 保存1 年后并在新鲜培养基上重新恢复生长的丛芽生长良好, 其成活率高达95 %以上.对丛芽嫁接苗和母株树上的叶片进行过氧化物酶同工酶(POX) 比较分析, 结果表明, 供试两品种的POX 同工酶酶谱均未发生变化. 从茎尖染色体镜检观察也看出, 两品种的染色体数均无变化(仍为2n = 18) . 说明锦橙和红桔的丛芽离体保存1 年后, 其遗传性仍是稳定的。4 柑橘花药培养 自然界中单倍体出现的频率极低,只有0. 001% - 0. 01%。单倍体指的是具有配子体染色体组成的孢子体. 在花药离体培养的基础上，经处理单倍体幼苗，使染色体数目加倍，重新恢复为二倍数。因为它们的二倍数染色体是由单倍数染色体本身加倍而来的，所以都是纯系，自交后代不会发生性状分离，花药培养已成为获得单倍体及纯合体的有效途径。单倍体在遗传研究和植物育种中具有重要的作用. 建立花药培养技术便可在短期内得到不同基因型的纯系，特别是一些优良的隐性基因，经纯合后才能得以显现，这些材料有重要的利用价值。首先，在一些基因型优良的小抱子发育而成的小植株中，可能出现经济性状突出的个体，可供育种选择之用，在花粉植株中还会出现少数异倍体和异数体植株，或在生长过程中也还可能出现异倍体及异数体的芽变，这些也均可用作育种的原始材料。此外，不同基因型的纯系也可用于杂种优势的利用。一般来说，纯系间的优良组合的杂种优势比品种间的要高，而且杂种一代整齐一致，因此，可考虑在生产上利用高产一致的杂种有性系，这项措施可能使产量及抗性方面有大幅度的改进。不同基因型的纯系还可用于研究植物的遗传学，有利于揭示木本植物性状特性的遗传规律，逐步育种工作以坚实的遗传理论为依据，从而获得更好的成效。 花药离体培养得到的植株不一定是单倍体。花药是花的雄性器官，包括体细胞性质的药壁和药隔组织，以及雄性性细胞的花粉粒。前者为二倍体细胞，后者为单倍体细胞。在离体培养过程中，由于花药愈伤组织的多倍化、核融合、花药壁和花丝等二倍体体细胞参与愈伤组织的形成、愈伤组织染色体的变化等因素，导致培养中有非单倍体植株出现。那些起源于花药壁、药隔或花丝细胞的植株，其染色体倍数应与提供花药的植株一样，完全可能是二倍体。花药离体培养是在花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。花粉离体培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术，由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育而成的植株都是单倍体，且不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰。花药离体培养属器官培养，花粉离体培养属细胞培养，但花药离体培养和花粉离体培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。花药离体培养中由于培养材料是花药，其本质是培养精细胞（属于生殖细胞，雄配子）所以新的幼苗细胞核遗传物质是亲本的一半，可看作有性生殖中的特殊类型（单性生殖）。（1）材料与方法 品种：四季桔等。接种花药的花粉发育期为单核中晚期。花蕾经50C冷处理2天。接种前花蕾用升汞消毒10分钟，在无菌条件下取出花药，接种。 诱导的基本培养基：SJ-1, N6和改良的MS等。附加KT或6-BA0.25-5mgL，2,4-D 0.5-2mgL，腺素（6-氨基嘌呤) 40mgL，GA3 1-4mgL，NAA0.1-2mgL，IAA 0.1-0.5mgL，石油助长剂1mgL（石油助长剂是一种植物生长刺激素，主要成分为环烷酸钠），水解乳蛋白(LH) 500mgL等单独或混合使用。蔗糖浓度为2-8%，pH5.8，琼脂0.8%。常用的诱导的基本培养基是： MS BA 1.0-2.0mgL2.4-D 0.05-0.2 mgL5-10蔗糖，80-100d后诱导出胚状体； N6 KT或BA 2mgL2.4-D 0.5-2 mgL8蔗糖，70d后诱导出小胚状体； MS BA2mgL IAA 0.1mgL 2蔗糖 LH500mgL ，20d 诱导出大胚状体； MS（大量元素1/2) IAA 0.1mgL GA31 -4mgL2蔗糖LH500mgL，形成小植株。 植株再生培养基：将形成的胚状体转入N60.I-0.2IBAmgL0.1mgLIAA500mgL LH5-10蔗糖，20-25，16h/d，胚状体可发育成完整植株。 培养室温度2028。诱导培养前期在黑暗条件下进行，后期转移至光照与黑暗各12h的条件下进行，光照强度为500-800lx。分化植株染色体的倍性鉴定。，于上午9时左右切取生长旺盛的根尖组织（或胚状体），浸没在0.1秋水仙碱溶液中预处理3小时，然后将材料固定于卡诺氏（3:1的酒精和醋酸）固定液中24小时，经酒精洗涤后，在600C 1当量盐酸溶液中水解15分钟，再用Schiff夫试剂（品红-醛试剂）和番红染色，压片检查染色体数目。（2） 结果 品种的差异。由于花药壁容易产生体细胞愈伤组织，而且生长速度快，严重地影响了花粉的发育，这是柑桔花药培养中遇到的最大难题，但不同品种花药壁愈伤组织的发生有明显的差异，柠檬和橙类的花药容易产生体细胞愈伤组织，而四季桔等花药体细胞愈伤组织的产生就相对地少。因此培养材料的差异性对花粉胚状体的产生有明显的影响。 培养基的作用。基本培养基对分化胚状体的作用差异不明显，而激动素与生长素的比值对胚状体的发生有明显的影响。将四季桔花药接种于基本培养基附加KT 2mgL，2,4-D 0.5mgL，或BA, 2,4-D各2mgL，蔗糖8的培养基上。经过10周左右培养之后，有少数花药从开裂药室内产生绿色球形胚状体和愈伤组织。这些球形胚状体很容易从开裂的药室散落。胚状体经转移培养可以进一步增殖。积壳在MS KT 0.2-2mgL, IAA 0.2mgL，蔗糖5 ，28d后诱导出胚状体，如果培养基为M S，蔗糖2 ，可形成小植株。当6-BA和2,4-D配合使用时，6-BA浓度为1.0-4.0mgL、2,4-D0.02-0.2mgL时，适于花粉胚发育，而当2,4-D浓度超过1mgL时，则形成愈伤组织。5柑橘胚培养 柑橘胚培养包括合子胚培养、珠心胚培养和胚乳培养。（1） 柑橘合子胚培养 柑橘具有多胚性，由于珠心胚的旺盛生长而使合子胚败育，导致人工杂交育种的失败，因此，在人工杂交受精后合子胚退化败育前将其取出培养，可以获得杂交种，所以合子胚培养主要应用于挽救败育胚。 胚培养直接再生植株的过程是：将幼胚接种于基本培养基white附加1.0mgLIAA、500mgL水解酪蛋白或用MS附加1.0mgLGA3，26，16h/d ，可再生植株。 另一途径是经愈伤诱导后再分化：将幼胚接种于基本培养基MT附加 1.0mgL2,4-D、0.5mgL6- BA和蔗糖5，暗培养可诱导愈伤组织。将愈伤组织接种于基本培养基MT附加0.1mgLNAA、0.25mgL6-BA、1000mgL麦芽膏上，芽分化，芽长到适当高度转至MT附加1.0mgLNAA 诱导生根。 多胚性柑桔早期合子胚显微分离的最适时期为授粉后5055d。利用显微操作系统，采特制钢针(针尖大小控制在50m左右)代替传统的微细玻璃针，可提高多胚性柑桔早期合子胚的分离效率。 MS、White和MT三种基本培养基都适合柑桔早期合子胚的离体培养，柑桔早期合子胚成熟培养的最佳植物生长调节剂浓度配比及最适蔗糖浓度，应根据不同品种或类型进行优化。（2） 柑橘珠心胚培养利用柑桔的多胚性培育珠心苗是柑桔育种和品种脱毒复壮的一种最早使用且十分有效的方法。 材料和方法 盛果期的朋娜和纽贺尔脐橙, 砧木是枳壳。 胚珠培养: 采花后78 周的幼果,自来水冲洗后, 在超净工作台上, 用75 %酒精浸510 s , 再用10 %的次氯酸钠加0.1 %吐温80 , 浸泡810 min , 无菌水冲洗35 次备用。幼果横切, 在双目解剖镜下, 用尖头刀挑起胚囊内的幼嫩胚珠, 接种于不同培养基上。胚珠培养主要采用MT 基本培养基,蔗糖浓度3 % 5 % , 0.8 %琼脂, pH5.8 ,附加麦芽汁2 ml/ L 、6-BA 5 mg/ L 、NAA0.51.0 mg/ L 、IBA 0.5 mg/ L 。 砧木苗的培养: 枳橙、枳壳、红桔和酸橙的成熟种子,75 %的酒精过1 次,10 %次氯酸钠加0.1 %吐温80 浸10 min 灭菌,无菌水冲洗35 次,剥去内外种皮,然后播种于固体MT 培养基上,置于27 暗培养。生长1315 d ,黄化苗置于自然光下24 h 后,用作嫁接砧木然后。 多丛芽嫁接：即在无菌条件下, 切去砧木的顶端, 留茎长34 cm , 根长45cm , 在茎顶端纵切一刀, 劈成两半, 大约0.70.8 cm 长, 然后把多丛芽切成楔形,嵌入砧木切口中, 放入含滤纸桥的液体MT培养基培养。结果 不同培养基对愈伤组织诱导：朋娜、纽贺尔脐橙开花后78 周的幼果, 胚珠大小在11.5 mm 左右, 呈乳白色, 半透明, 明显区别于其他组织 。在双目解剖镜下, 挑取胚珠接种于不同培养基上。在接种两周后, 少数胚珠转绿, 继而从中形成胚状体。 朋娜脐橙胚状体发生百分率略高于纽贺尔脐橙。 麦芽汁、BA 都能明显促进胚状体的发生, 在MT麦芽汁2 ml/ L或MT6-BA 5 mg/ L或MT麦芽汁2 ml/ L6-BA 5 mg/ L三种培养基中，朋娜由愈伤组织形成胚状体的为20-21%，纽贺尔则是16-18%。愈伤组织的生长速度、颜色、质地同胚状体的产生有一定的关系。产生胚状体的愈伤组织其生长速度较慢、黄褐色、质地较疏松, 而生长速度较快、白色、质地致密的愈伤组织未见有胚状体产生, 茎、芽也不易分化。 植株再生：朋娜、纽贺尔愈伤组织胚状体发生能力很强, 在各种不同激素水平的培养基上继代, 均能以胚状体形式增殖。将胚状体转至含5 mg/ L AgNO3 的MT 培养基上, 开始胚状体增殖很快, 少数胚状体形成小植株。当用MT 培养基和含AgNO3 的MT 培养基进行交替继代培养两次以后, 胚状体逐渐变小, 白色松散的愈伤组织部分明显增加。这时, 挑出愈伤组织部分, 经过多次继代培养, 可筛选出胚性愈伤组织。将胚性愈伤组织或从胚状体团中分离出的叶形胚转入MT + NAA + BA 和MT + BA的分化培养基中, 可产生许多芽, 进而形成多丛芽。附加NAA、BA 两种激素的分化培养基, 产生多丛芽的数量多于仅加BA 的培养基。 生根培养：待多丛芽长至2 cm左右从基部切断，接在蔗糖浓度为3 %、0.8 %琼脂、0.5 g/ L 活性炭的MT + NAA 1.0 mg/ L、MT + NAA 0.5 mg/ L、MT + IBA 0.5 mg/ L、MT + NAA 1 mg/ L+ IBA 0.5 mg/ L，三种培养基上，均能长出新根，其中以MT + NAA 1.0 mg/ L +IBA 0.5 mg/ L 培养基生根效果最好，两品种根的分化率均可达40左右，形成完整植株，但生长速度很慢, 且很不规则。多丛芽嫁接：将从胚状体诱导而来多丛芽在无菌条件下直接嫁接到枳橙、枳壳、红桔和酸橙等4 种试管培育的砧木上。多丛芽嫁接能明显提高珠心苗的成活率, 获得更多的珠心苗，枳橙和枳壳作砧木嫁接成活率较高，两品种均可达80以上, 而红桔和酸橙嫁接成活率较低，在50-68之间。 移栽：嫁接成活后的小苗, 先插入固体MT培养20 d , 能明显促进珠心苗的生长。移苗前在自然光常温下炼苗3 d 后再移出试管。试管苗移植于盛有湿润蛭石的花盆中, 起初两周用烧杯罩苗, 以保持盆内的湿度。定期用半量的Hogland 营养液浇灌。多丛芽嫁接法比扦插法成活率、成苗率均明显提高。总结 78 周幼果, 所取胚珠可获得较高诱导率；通过加AgNO3培养基的多次继代筛选, 还能得到胚性愈伤组织, 为原生质体培养、体细胞融合及转基因植株, 提供了最好的材料；3 种获取珠心苗的途径:由胚状体直接分化出苗；先诱导出胚性愈伤组织, 再经分化培养基分化出多丛芽,并在生根培养基上生根, 形成珠心苗；、由胚状体分化出多丛芽后, 把多丛芽嫁接在适应的砧木上, 形成珠心苗。其中以多丛芽嫁接形成的珠心苗根系完整, 生长迅速, 而且出苗率高, 移栽出盆的成活率也高。（3） 柑橘胚乳培养(endosperm culture) 胚乳培养是将胚乳从植物种子中分离出来进行无菌培养，并获得再生植株的技术。胚乳是被子植物双受精的产物，是一个精子与两个极核相融合发育而成，所以是三倍体。胚乳也是种子养料的贮藏部分，提供胚发育及种子萌发，幼苗生长的养料需要，直到被消耗尽为止。但兰科、河苔草科和菱科植物几乎不形成胚乳。豆科植物也无胚乳，而是把养分贮藏在子叶内。裸子植物的胚乳在受精前形成，因此，它是单倍体。20世纪30年代初期兰普和米尔斯通过玉米胚乳的培养得到靠近胚的细胞的起动分裂， 首次证实了胚乳培养的可能性。后来美国的C.D.拉鲁及他 的同事，经过几年努力，于1949年第一次报道了从未成熟的玉米胚乳建立起继续生长的组织。1963年H.Y.莫汉和A. 萨特桑格证实成熟的胚乳细胞也具有分裂能力。1965年B. M.乔赫里对檀香科植物的培养中，首次发现胚乳直接分化出芽。证实胚乳细胞全能性是1973 年印度学者Sruvastava首次由自养被子植物罗氏核实木获得三倍体植株。胚乳培养的研究价值 和意义在于:通过胚乳培养获得无籽结实的三倍体植株，产量高品质好，这为果类及大花型花卉植物品种选育提供了多倍体育种的新途径；根据大多数植物在培养中表现出的染色体倍性的混乱，可以进一步探讨和研究造成倍性混乱的原因和机理，将对植物形态发生、细胞遗传学和遗传育种学 提供重要资料；通过胚乳培养，