一株产胶原酶海洋微生物发酵条件的研究.doc

基金项目：辽宁省教育厅A类项目（2008063）。第一作者简介：白杨，男，1984年出生，硕士，主要从事生物活性物质及酶性质的研究。E-mail：。通信作者：钱斯日古楞，男，1969年出生，副教授，博士，主要从事酶的改性及应用性研究。通信地址：116000 辽宁省大连市大连工业大学生物学院，E-mail：。收稿日期：2010-09-16，修回日期：2010-10-25。一株产胶原酶海洋微生物发酵条件的研究白 杨，钱斯日古楞，王红英（大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034）摘 要：于海洋污泥中筛选得到的Aeromonas sp.F3所产的胞外酶对胶原蛋白有水解作用，采用单因素试验法对Aeromonas sp.F3的发酵条件及培养基组分进行全面优化，提高该胶原酶生产菌的产酶效率。经优化试验结果表明，该菌株最佳发酵条件为：培养时间24 h，温度40，初始pH为8，装瓶量80100 mL/250 mL；培养基组分为：葡萄糖3 g/L，酵母浸粉9 g/L，NaCl 5 g/L，MnSO4 10 mg/L。经优化试验明显提升了该菌株的产酶能力。关键词：胶原酶；发酵条件；优化；酶活中图分类号：TQ925.2文献标志码：A论文编号：2010-2734Fermentation Conditions of a Collagenase-Producing Marine MicroorganismBai Yang, Qian Siriguleng, Wang Hongying(School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian Liaoning 116034)Abstract: Aeromonas sp.F3 screened from marine mud should secrete a protease to hydrolyze collagen. The fermentation of Aeromonas sp.F3 was investigated through single-factor test. The main factors included fermentation conditions and the medium. With single factor trial, the optimal culture condition was determined: 40 of fermentation temperature, pH8 and volume 80100 mL/250 mL for 24 h. The optimal liquid medium was: 3 g/L glucose as carbon source, 9 g/L yeast extract powder as nitrogen source, 5 g/L NaCl as inorganic salt and 10 mg/L MnSO4 as metal ion. Under the optimum condition, the enzyme activity increased very observably.Key words: collagenase; fermentation conditions; optimization; enzyme activity0 引言中国是世界渔业生产大国、水产品出口大国和主要远洋渔业国家，水产品总产量连续20年位居世界第1，世界水产养殖总产量的70%来自中国。近年来，仅鱿鱼年产量就达到12万t以上。在鱿鱼的深加工中会产生15%20%的内脏及表皮等废弃物1，不仅如此，在淡水鱼的加工中，鱼鳞和鱼皮也被作为废弃物扔掉。这些废弃物具有很高的营养价值，含有大量的粗胶原蛋白，如果能充分利用这些渔业下脚料来提取胶原蛋白，不仅能促进渔业的进一步发展产生巨大的经济效益，也能减少环境污染2。胶原蛋白是由3条肽链拧成的螺旋形蛋白质3，广泛存在于人体的皮肤、骨骼、肌腱和内脏等部位，具有极其重要的生理功能，并在医疗、美容、保健、食品等许多方面具有极其广泛的应用4-7。胶原蛋白的提取有多种方法，其中酶法在提取效率及安全性上都有明显的优势8。胶原酶，即胶原蛋白水解酶，在其适合条件下能特异地降解胶原蛋白的三螺旋结构，且不损坏其活性肽结构。相比动物源胶原酶，微生物源胶原酶不只提取方便，而且具有更广的应用范围9。许多土壤、皮毛、海水来源的微生物都能产生胶原酶10，例如一些梭菌、弧菌和类菌体等。笔者对试验室提供的产胶原酶菌株Aeromonas sp.F3的培养条件及培养基组分进行优化设计，以期提高其胶原酶的单位产量。1 材料与方法1.1 试验时间、地点试验于2009年9月2010年6月在大连工业大学生物工程学院发酵工程试验室进行。1.2 试验材料菌株Aeromonas sp.F3由试验室提供，于海洋污泥中筛选分离。1.3 试验方法1.3.1 仪器与药品 本研究室内使用仪器为上海日立电器有限公司生产的冷冻离心机，上海精密科学仪器有限公司生产的UV755B紫外分光光度计。试剂均为国产分析纯。1.3.2 种子培养基的制备 在斜面上挑取一菌环接种于LB培养基中，30180 rpm条件下摇瓶培养24 h，即为种子培养基。冰箱4保存，种子培养基使用时间不宜过长。1.3.3 酶液的提取 取发酵液8000 rpm低温离心5 min，去沉淀取上清液。冰浴条件下，边搅拌边缓慢加入乙醇，使乙醇最终浓度达到60%11，4静置12 h，10000 rpm低温离心15 min，弃上清液，定量水将沉淀复溶，冰箱保存备用。1.3.4 胶原酶相对活力的测定 取1 mL酶液于试管中，置试管于40水浴锅中预热5 min，加入已预热的2%酪蛋白溶液l mL，精确计时10 min，加入0.4 molL三氯乙酸2 mL终止反应12。对照组试管的三氯乙酸在加入酪蛋白之前加入试管。取反应液过滤，用福林法13测定酪氨酸浓度，计算相对百分比。1.3.5 统计分析 分别以影响因子为横坐标，相对酶活为纵坐标，通过Excel作出相应的曲线图或柱状图，并进一步分析。2 结果与分析2.1 培养时间的确定将菌株接种于LB培养基中，30180 rpm条件下摇瓶培养，分别于12、24、36、48、72 h后，取样测定酶活，计算相对酶活，结果如图1。12 h到36 h之间，菌液稳定维持了较高的活力，36 h后酶活迅速下降。发酵液24 h左右的酶活达到峰值，12、36 h时的酶活分别是24 h时的82%、95%。因此在以下试验中，将发酵时间控制在24 h。图1 培养时间对酶活影响2.2 温度对产酶影响将菌种分别在20、25、30、35、40、45条件下摇瓶培养24 h，提取酶液测定酶活，结果如图2所示。前期试验已经确定菌体在20以下时生长较为缓慢，因此最低温度选择25、25到30之间，酶活变化不大，30之后酶活迅速上升，40时的酶活相比30时提高了32%，在45时酶活开始下降，说明最佳发酵温度为40左右。图2 温度对酶活影响2.3 初始pH对产酶影响将菌株接种于初始pH分别为6、7、8、9、10的液体培养基中摇瓶培养24 h后，提取酶液测定酶活。图3结果表明，pH为68时，随pH增大，酶活缓慢上升；pH为89时，该菌株产酶活性迅速下降；pH为910时，酶活基本稳定，且相比pH=8时的酶活仅下降了20%，可见该菌株能耐受适当的碱性环境，综上可知初始pH应控制在8。图3 初始pH对酶活影响2.4 装瓶量的确定以250 mL三角瓶进行发酵培养时，分别取80、110、140、170、200 mL的装瓶量，以相同比例接种量接种摇瓶培养24 h后，提取酶液测定酶活。由于氧气在液体中的低溶解度，当摇床转数一定时，装瓶量决定溶氧量14。图4表明，该菌株明显为好氧菌，装瓶量在100 mL以下时，酶活虽然是随装瓶量降低而升高，但是其变化不明显，考虑到提酶时的菌液量，宜将装瓶量控制在80100 mL左右。图4 装瓶量对酶活影响2.5 培养基组分优化2.5.1 碳源的选择 分别选择蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉作为碳源，摇瓶培养24 h后，提取酶液测定酶活，结果如图5所示，以葡萄糖为碳源时酶活最大，而以蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖及可溶性淀粉为碳源时，其酶活分别达到葡萄糖的53%、63%、82%及86%。发酵培养基选择葡萄糖为碳源。图5 碳源的选择2.5.2 碳源浓度的确定 选取葡萄糖浓度分别为1、3、5、7、9 g/L摇瓶培养24 h后，提取酶液测定酶活。结果如图6所示，葡萄糖浓度由1 g/L增加到3 g/L时，酶活上升了11%；当葡萄糖浓度大于3 g/L时酶活开始下降，在整个19 g/L的大区间内，发酵液酶活力变化不超过11%，葡萄糖为1 g/L时酶活最小，也达到了3 g/L时最大酶活的89%，可见葡萄糖浓度对酶活影响不大。综上所述，培养基葡萄糖初始浓度应控制在3 g/L。图6 碳源浓度对酶活影响2.5.3 氮源的选择 分别选择蛋白胨、酵母浸粉、明胶、尿素、硫酸铵为氮源，摇瓶培养24 h后，提取酶液测定酶活。由图7可知，以酵母浸粉为氮源时效果最佳，其酶活比蛋白胨提高了2倍以上，以明胶、尿素、硫酸铵为氮源时，其酶活分别为酵母浸粉的2.8%、1%和2.2%，产酶量极低。图7 氮源的选择2.5.4 氮源浓度的确定 选取酵母浸粉浓度分别为1、3、6、9、12、15 g/L摇瓶培养24 h后，测定酶活。由图8可知，当氮源酵母浸粉的浓度由1 g/L增加到9 g/L时，酶活迅速增加；当氮源浓度为9 g/L时，发酵液酶活达到最高，其酶活是1 g/L时的129倍，可见氮源浓度对产酶影响极大；当氮源浓度大于9 g/L时，酶活不再升高。因此，培养基氮源初始浓度应控制在9 g/L左右。图8 氮源浓度对酶活影响2.5.5 金属离子对产酶的影响 培养基组分确定后，额外添加镁离子、铜离子、锌离子、钙离子及锰离子，使其浓度分别达到10、50、100、200 mg/L后摇瓶培养，测定酶活，结果如图9所示。钙离子和镁离子对产酶影响不大，其中钙离子还具有微弱的促进作用。锌离子对产酶有抑制作用，且随其浓度增加，促进作用加强。铜离子在低浓度时，对该菌株产酶有明显的促进作用，而随其浓度增加，铜离子由促进又转为抑制。锰离子在200 mg/L范围内，均能促进产酶，在低浓度范围促进作用最强。综上所述金属离子选择锰离子，添加浓度控制在10 mg/L左右。有研究结果指出，钙、镁、锰这3种金属离子对1000多种蛋白酶的酶活都有促进作用，且其促进作用与浓度有很大关系15，因此不排除金属离子对酶促反应的附加作用对试验有一定的影响。图9 金属离子的确定3 结论与讨论目前，应用较为广泛的细菌胶原酶是Clostridium histolyticum胶原酶，但该胶原酶不易完全分离纯化，且经常伴有毒素的产生。因此，开发出一种更具优势的细菌源胶原酶来替代Clostridium histolyticum胶原酶具有重要意义。产胶原酶的弧菌很多，Welton和Wood等就曾在皮毛中分离出1株耐盐、能产胶原酶的弧菌。针对气单胞菌产胶原酶的研究较为少见，笔者以前期筛选出的Aeromonas sp.F3为出发菌株，对其发酵条件进行优化，提高其产酶能力。Aeromonas sp.F3是一株活性较高的胶原酶产生菌，属于弧菌科的气单胞菌属。采用单因素试验法对其发酵条件及发酵培养基进行全面优化。经发酵条件优化，试验结果表明，该菌株最佳发酵条件为：培养时间24 h，温度40，初始pH为8，装瓶量80100 mL。采用此条件对Aeromonas sp.F3的发酵培养基组分进行优化，结果表明其发酵培养基最佳组分为：葡萄糖3 g/L，酵母浸粉9 g/L，NaCl 5 g/L，MnSO4 10 mg/L。经优化后，该菌株产酶活性相比优化之前提高了近2倍。本研究对Aeromonas sp.F3的发酵条件进行了初步探讨，因此试验中的酶液只是粗提产物，如果将发酵液中的胶原酶进行分离提纯，并对其酶解条件进一步优化，就会得到活力更高的胶原酶。本研究的最终目的是要找出一种高效安全的细菌源胶原酶，后期将对Aeromonas sp.F3胶原酶的安全性进行研究，并对该酶水解胶原蛋白的产物进行深入探讨。参考文献1郭恒斌,曾庆祝.酶法提取鱿鱼皮胶原蛋白工艺条件的研究J.南方水产,2008,4(1):58-63.2周爱梅,张培丽,刘欣,等.淡水鱼皮胶原蛋白提取优化工艺研究()J.食品与发酵工业,2007,33(1):113-117.3李二凤,何小维,罗志刚.胶原蛋白在食品中的应用J.食品与药品,2006,8(3):57-59.4吴耀松,廖艳阳,印大中.胶原蛋白在美容中的应用及皮肤衰老机制研究进展J.中华现代皮肤科学杂志,2004,1(3):219-223.5张慧君,罗仓学,张新申,等.胶原蛋白的应用J.皮革科学与工程,2003,13(6):37-41.6任俊莉,付丽红,邱化玉.胶原蛋白的应用及其发展前景(续)J.中国皮革,2004,33(1):36-38.7傅燕风,沈月新.