郑氏一号新伤药对大鼠跟腱腱病的防治及对力敏感因子表达的影响.doc

郑氏一号新伤药对大鼠跟腱腱病的防治及对力敏感因子表达的影响 成都体育学院硕士研究生学位论文成都体育学院硕士研究生学位论文题目郑氏一号新伤药对大鼠跟腱腱病的防治及对力敏感因子表达的影响培养单位运动医学与健康学院姓名柴菱学号xx100232一级学科体育学专业运动康复学研究方向中西医结合骨科运动康复的研究导师姓名胡毓诗教授2019年5月30日郑氏一号新伤药对大鼠跟腱腱病的防治及对力敏感因子表达的影响专业运动康复学研究生柴菱指导老师胡毓诗教授摘要目的通过观察实验过程中跟腱组织的形态学变化，研究郑氏一号新伤药对大鼠跟腱腱病模型的防治效果；通过测定力敏感因子机械生长因子（Mechano-GrowthFactor，MGF）和内皮型一氧化氮合酶（endothelium Nitric Oxide Synthase，eNOS）的表达，探索其在跟腱腱病发生发展过程中的变化及郑氏一号新伤药对其的影响。 方法将96只雄性SD大鼠随机分为对照组（Control，C）、敷药组（Medicine，M）、跳跃组（Jump，J）和跳跃敷药组（Jump-Medicine，JM），每组24只；并根据不同取材时间分为 4、 6、8周组，每组8只。 C组正常饮食喂养，M组正常饮食喂养并于第4周起外敷郑氏一号新伤药，J组适应性喂养结束后采用“电刺激跳跃法”造模，JM组除采用“电刺激跳跃法造模”外于第4周起外敷郑氏一号新伤药。 观察并记录大鼠一般情况指标，分别于第4周、第6周和第8周造模结束后24小时取跟腱组织，通过HE染色观察组织形态学变化，通过Western Blot法检测MGF及eNOS蛋白表达。 运用独立样本T检验和双因素方差分析方法对所得数据进行分析。 结果1.就跳跃能力而言，J组与JM组大鼠有效跳跃次数都呈现为下降趋势，第1周至第5周J组大鼠与JM组大鼠有效跳跃次数略有差别但未见显著差异（P0.05）；第6周至第8周J组大鼠有效跳跃次数明显少于JM组大鼠，存在显著差异（P0.05）。 2.就形态学观察而言，C组与M组腱纤维呈波浪状弯曲排列，纤维排列紧密，在第4周、第6周和第8周无明显变化。 J组第4周时可见腱纤维排列欠规则，少量纤维断裂，间隙轻度增大；第6周时腱纤维排列紊乱，部分纤维断裂，细胞核数量增多，局部可见炎性浸润和血管长入；第8周时腱纤维大面积断裂，间隙增大，细胞核数量明显增多，局部可见血管长入。 JM组第4周时腱纤维相对规整，偶有间隙轻度增大；第6周时局部腱纤维排列欠规则，少量纤维断裂；第8周时腱纤维排列紊乱，部分纤维断裂，局部可见少量炎性细胞。 3.就MGF蛋白表达而言，C组和M组表达在各阶段内无明显差异，J组表达呈上升趋势，JM组呈先下降后上升趋势；各阶段内J组MGF蛋白表达始终最高，其次是JM组；第4周时，各组间MGF蛋白表达均未见显著差异（P0.05）；第6周时，J组与其他各组均存在显著差异（P0.05），JM组与其他各组均存在显著差异（P0.05）；第8周时，对照组（C组、M组）与造模组（J组、JM组）均存在显著差异（P0.05），J组与JM组之间未见显著差异（P0.05）。 4.就eNOS蛋白表达而言，C组表达在各阶段无明显差异，M组和J组呈现上升趋势，JM组呈现下降趋势；各阶段内J组eNOS蛋白表达始终最高；第4周时，J组与C组、M组存在显著差异（P0.05），与JM组未见显著差异（P0.05），JM组与其他各组未见显著差异（P0.05）；第6周时，仅J组与C组存在显著差异（P0.05），其他各组均未见显著差异（P0.05）；第8周时，J组与其他各组均存在显著差异（P0.05），JM组仅与J组存在显著差异（P0.05）。 结论1.从形态学结果可知，郑氏一号新伤药对大鼠跟腱腱病具有防治效果；2.其防治效果可能通过抑制一氧化氮合酶异常升高以及一氧化氮过量合成而实现；3.主要表现为郑氏一号新伤药能够抑制在跟腱腱病的形成过程中呈现上升趋势的MGF表达；小范围上调eNOS表达，同时抑制其异常升高，使之维持在某一稳定水平。 该病发病部位多在四肢远端及关节处，如跟腱、髌腱、肱骨外上髁伸肌腱、冈上肌腱等2，其中又以跟腱腱病最为多见。 近年来，随着竞技体育和大众健身的兴起，跟腱腱病的发病率也与日俱增3。 目前学者们所认同的跟腱腱病发病机制4可以总结为以下三方面1.腱内发生微循环障碍而引起的腱的变性；2.对抗反复应力刺激而导致的腱的疲劳；3.腱内各种物质（如基质、因子、蛋白、酶等）的改变对腱的破坏。 但由于跟腱及其周围组织解剖结构的复杂性及其病变的多样性，跟腱腱病具体的或主导的病理生理机制尚未完全明确。 就目前而言，跟腱腱病的发病机制及其防治仍是运动医学研究领域的热点和难点问题5。 机械刺激与基因表达之间的联系是生理学研究中一个新的重要领域。 越来越多的证据表明6-9，胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factor-，IGF-）的表达与细胞对机械刺激的响应存在密切的关系。 机械生长因子（Mechano-Growth Factor，MGF）是IGF-的选择性剪切变异体，对力学刺激十分敏感10-11。 目前研究发现，MGF在多种组织、细胞（包括心脏、大脑、肌肉、成骨细胞、肌腱细胞和肿瘤细胞等）中均有表达，且在不同的组织、细胞中MGF的表达具有一定差异。 正常组织中MGF通常不表达或低表达，但当组织受到损伤或刺激时，MGF表达会迅速上调。 大量研究11-15显示，MGF在预防心肌损伤、治疗肌肉缺损、修复受损神经和促进骨修复等方面起着重要作用。 一氧化氮（Nitric Oxide，NO）作为一个极其不稳定的活泼气体自由基，最早的生物学效应被认为是促进血管舒张，而现在研究发现NO能够在不同组织中发挥多种生物学效应16。 虽然NO在胞外机械信号向胞内生化信号转换的过程中充当信号分子及效应分子，但其在体内半衰期短、代谢活跃，难以进行检测和调控，因此常常将一氧化氮合酶（Nitric OxideSynthase，NOS）作为检测指标。 NO由NOS催化合成，在哺乳动物体内存在三种不同形式的NOS，即神经型一氧化氮合酶（nNOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）1217。 每种NOS亚型的分布不同，其合成的NO所介导的生物学效应也不尽相同。 其中eNOS能够被机械剪切力诱导增强，内皮细胞在受到剪切应力等生理刺激后激活eNOS，并在数秒内合成释放NO，NO与GC反应使血管平滑肌舒张，抑制血小板的聚集和粘附18，促进毛细血管增生19。 郑氏一号新伤药由我院已故教授郑怀贤先生的郑氏一号新伤药改良加工而来，适用于闭合性软组织急性损伤，药品为棕黄色粉末，方含黄柏、延胡索、血通、血竭、白芷、羌活、独活、木香。 祖国医学认为，脉络受损则血溢脉外，瘀血阻滞，气道不通，不通则痛，并发肿胀。 本方具有消肿止痛、活血化瘀等功效，在临床实践中获得广泛认可。 综上所述，由于肌腱组织具有血供差、代谢弱等特点，因此受损的肌腱自愈能力很差。 如何促进损伤肌腱的修复、提高治疗质量并完全恢复其功能，仍然是临床上亟待解决的问题。 MGF作为一种对力极其敏感的生长因子，已经在许多损伤组织的修复与再生中发挥作用。 但是，MGF对损伤肌腱修复的影响还知之甚少。 eNOS能够被机械剪切力诱导，其产物内皮源性NO具有抗炎、抗凝和抗氧化等作用，但是在跟腱腱病发生发展过程中并不能明确其作用。 本研究将观察MGF和eNOS在大鼠跟腱腱病发生发展过程中的变化；并在此基础上，探讨郑氏一号新伤药对跟腱腱病大鼠跟腱组织中MGF及eNOS蛋白表达的影响，分析其对大鼠跟腱腱病的防治作用；为如何使临床上肌腱损伤的治疗方案更有效提供理论指导。 32文献综述2.1跟腱腱病概述2.1.1跟腱腱病的基本概念对于腱病的命名，曾经有过许多不同名称。 Mafulli等20提议用“肌腱腱病”来描述过度使用引起的腱内和腱周疾病。 这一名称也最终成为肌腱处疼痛、肿胀和功能障碍的综合征的总称。 肌腱腱病，常见发生部位包括跟腱、髌腱、肩袖、冈上肌腱、前臂伸肌腱以及肱骨外上髁伸肌总腱止点等，是较常出现且防治较困难的一类运动损伤2。 随着竞技体育和全民健身的开展与兴起，肌腱腱病的发病率也呈现出日益上升的趋势3。 有数据显示21-23，美国每年约有1440万人口出现肌腱或韧带损伤，消耗数十亿的医疗保健费用，而这其中又以跟腱腱病（AchillesTendinopathy）最为常见。 2.1.2跟腱的解剖结构跟腱的解剖学结构有两种构成方式，最常见的一种是腓肠肌与比目鱼肌各自的腱膜在距跟骨近端12cm处汇合形成跟腱。 另一种方式是腓肠肌腱膜从比目鱼肌腱膜上端插入形成跟腱。 跟腱的上部呈圆形，其远端4cm处相对平坦。 跟腱纤维并非垂直的，而是呈90螺旋24。 这种螺旋排列的结构可以增减跟腱的长度，在运动过程释放更大的能量25。 正常跟腱被视为白色、有弹性的纤维状圆形结构，该结构主要由肌腱细胞、肌腱干细胞和胶原纤维组成，肌腱细胞（成纤维细胞）和肌腱干细胞两种细胞占肌腱中细胞总成分的90-95%，其余5-10%为附着点的软骨细胞和滑膜腱鞘中的少数滑膜细胞26-27。 除胶原和细胞还存在着细胞外基质，而细胞外基质主要由糖胺聚糖、糖蛋白和蛋白聚糖组成，其高度的亲水性使肌腱具有较好的弹性28。 肌腱的细胞外基质稳定对肌腱抵抗机械力及肌腱损伤的修复具有重要作用，当基质的合成和降解平衡被打破后，可致使肌腱相关结构改变继而引起肌腱组织的退变。 42.1.3跟腱腱病的发病机制由于跟腱结构的复杂性以及其病理变化的多样性，使得众多学者对跟腱腱病的认识并未得到完全统一。 就目前而言，学者们所认同的跟腱腱病发病机制4可以总结为以下两个主要因素1.腱组织反复对抗应力刺激而导致的跟腱疲劳失代偿反应；2.微循环障碍，各种物质（如基质、蛋白、酶、代谢产物等）的改变、残留对跟腱的破坏。 这两种因素并不相互独立，而是共同作用并贯穿整个疾病过程。 肌腱能够适应性的改变强度和弹性，主要是通过胶原的合成以及基质金属蛋白酶的活性的调节，同时通过降低肌腱对应力的敏感性，能够表现出更高的抗负荷水平。 虽然适应性的改变可以增强肌腱的强度，但是这种适应性改变始终是有一定限度的，并且其需要充足的时间缓冲修复。 运动中肌腱反复承受巨大负荷，造成肌腱的过度使用损伤，随着时间的积累，当负荷超过了其所能承受的最大范围或是缓冲修复的时间过短时，就会出现失代偿反应，发生病理改变，最终导致跟腱腱病。 有研究发现29，腱病在超声检查时发现肌腱的轴向应变弹性比无症状腱病的表现的更硬，这表明其抗塑性变的能力下降。 长期超负荷工作情况下组织本身对营养和氧的需求就相对偏高，同时慢性损伤造成周围血管受损，如此一来易形成局部供血的相对不足，久而久之必然引起组织坏死、无菌性炎症等问题。 虽然激活的免疫系统可以吸收、清除这些坏死细胞，但是当机体得不到充分、及时的休息或治疗又再次超负荷使用时，这些便会成为病变的诱导因素。 而肌腱的老化则影响了肌腱的代谢功能与传递力量的力学性能，更容易发生微损伤，增加了退变的发生率。 Tuite等人30报道，肌腱细胞的衰老会导致肌腱组织整体的抗拉伸性能降低，血流量以及脂质的形成增加的退化。 除以上因素外，多种通路、细胞凋亡等也与腱病的发病密切相关，但目前尚不清楚各因素之间的关系以及在跟腱腱病过程中是如何相互影响、相互协同的。 2.1.4跟腱腱病的病理表现目前对跟腱腱病的主要病理变化已基本达成共识。 肌腱腱病的病理组织学是存在退行性改变，主要包括胶原纤维排列紊乱、新5生血管形成和细胞外基质增加等。 肉眼下观察，病变腱与健康腱的白色外观相反，显示为灰色或黄褐色。 在光镜下观察可见，腱组织的胶原纤维连续性中断，胶原纤维束结构松散，间隙增大，或出现粘液样变性、玻璃样变，病变组织中细胞外基质和细胞成份增加，肌腱细胞梭形结构消失，细胞核变圆，有血管新生或再生，潮线上移或钙化31。 偏光显微镜下观察可见，正常胶原呈黄色反光，而腱病组织的胶原呈绿色且无光泽32。 电镜下表现为，粘液样变、玻璃样变、脂肪样变、纤维素样变、钙化、纤维软骨样和骨样化生。 以上病理改变可能同时出现，也可能单一存在，不排除与解剖部位及损伤性质有关33。 至于腱病是否涉及炎性反应，还存在一定争议。 部分学者对腱病标本进行病理检查时，未发现任何炎症现象；部分学者报道，在腱病标本中并不存在炎症细胞，仅在腱围组织中存在少量；另有部分学者则认为腱病可能是由正常腱组织经历过早期短暂的疼痛性肌腱炎或腱围炎发展演变而来，之所以未检测出炎症细胞是因为已经度过了炎症期。 2.1.5跟腱腱病的防治手段跟腱腱病所引起的局部疼痛，严重影响了肌肉组织的活动能力，导致机体的运动能力下降；而其难治愈、易复发的特点也一直困扰着运动医学工作者。 归根结底腱病主要还是腱受到反复牵拉而导致的慢性损伤，因此在预防腱病时需要着重考虑如何合理的安排运动方式和运动强度。 加强身体素质和协调性的训练、运动间隔中适当的休息以及损伤后必要的措施都能够有效地防止、减缓腱病的发生发展34-35。 早在1997年，Sandmeirer36等指出，目前提出并用于腱病的治疗方案，大部分科学依据不足。 为进一步寻求有效且符合循证医学的治疗手段，降低腱病的复发率，大批学者进行了大量的研究探索，就目前的专著叙述可概括为非手术治疗和手术治疗两大方案。 针对腱病的治疗手段，国内外都偏向于保守治疗，也就是依靠传统中医治疗、物理治疗和化学治疗等方法。 传统中医治疗腱病主要包括针刺和推拿。 史清钊37-40团队与李凤素41均倡导6温热与针刺双重作用叠加能够起到修复末端区组织与促进末端病恢复的效果。 推拿在运动医学中的应用极为广泛，具有缓解疲劳、活血化瘀和消炎镇痛等功效。 推拿操作简单易行，在临床治疗中为与肌腱结构相匹配，抱揉肩袖、弹拨肱二头肌长头腱、刮髌周、提弹跟腱等特殊手法应运而生42。 作为非入侵性治疗手段的代表，物理治疗是腱病患者更愿意选择的一种治疗方法，常见的有体外冲击波疗法、低功率激光疗法和运动疗法等。 体外冲击波疗法（Extracorporeal ShockWave Therapy，ESWT）是临床上较为常见的一种脉冲波，利用其所兼具的声、光、力学特性，通过直接机械冲击效应以及空化作用产生的间接机械效应达到治疗目的43。 Galasso44和Vulpiani45等分别从短期和长期疗效入手，均证实ESWT对腱病具有治疗效果，且针对长期性、顽固性腱病的治疗效果更好。 低功率激光疗法（Low-Level LaserTherapy，LLLT）能够产生光化学效应，并且不引起组织温度升高。 沈勇伟46和Iacopetti47等分别使用末端病大鼠和末端病羊模型探索LLLT对末端病的治疗效果，发现将LLLT能量控制在合理范围内能够有效促进末端区组织修复。 许多文献报道48-49，离心运动是治疗腱病积极、有效的手段。 Knoblo50和Dimitrios51的研究均支持这一说法，在离心运动过程中并未出现末端区结构的损伤。 而Horstmann52等对腱病患者进行全身震动训练和离心训练疗效比对后，认为全身震动训练能够使患者更好的参与治疗且疼痛症状改善效果优于离心训练。 运动医学中化学治疗方法的使用不占少数且常获得较好的效果，因此也备受关注。 目前应用于腱病治疗较多的是富血小板血浆和透明质酸。 富血小板血浆（Platelet-Rich Plasma，PRP）富含高浓度血小板，能够通过分泌血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等多种细胞生长因子起到调节作用，以达到治疗腱病的效果53。 Guelfi54和Filardo55等对多名跟腱腱病患者进行PRP注射治疗后，认为该方法是安全有效的。 透明质酸能够为人体提供多种生理作用，现有的文献均认可其对末端病具有治疗效果。 Mua56和Merolla57等将透明质酸分别使用注射和超声导入的方法使其作用于腱病患者患病部位，并一致认为透明质酸的短期疗效较明显。 国外主张对非手术治疗6-9个月仍然无效的病例进行手术治疗58。 手术方式较多，包括肉眼可见的病变组织清除、肉眼可见的缺损修补、纵向腱切开、腱远7端重排列术等，手术治疗遵循的原则均为切除坏死组织和减压59。 在跟腱腱病的防治手段中，虽然方法众多但也各自存在利弊，随着人们对腱病发病机制研究的不断深入，防治手段也在进一步探索，为该病的预防和治疗不懈努力着。 2.1.6腱病模型的建立国内外早期报道了三种腱病动物模型的造模方法，最早是被动牵拉法，然后是高压电击跳跃法，以及腓肠肌电刺激法。 于长隆30等人按照被动牵拉原理设计了对家兔跟腱被动牵拉以建立损伤模型的办法，这也是最早的造模手段，但是这种方法不能准确定量描述所施加的负荷，重复性较差。 刘波60采用高压电、低电流刺激被造模动物，每天剧烈跑跳360次，3周时提示造模成功，发现明显病理改变，但这种方法也存在缺点，成本较高、危险较大且动物可控性差，无法精确量化运动量。 Messner61等采用电极刺激动物腓肠肌，该方法使用力学传感器记录收缩力强度，解决了之前无法定量负荷的问题，但被造模动物的固定比较困难且一次性造模数量相对偏少。 姚小卫62、扈盛63等在以上三种动物模型的基础下，设计了电击跳跃法，并证实了其可靠性。 该造模方法中的电刺激装置（如图1所示）为自制的一个长90cm、宽40cm、高75cm且顶部无遮盖并用光滑铁皮封闭四周的长方体，底部是串联在一起的间隔铜棒，铜棒与铁皮之间做绝缘处理（图1中虚线部分）。 在造模装置底部通电，使每两个间隔铜棒间存在电压，大鼠为躲避电流刺激而被迫向上跳跃，双足离开铜棒即为有效跳跃。 8图1自制电刺激装置使用该造模装置对造模组大鼠进行通电，每15s通电一次，持续进行20min，休息10min后再次以同样方式通电20min，每天一次，每周六次。 在造模三周时大鼠跟腱末端区有不明显的病理性变化，4-12周时大部分大鼠出现典型的末端病病理变化，其中8周时大鼠跟腱末端区的病理变化较为一致，造模成功率较高。 2.2机械生长因子概述2.2.1机械生长因子的结构机械生长因子（Mechano-GrowthFactor，MGF）是胰岛素样生长因子（Insulin-like GrowthFactor，IGF-）的选择性剪切异构体64-65，也被称为力生长因子。 IGF-是由70个氨基酸残基所组成的单链多肽66，具有内分泌、自分泌和旁分泌特性。 在人类和啮齿动物中，IGF-基因是由6个外显子组成、跨度大于90kb的染色质DNA。 外显子1和2是选择性转录的起始序列，他们含有不同的启动子，编码不同转录起始位点的选择性前导序列；外显子3编码一部分信号肽和IGF-多肽的N端；外显子4编码IGF-多肽的C端和一部分E肽；外显子5和6选择性剪切编码E肽的另一部分（如图2所示）。 由于物种之间的差异，在人体中IGF-基因能够产生IGF-Ea、IGF-Eb和IGF-Ec三种亚型，而在啮齿动物中只产生IGF-Ea和IGF-Eb两种亚型；其中人类的IGF-Ec和啮齿动物的IGF-Eb被称为MGF。 9图2IGF-基因的选择性剪切2.2.2机械生长因子的研究现状研究发现67-70，MGF在多种细胞、组织中均有表达，且在不同细胞、组织中MGF的作用也各不相同。 在细胞水平，MGF在成骨细胞、成肌细胞、成纤维细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞和平滑肌细胞等均有表达；在组织水平，MGF在骨骼、骨骼肌、心血管、脑和跟腱等有所表达。 而MGF的表达主要受机械刺激和组织损伤的影响，一般在细胞经历拉伸、过载、损伤等刺激后发生显著上调6。 Goldspink课题组经过一系列研究71-74后认为，MGF具有促进成肌细胞增殖、激活卫星细胞、保护神经元及抑制细胞凋亡等作用。 Davies75等将包含MGF cDNA的质粒注射至小鼠胫骨前肌中，2周内肌肉质量增加了20%；而注射系统型IGF-cDNA后同等质量的肌肉增长则需要4个月以上。 Wirth76等在大鼠肌腱超负荷实验中发现，过载负荷后MGF表达明显上调，肌纤维横截面面积增大的同时骨骼肌质量也有所增加。 实验表明，肌肉细胞的维持受制于骨骼肌卫星细胞。 人们进行相关研究后于xx年首次指出，MGF之所以能够有效促进肌肉增长和修复受损肌肉，主要原因可能在于其直接参与激活骨骼肌卫星细胞。 MGF稳定转染细胞实验77表明，MGF与IGF-一样具有促进成肌细胞增殖的作用，不同的是MGF抑制其分化。 有研究68，78-79认为MGF只能激活MAPK/Erkl/2通路，而对PI3K/AKT通路无影响，可能正是这个原因导致了MGF与IGF-作用上的差异。 Aperghis13等研究发现，MGF在大鼠面神经损伤后能发挥保护神经元的作用，10经MGF处理的大鼠面部运动神经元存活率高达88%。 Riddoch80等对患有肌萎缩性脊髓侧索硬化症的SOD1鼠注射MGF后发现，鼠的肌肉量和肌肉强度的丢失均有所缓解。 另有研究15表明，MGF对帕金森病的神经保护具有积极作用。 研究68还发现，内源性MGF能够有效阻止氧化应激、NMDA诱导的兴奋性中毒以及自由基损伤导致的海马神经元退化。 当心脏受损的羊接受MGF治疗后，梗死区域得到控制，心肌功能恢复81，达到降低永久缺血损伤面积和增加存活面积的效果。 当急性或慢性心肌缺血时，利用小渗透性泵导入MGF，能够保护心脏的收缩功能，并阻止心肌细胞病理性的过度生长和凋亡82。 就当前所有资料显示，MGF诱导骨骼肌肥大、促进骨骼及骨骼肌修复、保护神经元和预防心肌损伤等作用已被认可，也充分证明MGF是可以作为组织修复因子参与机体修复的。 但MGF是否对损伤的肌腱同样具有修复作用，尚不清楚。 2.3内皮型一氧化氮合酶概述2.3.1内皮型一氧化氮合酶的结构一氧化氮合酶（Nitric OxideSynthase，NOS）由两个同源单体所组成，两种酶融合成一个单体，C-末端为细胞色素还原酶83，其结构与细胞色素P-450还原酶（Cytochrome P-450Reductase，CPR）相似，在形成一氧化氮（NitricOxide，NO）过程中表现出P-450的光谱特性84。 哺乳动物体内存在三种均以二聚体形式存在的NOS，即神经型一氧化氮合酶（nNOS），单体分子量为150-160kDa；内皮型一氧化氮合酶（eNOS），单体分子量为133kDa；以及诱导型一氧化氮合酶（iNOS），单体分子量为130kDa85。 11图3一氧化氮合酶DNA分子结构2.3.2内皮型一氧化氮合酶的研究现状eNOS位于内皮细胞的细胞膜上，是一种膜结合型蛋白，基础活性较低。 eNOS能够被多种刺激所调控，催化产生NO。 NO最早的生物学效应被认为是促进血管舒张16。 近年来研究86-88表明，其具有调节血管紧张性、抑制血管平滑肌细胞增殖以及抑制血小板凝聚等作用。 此外，NO还在胞外机械信号向胞内生化信号转换的过程中充当信号分子及效应分子89。 但NO的半衰期很短，性质活泼、极不稳定。 内皮型一氧化氮合酶的生物学活性受到多种因素调节。 血流动力学改变所产生的剪切应力，会使eNOS活性增强、表达升高90；肿瘤坏死因子（TNFct）可刺激eNOS活性增加，促NO生成91；低密度脂蛋白（LDL）对其也有一定影响。 扈盛92等发现在跟腱末端病大鼠的跟腱、跟骨、纤维软骨、腱围及腱骨关节面均发现eNOS大量表达。 该结果与黎明93等的研究结果保持一致。 一系列研究94-96表明，骨、骨骼肌等多种组织细胞在机械应力刺激下都能够上调eNOS的表达。 Chen97等则认为当组织缺血缺氧后，机体将通过上调eNOS的表达以刺激内皮源性NO合成，从而介导局部毛细血管新生，建立新的侧支循环。 Murrell98等人对跟腱炎术后患者进行研究发现，跟腱治愈过程中NOS活性增加，且eNOS在一周后达到最高峰，提示eNOS的表达增加可能促进了腱及其周围血管的增生。 一氧化氮合酶/一氧化氮与腱病密切相关，但eNOS在其发生发展过程如何变化，以及是否同时参与损伤和修复仍不能明确。 123研究对象与方法3.1研究对象3.1.1实验对象选用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠96只，8周龄，体重194.325.87克，购自成都达硕生物科技有限公司，批号为SCXK（川）xx-030。 3.1.2动物饲养将96只雄性SD大鼠按照分组情况分成24笼（每笼4只），在成都体育学院动物实验室（SPF级，室内温度20-26，相对湿度40-70%，通风良好）内自由饮食饮水，以国家标准啮齿类动物固体混合饲料进行喂养，每日更换清洁饮用水，每日清洁大鼠排泄物。 3.2造模与干预3.2.1实验分组表1实验分组96只雄性SD大鼠适应性喂养一周后使用随机数字表法分为安静对照组（Control，C）、单纯跳跃组（Jump，J）、单纯敷药组（Medicine，M）和跳跃敷药组（Jump-Medicine，JM），每组24只平均分为6笼，分别标记为4周笼（C 4、J 4、M 4、JM4）、6周笼（C 6、J 6、M 6、JM6）以及8周笼（C 8、J 8、M 8、JM8）。 取材时间组别4周6周8周安静对照组（C）C4C6C8单纯跳跃组（J）J4J6J8单纯敷药组（M）M4M6M8跳跃敷药组（JM）JM4JM6JM813详见表1。 3.2.2造模装置构建本实验根据相关文献资料所报道的实验方法，参阅“电击跳跃法”自制电刺激造模装置（如图4所示）。 图4电刺激造模装置虚线区域为透明光滑硬质塑料所围成的长方体（长70cm、宽70cm、高80cm），顶部无遮盖，内部均分为九宫格且相互之间用透明光滑硬质塑料隔开（如图4所示）。 基座选择在绝缘胶板上平行穿绕粗铜丝，使铜丝串联，每两相邻的铜丝间存在电压（如图5所示）。 图5大鼠跳跃分隔箱与跳跃电刺激基座3.2.3干预方案C组正常饮食喂养，M组正常饮食喂养并于第4周起外敷郑氏一号新伤药，14J组适应性喂养结束后即采用“电刺激跳跃法”造模，JM组除采用“电刺激跳跃法造模”外于第4周起外敷郑氏一号新伤药。 J组和JM组大鼠适应性喂养结束后放入造模装置中行电刺激法造模，每15s通电一次，通电时间为3s，如此间断反复进行20min，每天1次，每周6次，共进行8周。 通电电压由小逐步增大，直至大鼠出现有效跳跃，实验早期阶段大鼠体重较轻，一般在50-60V即可出现有效跳跃，随大鼠生长电压也需逐步增加才能够出现有效跳跃，个别情况下可达到70-90V。 造模同时给予各组大鼠充足的水和纯鼠料喂养。 造模过程中，观察大鼠的体征变化，每次造模时记录有效跳跃次数。 郑氏一号新伤药(性状棕黄色粉末)外用，用温水调成糊状，药物与水的比例为10g:10ml，涂敷于纱布后敷于患处，覆盖面积为10mm5mm，厚度为1mm，12h后取下，如敷药处出现红斑、皮损等，立即停用。 敷药过程中，将大鼠固定于圆柱形玻璃瓶（长20cm，前窄后宽，底部及双侧斜上方各开直径5mm小孔6-8处）中，大鼠在玻璃瓶中无法转身触碰后脚；玻璃瓶瓶身下方前后各设两个固定支架，以防滚动。 3.2.4一般情况观察观察试验过程中大鼠的