综合性设计性试验内容——热激诱导的玉米幼苗耐热性观及其生理.ppt

综合性 设计性实验内容 热激诱导的玉米幼苗耐热性观及其生理生化机制研究 第一部分实验背景 Mechanicalstimulation Bioticstress Touch Wind Rain Wound Mechanicalstimulation Braam2005 返回 Bioticstress 返回 Haley1995 Yahraus1995 Garces2001 H2O2 Ca2 NO Borsics2001 Polisensky1996 Braam1992 植物细胞中ROS产生途径 Oxalateoxidase APX GR Decomposation CAT 氧化还原平衡 60 90 10 40 H2O2 O2 OH 1O2 1mS min 4mS 2mS 1nS 第二部分植物材料的培养 热激和热处理 植物材料的培养品种为晴3或鲁玉13的玉米种子 购于西山种子公司 用0 1 HgCl2消毒10min后 用蒸馏水漂洗干净 用蒸馏水于26 下吸涨12h 播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘 24cm 16cm 中 于26 下暗萌发60h 计算发芽率 选取长势一致的玉米幼苗做以下处理 去除较矮或较高的玉米幼苗 热激把上述玉米幼苗经42 热激处理4h并于26 恢复培养4h后 对照组 未热激 玉米幼苗仍在26 下继续培养8h 热处理恢复后 然后把经热激和未热激的玉米幼苗转入47 下高温处理14 17h 白磁盘加盖 伤害率和存活率测定处理结束后 先观察伤害率 胚芽鞘明显变褐 在把玉米幼苗转到26 下恢复培养7d 每天光照12h 然后计算存活率 以恢复培养过程中能够转绿并恢复生长的玉米幼苗视为存活的幼苗 第三部分生理指标的测定 一 热激诱导的玉米幼苗耐热性部分生理指标的测定 伤害率存活率组织还原力 还原力 膜伤害 丙二醛 含量 直接观察统计 Heat Salt Drought Heavymetal 532nm 440nm 返回 伤害率的测定 返回 存活率的测定 返回 植物组织活力测定方法参考文献 组织活力的测定 原理有活力的植物组织由于呼吸作用的存在 底物脱下来的 可以形成NADH2或NADPH2 无色的TTC 红四氮唑 可以被前者还原为红色的TTF 三苯基甲潜 其最大光吸收为485nm 测定 分别取48 高温处理17h实验组和对照组的胚芽鞘0 g 加入5ml0 6 TTC溶液 用50mmol LPBS pH7 0配制 抽气使TTC渗入组织 27 15h 去除TTC溶液 着色的胚芽鞘加入少许石英砂和95 乙醇 充分研磨提取TTF 80 水浴10min 冷却后定容到25ml 测定OD485 用OD485 g 1FW表示组织活力 返回 MDA含量的测定 原理植物在遇到干旱 高温 低温 盐渍以及衰老等情况下 植物体内H2O2 O2 OH 等活性氧 reactiveoxygenspecies ROS 大量积累 返回 导致膜脂过氧化而积累MDA 因此MDA常作为植物逆境伤害指标 在酸性条件下MDA与硫代巴比妥酸 TBA 反应生成粉红色化合物 此化合物在532nm处有最高吸收峰 155mM 1 cm 1 MDA提取 分别取0 5g实验组和对照组的胚芽鞘 加入3mL5 三氯乙酸 TCA 和少许石英砂 充分研磨 用2mL5 TCA洗研钵 5000rpm离心10min 上清液定容至10mL 测定 分别取上清液各2mL 加入0 6 TBA 用20 TCA配制 2mL 煮沸15min 冷却后分别测定OD600和OD532 ASA测定 计算 返回 二 热激诱导的玉米幼苗耐热性的可能机制 抗氧化酶系统 包括过氧化氢酶 CAT 抗坏血酸过氧化物酶 APX 过氧化物酶 POD 多酚氧化酶 PPO 等 抗坏血酸含量的测定脯氨酸 Pro 含量的测定蛋白质含量的测定 抗氧化系统测定实验背景 CAT APX POD PPO是植物体中非常重要的末端氧化酶 CAT APX POD可以清除植物体内多余H2O2 PPO可以把酚类物质转变为醌 后者对病原微生物起重要的抑制和杀伤作用 因此 它们在植物抗病性 抗热性等抗逆性中起着非常重要的作用 是植物抗逆性的重要生理指标 高O2亲和力 占耗氧量80 PPO 抗病及伤 对O2亲和力弱 APX 抗逆性 乙醇酸氧化酶 黄素氧化酶 对温度不敏感 对O2亲和力极低 CAT 抗逆性 POD 抗逆性 SOD 抗逆性 NADH NADPH FMN UQ cytb cytc1 cytaa3 O2 交替氧化酶 抗CN 抗氧化酶与植物抗逆性关系 抗氧化酶动力学曲线 植物抗氧化酶提取和测定参考文献 返回 四种抗氧化酶的提取 分别取0 5g实验组和对照组的胚芽鞘 加入少许石英砂和3ml提取液 50mmol LPBS pH7 0 内含0 mmol LEDTA 0 2mmol LASA 1 PVP 充分研磨 转入离心管中 用2ml提取液洗研钵 10000rpm离心10min 上清液定容至5ml 测定四种酶活性或分装后转至 20或 80 保存 2 CAT和APX活性的测定 原理H2O2和ASA分别在240和290nm处有最高吸收峰 它们的毫摩尔吸收系数 分别为0 0 和2 8mM 1cm 1 因此 可以用单位时间内H2O2或ASA的消耗量分别表示CAT或APX活性 CAT活性测定 反应混合液 50mmol LPBS pH7 0 内含 mmol LH2O2 2 9ml 加入50ml酶液 25 预热 min 加入600mmol LH2O250ml启动反应 分别读出反应0 5min和3 5min的OD值 求出 OD240 APX活性测定 反应混合液 50mmol LPBS pH7 0 内含1mmol LASA 2 9ml 加入50ml酶液 25 预热 min 加入60mmol LH2O250ml 分别读出反应10Sec和60Sec的OD值 求出 OD290 3 POD和PPO活性的测定 原理1 愈创木酚 4 邻甲氧基苯酚 H2O2 四邻甲氧基苯酚 Amax 470nm 26 6mM 2 邻苯二酚 邻醌 Amax 410nm POD测定 取POD反应混合液 10mmol L愈创木酚 5mmol LH2O2 用PBS溶解 2 95ml 加入酶液50ml 空白调零用PBS取代 立即记时 摇匀 反应3min 测出A470 PPO测定 取PPO反应混合液 20mmol L邻苯二酚 用PBS溶解 2 8ml 加入酶液0 2ml 空白调零用PBS取代 立即记时 摇匀 反应2min 测出A410 以每分钟A值变化0 01所需要的酶液的量为一个活力单位 U 则 抗坏血酸含量的测定 原理 还原型抗坏血酸 ASA 可把Fe3 还原为Fe2 后者与红菲罗啉反应形成红色螯合物 最大光吸收为534nm 抗坏血酸的提取 同MDA提取 ASA测定 1ml样品 加入1ml5 TCA 1ml无水乙醇 摇匀 0 5ml0 4 H3PO4 乙醇 1ml0 5 红菲罗啉 BP 乙醇 0 5ml0 03 FeCl3 乙醇 30 水浴30min OD534 DASA测定 1ml样品 加入0 5ml60mmol LDTT 乙醇 0 5mlNa2HPO4 NaOH混合液使溶液的调至7 8 室温10min 0 5ml20 TCA把调到1 2 按上述方法测定 标准曲线的制作 以5 TCA为溶剂配制2 4 6 8 10mg mlASA按上述方法制作标准曲线或根据K 0 187 mmol L 1cm 1计算 脯氨酸测定实验背景 植物在遇到干旱 高温 低温 盐渍等逆境胁迫情况下 植物体内通过 蛋白质的降解 从头合成和 降低脯氨酸氧化酶活性等途径合成脯氨酸 Proline Pro Pro具有保护蛋白质 酶 降低植物细胞水势 清除ROS等复杂的生理功能 从而提高了植物对逆境的抵抗能力 Pro具有保护蛋白质 酶 降低植物细胞水势 清除ROS Pro提取与测定方法参考文献 Pro含量的测定 原理植物在遇到干旱 高温 低温 盐渍等逆境胁迫情况下 植物体内通过 蛋白质的降解 从头合成和 降低脯氨酸氧化酶活性等途径合成脯氨酸 Proline Pro 从而提高了植物对逆境的抵抗能力 在酸性条件下与茚三酮发生反应生成红色化合物 此化合物在520nm处有最高吸收峰 3 24mM 1 cm 1 Pro的提取 分别取0 5g实验组和对照组的胚芽鞘 加入3mL3 磺基水杨酸 SSA 和少许石英砂 充分研磨 用2mL3 SSA洗研钵 10000rpm离心10min 上清液定容至5mL 测定 上清液各2mL 分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂 煮沸15min 冷却后分别测定A520计算 595nm 465nm G250 G250蛋白质复合物 返回 蛋白质含量的测定 原理 考马斯亮蓝的最大光吸收为465nm 它与蛋白质结合后最大吸收峰转移至595nm 并且反应迅速 2min 稳定性好 1h 蛋白质的提取 同抗氧化酶的提取 测定方法 考马斯