赖氨酸发酵工艺研究指导书.doc

赖氨酸的发酵调控研究一、 实验目的1、 了解赖氨酸发酵常用的发酵菌种。2、 掌握L-赖氨酸发酵的工艺控制过程和方法。3、 能熟练运用发酵过程的基本原理，根据实验的不同要求，正确的设计实验方 案，并按照实验方案进行实验研究二、 实验原理赖氨酸的生产方法有水解法(已淘汰)、合成法、酶法和直接发酵法。直接发酵法合成的赖氨酸是一种次级代谢产物。微生物合成赖氨酸是诱导物的诱导调节、自身产物的反馈调节、自身产物的分解调节、以及细胞膜透性的调节等次级代谢调节综合作用的结果。谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的自身产物调节作用如图1所示。天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛双氢吡啶羧酸丝氨酸苏氨酸异亮氨酸甲硫氨酸赖氨酸高丝氨酸脱氢酶苏氨酸与赖氨酸的协同反馈抑制作用图1 谷氨酸棒杆菌合成赖氨酸的自身产物调节作用三、 材料与分析方法1、 菌种谷氨酸棒杆菌（编号10065，中国微生物菌种保藏管理中心）。2、 培养基（1）斜面培养基：牛肉膏1.1%，蛋白胨1.0%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，琼脂0.2%，pH7.0，在0.1Mpa压力下灭菌20min。（2）种子培养基：糖蜜2.0%，豆饼水解液0.5%，(NH4)2SO4 0.4%，CaCO3 0.5%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.04%，pH7.0,，于250mL三角瓶内装25mL种子培养基, 在0.1Mpa压力下灭菌20min。（3）发酵培养基：糖蜜20%，豆饼水解液1.0%，玉米浆（氮源）0.6%，(NH4)2 SO4 2%，K2HPO4 0.1%，MgSO4 0.05%，FeSO4 0.2%，MnSO4 0.2%，pH7.0，于250mL三角瓶装液25mL发酵液，在0.1Mpa压力灭菌20min。3、分析方法（1）丝氨酸的测定采用变色酸-分光光度法测定（见附录1）。（2）赖氨酸的测定发酵液中赖氨酸含量的测定采用茚三酮比色法，并加以改进。吸取发酵液4mL, 6000r/min离心10min去菌体及杂质。取上清液2mL，加茚三酮试剂（A液：茚三酮1.25g溶于94mL乙二醇甲醚中；B液：CuCl22H2O 1.97g溶于32mL 0.1mol/L柠檬酸溶液中；将A、B两液混合，用蒸馏水定容到250mL）4mL， 混合，在沸水浴加热20min，冷却后测定475nm处的吸光度值，通过查赖氨酸标准曲线得知发酵液中赖氨酸的浓度。（3）菌体形态观察、菌种培养特性和菌种主要生理生化特性检查参照工业微生物试验技术手册的方法.。（4）高丝氨酸脱氢酶活力的测定从图1 可知，天冬氨酸半醛在高丝氨酸脱氢酶的作用下可以转化为丝氨酸，因此，本实验以一定反应条件下，单位时间内生成的丝氨酸的量所需的酶作为一个酶活力单位（U）1U=1ug/min。粗酶液的制备取5ml发酵液5500g离心15min，用pH 7.5的0.25mmol的Tris-HCL缓冲液洗涤两次，超声波破碎10min，10000g离心15min得上清液即为粗酶提取液；取粗酶液和1.0mg/ml的天冬氨酸半醛按1:1的比例混合，32水浴保温5min，转入100的水浴终止反应1min，取1ml按丝氨酸的含量测定法进行测定。（关于酶与底物反应的量要进行试验调整，以上仅供参考）。四、试验方法与步骤1、将活化的斜面培养菌接种于种子培养基中，置于往复摇床上30振荡培养24h，得到种子培养物。2、将种子培养物调整为64107个菌体/mL的种子培养液。按110的接种量将种子培养液接种于发酵培养基中，在302、pH7.07.2条件下发酵72h。五、结果与分析1、该发酵菌种的生长特性，绘制菌种生长及代谢产物形成与培养时间的特征曲线；2、构建该菌种在最佳发酵条件下的细胞生长、底物利用和产物形成动力学模型；3、找出该菌株发酵生产赖氨酸的主要影响因素，确定调控措施，确定其最佳发酵条件。附录丝氨酸含量的测定方法1、标准曲线的制作分别精密吸取1.0mg/mL的丝氨酸标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10 mL刻度试管中，滴一滴甲基红试液（取0.1g甲基红溶于100mL95%乙醇中），加1.0molL1的NaOH溶液使之刚呈碱性，再加0.075molL -1 NaIO4溶液1.0 mL；10 min后，滴加10%三氯乙酸溶液使呈酸性，再加入10%的NaHSO3溶液1.0 mL并补加水至10.0 mL，摇匀，取2.0 mL于10mL具塞离心管中，加变色酸试剂（取变色酸50 mg溶于100 mL体积分数75%硫酸中）2.0 mL，加塞混匀后于沸水浴中保温30min，取出，冷却至室温，加半饱和硫脲溶液(在20度温度下，称取超过137克的硫脲，加入1000ml蒸馏水中，充分搅拌，使其充分溶解。过滤后去除滤渣，所得到的溶液即为饱和溶液)0.5mL，摇匀。用分光光度计测量反应产物在波长570nm处的吸光度。将吸光度对浓度进行直线回归，得丝氨酸标准曲线方程。2、样品测定将待测氨基酸样品溶液适当稀释后，准确吸取一定体积的样品稀释液，按照标准曲线绘制的方法测定吸光度，从标准曲线上查得丝氨酸的质量浓度。底物还原糖含量的测定1实验原理 在NaOH和丙三醇存在下，3,5二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。2试剂3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000mL。葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100mL，即含葡萄糖为2.0mg/mL。3操作方法葡萄糖标准曲线制作取6支1. 5 cmm1.5cm试管，按下表加入2.0mg/mL葡萄糖标准液和蒸馏水。管号葡萄糖标准液（mL）蒸馏水(mL)葡萄糖含量(mg/mL)A540001010.20.80.420.40.60.830.60.41.240.80.21.65102在上述试管中分别加入DNS试剂2.0mL，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0mL，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。4样品测定将待测还原糖样品溶液适当稀释后，准确吸取一定体积的样品稀释液，按照标准曲线绘制的方法测定吸光度，从标准曲线上查得还原糖的质量浓度。谷氨酸棒杆菌菌体生长量的测定每隔一定时间取样,测定菌液的光密度值(OD620) ，已未接种的培养基作为参比溶液，绘制菌体生长状况曲线。种子培养基细菌计数挑取已活化的单菌落接种于种子培养基中，30，120r/min摇床振荡过液培养，大概18小时；培养过程中取菌液测量菌体数，测量方法如下：在白纸上画1cm的正方形，将玻片置于其上；用微量注射器去10ul的菌液，用接种针涂抹均匀，保持在正方形区域内，待干；置于试管架上，在水蒸气上固定5min，待干；滴一滴美蓝染液染色2min，用滤纸戏去多余的染液，待干；用水洗去多余的染液，待干，并用油镜镜检，记录3050个视野，细菌数=3050个视野细菌数/（3050）*500000,细菌数的数量级在107108即可赖氨酸的发酵调控研究的可能研究点1） 不同的碳氮源