液相阻断ELISA检测方法.doc

一、亚洲I型口蹄疫抗体液相阻断 ELISA 试验操作方法一、试验器材准备1.移液器:5-50l移液器、0.210l移液器、50200l移液器、50300l 12道移液器各一把。2.移液枪尖 (若干)。3.抗原抗体反应板:微量血凝板(U型、V型均可)5块,本试剂盒配备两块,用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。注:抗原抗体反应板可重复使用,实验后,用水冲洗干净,然后用无离子水沸水浴30秒,晾干,待用。4.超纯水 , 无离子水或蒸馏水。二、试剂准备1.包被缓冲液(PH9.6)将所购试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开,将胶囊内粉末倒入100ml无离子水中溶解即可。4存放,1月内有效。2. 洗涤液(PBST)将试剂盒配备的 25 倍浓缩 PBST 液(可能有结晶形成,用时微热溶化)用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。(如果PH降低,务必用NaOH调至7.4)3.底物溶液取1片柠檬酸磷酸盐片剂(试剂盒配备)溶于100mL无离子水中,溶化后,取50mL溶液, 再加1片邻苯二胺(OPD)片剂,充分溶解,分装（5mL/ 瓶或 10Ml瓶 ), 避光之-2O保存。 用前避光溶化 ,临时每1mL上述溶液加 10L 本试剂盒配备的 3% 的双氧水(H202) 。三、操作步骤 1.用包被缓冲液稀释亚洲 1 型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓(1:1000), 在 ELISA 板上每孔加 50l, 振荡 , 封板或置湿盒内，室温过夜。图 1 96 孔酶标板检测 10 份样品布局图S1 1:8S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:161：641:81:321：1281:641：2561:1281：5121:2561:10241:5121:20481:l0241:4096图 1 为抗体滴度测定 (定量) 检测 10 份样品布局图;图 2 为抗体滴度测定( 定量 )检测 20 份样品布局图。2. 抗原抗体(阴阳性对照血清及待检血清)反应根据不同的需要,选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。图 2 96 孔酶标板检测 20 份样品布局图S1 1:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S1 1:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以图 1 为例 , 在 U 型血凝板上按 50 l/孔量用 PBST 将待检 血清从1:4开始做2倍连续稀释至 1:512。同时,按图示稀释阴阳性对照血清 , 然后每孔加入 50 l 用 PBST 稀释到使用浓度的亚洲型口蹄疫病毒抗原 (1:4,即1份病毒抗原、加3份PBST), 病毒抗原对照孔加100l。振荡混匀,封板,4过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。3.用洗涤液 (1PBST) 洗 ELISA板5 次,在洗水纸上甩干,再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔,每孔50l封板,37温育1小时。4.同上洗板5次, 甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释亚洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度 (1:1000), 每孔加50l,封板,37温育1小时。5.同上洗板 5 次 , 甩干。用 lPBST 稀释兔抗豚鼠酶结合物至工作浓度 (1:500), 每孔加 50 l 封板 ,37 温育 1 小时。6. 同上洗板5次,每孔加50l底物溶液 (务必加双氧水),37温育15分钟。每孔再加50l终止液终止反应,立即在492nm波长下读取光吸收值(OD492nm值)。四、结果判定1. 试验认可标准每块板设 4 孔病毒抗原对照,病毒抗原对照不加任何血清,直接用PBST稀释至使用浓度,与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔,50l/孔,病毒抗原对照OD492nm 值应在1.50.5范围内。 阳性对照抗体效价应在1:10241滴度以内,阴性对照血清抗体效价应1:8。2.病毒抗原对照平均OD492nm 值50%计算(临界值)抗原对照是4孔,弃去最高和最低OD492nm值,计算剩余2孔的平均OD492nm值,再除以2,即50%对照值。该值即为临界值，表示阻断50%反应的对照OD492nm值。3.结果判定以病毒抗原对照平均OD492nm 值的50%为临界值,被检血清稀释孔OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔,小于或等于临界值的孔为阳性孔,阳性孔的OD492nm值等于临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。例如病毒抗原对照平均OD492nm值为1.2,则其50%为0.60。若某一待检血清在1:128时OD492nm值为0.6,则该份待检血清的抗体滴度为 1:128 。若临界值处于两个滴度之间 ,如处于1：64与1：128之间，则抗体滴度取中间值为1:9O。定性检测中 , 两个重复孔只要有 一孔为阳性孔 , 则抗体滴度判 定为 1:128, 两孔均为阳性孔 , 则判定 为抗体滴度