腺病毒质量检定方法.doc

一、无菌检查2（一）薄膜过滤法3（二）直接接种法3二、支原体检查4第一法 细胞培养法4第二法 指示细胞培养法（DNA染色法）5三、细胞内、外源病毒因子检查71 细胞形态观察及红细胞吸附试验（简称血吸附试验）72 不同细胞传代培养法检测病毒因子73 接种动物和鸡胚法检测病毒因子84 逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测81）逆转录酶活性测定82）透射电镜检查113）感染性试验115 特殊外源病毒因子的检测11四、致瘤性检查11五、感染效率和病毒的产量等的测定12六、细胞鉴别（染色体检查）12七、病毒敏感性检查13八、细胞功能检查13九、重组腺病毒滴度的测定14十、病毒比滴度（比活性IU）测定16十一、E1A区、E2B区、AAV及插入基因的检测16一）E1A区的检测16二）E2B区的检测17三）AAV的检测18四）插入基因的检测18十二、病毒外源因子检查19十三、内毒素测定19供试品溶液的制备19确定最大有效稀释倍数（MVD）20方法1 凝胶法20鲎试剂灵敏度复核试验21干扰试验21检查法23十四 效力试验插入基因表达活性测定，插入基因的生物学活性测定24十五 复制型病毒（RCA）检测 A549细胞检测法24十六 腺相关病毒的检测采用PCR法26十七 残留量测定应根据生产工艺及成品的添加成份，对有潜在危险性的成份进行残留量检测：271残余宿主DNA含量测定272残余牛血清白蛋白含量测定273残余核酸酶含量测定28十八 重组病毒制品的稳定性试验28一、无菌检查药典（2010版第三部）附录A无菌检查法 试验材料1、细胞培养上清液2、硫乙醇酸盐流体培养基酪胨（胰酶水解） 15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸 0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml 硫乙醇酸钠（或硫乙醇酸） 0.5g (0.3ml）琼脂 0.75g 水 1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.10.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）后，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。3、改良马丁培养基胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁 0.5g 葡萄糖 20.0g 水 1000ml除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约为6.8，煮沸；加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.40.2，分装，灭菌。4、营养琼脂培养基琼脂 14.0g 胨 10.0g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水1000ml 取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调pH值使灭菌后为7.20.2，分装，灭菌。5、改良马丁琼脂培养基按改良马丁培养基的处方和制法，加入14.0g琼脂，调pH值使灭菌后为6.40.2，分装，灭菌。6、封闭式薄膜过滤器，滤膜孔径应不大于0.45um，直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。 试验步骤（一）薄膜过滤法：1、将少量的冲洗液过滤，以润湿滤膜。2、取规定量，每支（瓶）供试品装量为5ml或以下者，全部转移至含适宜稀释液100ml的无菌容器内，混匀，立即过滤；每支（瓶）供试品装量为5ml以上者直接过滤。或全部转移至含适宜稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于3次，冲洗量100ml、总冲洗量不超过1000ml。冲洗后，2个滤器中加入硫乙醇酸盐流体培养基各100ml，另一滤器中加入改良马丁培养基100ml。3、细菌置30-35、真菌置20-25培养14天，培养期间逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无菌生长，可取该培养基适量转接种同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基中及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长；或取培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时做菌种鉴定。（二）直接接种法：1、取规定量供试品，等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中（2种培养基的接种支数或瓶数之比为2:1）。除有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积，不得大于培养基体积的10%，同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。2、将上述接种后的硫乙醇酸盐流体培养基平均分成两份，一份置30-35培养14天；另一份与接种后的改良马丁培养基置20-25培养14天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无菌生长，可取该培养液适量接种至同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长；或取培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时做菌种鉴定。 结果判定阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判断供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判断供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少1个条件时方可判试验无效：1、无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。2、回顾无菌检查过程，发现有可能引起微生物污染的因素。3、供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试前，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判断供试品不符合规定。二、支原体检查药典（2010版第三部）附录B支原体检查法第一法 细胞培养法 试验材料1、支原体肉汤培养基猪胃消化液 500ml 氯化钠 2.5g 牛肉浸液（1:2） 500ml 葡萄糖 5.0g 酵母浸粉 5.0g 酚红 0.02g pH值为7.60.2，于121灭菌15分钟。2、精氨酸支原体肉汤培养基猪胃消化液 500ml 氯化钠 2.5g 牛肉浸液（1:2） 500ml L-精氨酸 2.0g 葡萄糖 1.0g 酵母浸粉 5.0g 酚红 0.02g pH值为7.10.2，于121灭菌15分钟。3、支原体半流体培养基按1项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5-3.0g。4、支原体琼脂培养基按1项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0-15.0g。 试验步骤1、供试品如在分装后24小时以内进行支原体检查可贮存于2-8；超过24小时应置于-20一下贮存。2、检查支原体采用支原体半流体培养基和支原体肉汤培养基（或支原体琼脂培养基）。支原体半流体培养基（琼脂培养基）在使用前应煮沸10-15分钟，冷却至56左右，然后加入灭能新生牛血清（培养基与血清体积比8:2），并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补上述成分。取每支装量为10ml的支原体半流体培养基（已冷却至361）和支原体肉汤培养基各4支，每支培养基接种供试品0.5-1.0ml，置361培养21天。于接种后的第7天从4支中取2支进行次代培养，每1支培养基转种支原体半流体培养基及支原体肉汤培养基各2支，置361培养21天，每隔3天观察1次。 结果判定培养结束时，如接种供试品的培养基均无支原体生长，则供试品判为合格；如疑有支原体生长，可取加倍量供试品复试，如无支原体生长，供试品判为合格，如仍有支原体生长，则供试品判为不合格。第二法 指示细胞培养法（DNA染色法） 试验材料1、试剂：（1）二苯甲酰胺荧光染料浓缩液 称取二苯甲酰胺荧光染料5mg，加入100ml不含酚红和碳酸氢钠的Hanks平衡盐溶液中，室温下用磁力搅拌器搅拌30-40分钟，使完全溶解，-20避光保存。（2）二苯甲酰胺荧光染料工作液 无酚红和碳酸氢钠的Hanks溶液100ml中加入二苯甲酰胺荧光染料浓缩液1ml，混匀。（3）固定液 醋酸：甲醇（体积比1:3）混合溶液。（4）封片液 量取0.1mol/L枸橼酸溶液22.2ml、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液27.8ml、甘油50.0ml，混匀，调pH值至5.5。2、培养基及指示细胞：（1）DMEM完全培养基。（2）DMEM无抗生素培养基。（3）指示细胞（已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞） 取培养的Vero细胞经消化后，制成每1ml含105的细胞悬液，以每孔0.5ml接种6孔细胞培养板或其他容器，每孔再加无抗生素培养基3ml，于361、5%二氧化碳条件下培养过夜，备用。供试品处理：（1）细胞培养物 将供试品经无抗生素培养液至少传1代，然后取细胞已长满的且3天未换液的细胞培养上清液待检。（2）毒种悬液 如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时，应用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。（3）其他供试品 检查时所选用的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细胞。 试验步骤1、备好的指示细胞培养板中加入供试品（细胞培养上清液）2ml（毒种或其他供试品至少1ml），于361、5%二氧化碳条件下培养3-5天。指示细胞培养物至少传代1次，末次传代培养用含盖玻片的6孔培养板培养3-5天后，吸出培养孔中的培养液，加入固定液5ml，放置5分钟，吸出固定液，再加5ml固定液固定10分钟，吸出固定液，使盖玻片在空气中干燥，加二苯甲酰胺荧光染料（或其他DNA染料）工作液5ml，加盖，室温放置30分钟，吸出染液，每孔用水5ml，冲洗3次，吸出水，盖玻片于空气中干燥，取洁净载玻片加封片液1滴，分别将盖玻片面朝下盖在封片液上制成封片。用荧光显微镜观察。2、用无抗生素培养基2ml替代供试品，同法操作，作为阴性对照。3、用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品，同法操作，作为阳对照。 结果判定（1） 阴性对照 仅见指示细胞的细胞核呈现黄绿色荧光。（2） 阳性对照 荧光显微镜下除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。当阴性及阳性对照结果均成立时，试验有效。如供试品为阴性，则供试品判为合格；如供试品为阳性或可疑时，应进行重试；如供试品仍为阳性时，供试品判为不合格。三、细胞内、外源病毒因子检查：应根据细胞的种属来源、组织来源及细胞特性决定1 细胞形态观察及红细胞吸附试验（简称血吸附试验）取混合瓶细胞样品，接种至少6个细胞培养瓶或培养皿，待细胞长成单层后换维持液，持续培养2周。如有必要，可适当换液逐日镜检细胞，细胞应保持正常形态特征。如为贴壁细胞或半贴壁细胞，细胞至少培养14天后，分别取1/3细胞培养瓶或培养皿，用0.2%-0.5%豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验。加入红细胞后置2-8作用30分钟，然后置20-25作用30分钟，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况，结果应为阴性。（新鲜红细胞在2-8保存不得超过7天，且溶液中不应含有钙和镁离子。）2 不同细胞传代培养法检测病毒因子将待检细胞分别接种下列三种单层细胞，包括猴源细胞、人二倍体细胞和同种属同组织类型来源但不同批的细胞。每种单层细胞接种至少含107个活细胞或含原细胞培养液的细胞裂解物，接种量应占维持液的1/4以上，每种细胞至少接种2瓶，取培养7天的细胞各一瓶，取上清液分别接种于同种细胞培养，盲传一代，与初次接种的另一瓶细胞继续培养7天，观察细胞病变并进行细胞形态观察及血吸附试验。每种接种的细胞不得出现细胞病变，血吸附试验均应为阴性。试验应设立病毒阴性对照，包括可观察细胞病变的病毒阴性对照及血吸附阳性对照。如细胞裂解物对单层细胞有干扰，则应排除干扰因素。若待检细胞已知可支持人巨细胞病毒（CMV）的生长，则应在接种人二倍体细胞后至少观察28天，应无细胞病变。同时，应进行血吸附病毒检测，应为阴性。3 接种动物和鸡胚法检测病毒因子 MCB或WCB细胞以及增殖到或超过生产用限定代次的细胞，须采用动物体内接种法进行外源病毒因子检测，须采用动物体内接种法进行外源病毒因子检测。选用乳鼠、成鼠和鸡胚（两组不同日龄）共计4组，按表所列方法进行试验和观察。观察期间，如被接种动物出现异常或疾病应进行原因分析。观察到期时，应至少有80%以上接种动物或鸡胚健存，视为试验有效。接种动物未显示有外源病毒感染，则细胞判定为合格。 对于新建细胞系/株，还应接种豚鼠和家兔（表2）。豚鼠主要用于检查细胞内结核分枝杆菌，在注射前观察4周，结核菌素试验为阴性者方可用于试验。家兔主要用于检测猴来源细胞中是否存在B病毒污染，也可用兔肾细胞培养法代替。4 逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测可采用下列方法对MCB细胞或WCB细胞以及增殖到或超过生产用限定代次的细胞进行逆转录病毒的检测。1）逆转录酶活性测定：采用敏感的方法，如产物增强的逆转录酶活性测定法 试验材料1、试剂（1）供试品稀释液（A液） 每1L A液含三烃基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl，pH7.5）25mmol，四甲基乙二胺（EDTA）0.25mmol，TritonX-100 25ml，甘油500ml。（2）供试品保存液（B液） 每1L A液含1mg亮抑蛋白酶肽、0.7mg抑胃肽及1mg抑蛋白酶肽。（3）引物及探针序列上游引物：5-Biotin-CGTGGTTGACACGCAGACCTCTTAC-3下游引物：5-TCAACACTGTACGGCACCCGCATTC-3探针：5-NH2ATTATCTGGCCTTTGAGAGTTACTCTTTG-3（4）模板 雀麦草花叶病毒RNA（BMV RNA）（5）反转录缓冲液 每1L反转录缓冲液含Tris-HCl（pH8.3）50mmol，氯化钾40mmol，氯化镁6mmol，DTT10mmol，脱氧核糖核苷酸200umol,下游引物0.810-3mmol。（6）扩增缓冲液 每1L扩增缓冲液含Tris-HCl（pH8.8）25mmol，氯化钾40mmol，氯化镁2mmol，脱氧腺嘌呤核糖核苷酸200umol，脱氧胞嘧啶核糖核苷酸200umol，脱氧鸟嘌呤核糖核苷酸200umol及脱氧尿嘧啶核糖核苷酸200umol，上、下游引物各0.410-3mmol，核糖核酸酶A 0.8g，Taq DNA聚合酶6104U，尿嘧啶N-糖基化酶（UNG）4104U。（7）封闭液 含3%牛血清白蛋白或0.5%酪蛋白的包被液。（8）变性缓冲液 含5mmol/L EDTA的0.2mol/L氢氧化钠溶液。（9）包被液 0.05mmol/L磷酸氢二钠溶液-1mmol/L EDTA（pH8.5）。2、供试品、阳性对照及灵敏度供试品的制备（1）取供试品200ul，每分钟5000转离心5分钟，取上清液100ul，加入B液100ul和焦炭酸二乙醇（DEPC）处理的5% TritonX-100 2ul，混匀后，置冰浴15分钟后，置-70保存备用。（2）阳性对照 用SP2/0细胞培养上清液作阳性对照，同上处理后，按单次使用量分装，-70保存备用。（3）灵敏度供试品 取鼠源白血病病毒逆转录酶（MMLV）用A液进行系列稀释至10-8U/ul，充分混匀，按单次使用量分装，-70保存备用。 试验步骤1、反转录将已处理的供试品及阳性对照用A液10稀释。反转录反应管中加入反转录缓冲液20.8ul，500mg/L BMV-RNA 0.2ul，混匀后，标记，70放置10分钟，置冰浴。在相应的反转录反应管中分别加入4ul一稀释的供试品、阳性对照及灵敏度供试品，以A液作阴性对照。反转录反应体系为25ul。37反应90分钟。2、PCR扩增取反转录产物5ul加至PCR扩增缓冲液20ul中，PCR扩增反应体系为25ul。混匀后，按下列条件进行扩增：3730分钟，预变性945分钟，9445秒，5645秒，7245秒，进行35个循环，72延伸5分钟。3、杂交检测 用经包被液适当稀释的探针100ul包被DNA结合板，4过夜；次日，用封闭液200ul于37封闭60分钟，用洗涤液洗涤3次，备用；扩增结束后，每个反应管中加入变性缓冲液25ul，混匀；在封闭洗涤后的包被板上每孔加入供试品25ul，再加入杂交液100ul，混匀后，37反应60分钟，用洗涤液洗涤5次；每孔中加入链亲和素标记的辣根过氧化物酶100ul，37反应30分钟；同上洗涤5次；每孔加入显色液100ul，37显色10分钟；每孔加入终止液100ul终止反应。以630nm为参考波长，在波长492nm处测定吸光度。 结果判定Cutoff值为阴性对照的吸光度值加0.2。阴性对照吸光度值应不高于0.2，如小于0.05按0.05计。阳性对照应为阳性，且吸光度值应不低于1.5。灵敏度供试品应为阳性，且吸光度值应不低于0.8。供试品吸光度值大于Cutoff值者为阳性。注意事项（1）如供试品为培养细胞，则将细胞传代后，培养3-4天长成单层，取上清液检测，取供试品前不得换液。（2）试验中所有试剂及吸头均需灭菌。与RNA操作有关的试剂及材料均需经过DEPC处理。（3）加供试品区、扩增区及PCR产物检测区及其所用加样枪及服装应严格区分。（4）定期对各区进行消毒，PCR产物及其加供试品吸头应及时进行有效处理。2）透射电镜检查：取至少1107个活细胞进行透射电镜观察。3）感染性试验：将待检细胞感染逆转录病毒敏感细胞，培养后检测。根据待检细胞的种属来源，须使用不同的敏感细胞进行感染性试验。上述三种方法具有不同的检测特性，因此应采用不同的方法联合检测。若逆转录酶活性检测阳性，应进行透射电镜检查及感染性试验，以确证是否有感染性逆转录病毒颗粒存在。5 特殊外源病毒因子的检测 应对MCB或WCB的细胞进行特殊病毒的检测。检测病毒的种类根据细胞系/株种属、组织来源等确定。人源的细胞株、系，应检测如人鼻咽喉癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些情况下，也可能进行转化病毒的检测，如人乳头瘤病毒、腺病毒、及人单纯疱疹病毒，这些病毒的检测可采用适当的体外检测技术。四、致瘤性检查：人上皮细胞系、人二倍体细胞株及所有用于活病毒产品生产的细胞系、株应进行致瘤性检查。下面两种肿瘤性试验方法可任选其一：（1）裸鼠至少10只，用适量无血清培养基制备浓度每1ml含5107个细胞的待检细胞悬液，每只裸鼠皮下或肌内注射0.2ml；同时用Hela或Hep-2细胞设立阳性对照，阳性对照组至少10只，每只注射0.2ml含106个细胞；可用人二倍体细胞作为阴性对照，阴性对照组至少10只，每只注射0.2ml含107个细胞.（2）新生小鼠（3-5日龄），8-10g小鼠10只，在出生后0天、2天、7天和14天，分别用0.1ml抗胸腺血清（ATS）或球蛋白处理，然后同上每只皮下接种107个细胞。并设立阳性对照组，对照组至少接种10只。 结果判定： 定期观察并触摸注射部位有无结节形成，且形成的任何结节均应进行双向测量并记录。 阳性对照组应至少有9只进行性肿瘤生长时，试验视为有效。 如试验组动物有进行性肿瘤生长的结节或可疑病灶，应继续观察至少1-2周；若出现的结节在观察期内开始消退，则应在结节完全消退前，处死动物并进行解剖，做病理及组织学检查。 未发生结节的动物，半数应观察21天，剖检，另外半数应观察12周，进行病理检查，剖检接种部位，观察各淋巴结合各器官有无结节形成，如有怀疑，进行病理组织检查，不应有转移瘤形成。除上述体内法外，也可采用软琼脂克隆形成试验或器官培养试验等体外法检测，特别适用于低代次时动物体内无致瘤性的传代细胞系。五、感染效率和病毒的产量等的测定重组腺病毒Ad-F、Ad-P和Ad-FP的HPLC纯度分析11用Waters Biosuite Q 10m AXC柱(1ml)，流动相A（50mMTrisCl 1mMMgCL2 pH 8.0)；B(50mMTrisCl，1M NaCl，1mM MgCl2，pH 8.0)）梯度洗脱，检测波长为260nm。取本品溶液400l，用A稀释至500l注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算其纯度。六、细胞鉴别（染色体检查）1、染色体检查新细胞建株过程中，每8-12世代应做一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少应有4次染色体检查结果。每次染色体检查，应至少随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查，并做记录以备复查。其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，做出核型分析，并应粗数500个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。每次染色体检查，应从同一世代的不同培养瓶中取细胞，混合后进行再培养，制备染色体标本片。染色体片应长期保存，以备复查。可用G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体带型，应用照相图片做出带型分析。2、判定标准对1000个和500个中期细胞标本异常率进行检查，合格的上限（可信限90%Poison法） 亚二倍体如超过上限，可能因制片过程人为丢失染色体，应选同批号标本重新计数。 一个中期细胞内超过53条染色体，即为一个多倍体。七、病毒敏感性检查八、细胞功能检查九、重组腺病毒滴度的测定滴度代表具有感染能力的病毒颗粒数，它更为直观地反映能进入细胞表达目的蛋白的病毒颗粒，即有效剂量，是衡量腺病毒特性更为重要的指标。我们选择SFDA和FDA推荐的TCID50法测定病毒滴度。这一方法的原理基于最高稀释度下293细胞中病变效应(CPE)的形成。该方法只需10天就可获得结果，而且人为因素对结果的影响较小，结果的重复性更高。方法1、经典的TCID50测定方法1.1 试验材料所用试剂均需分析纯或与指定产品相当，DMEM低糖型干粉培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自GIBCO。1.1.1 DMEM培养液每1L DMEM培养基(低糖)添加1.8克碳酸氢钠，无菌过滤后4保存。1.1.2 DMEM 2%DMEM培养液添加2%胎牛血清(FBS，v/v)，4保存。1.1.3 0.25%胰蛋白酶-EDTA细胞消化液每0.25克胰蛋白酶和0.02克EDTA4Na溶解于100ml无钙镁离子的PBS溶液中，无菌过滤后4保存。1.2 试验步骤以下各步骤应于无菌条件下进行。1.2.1 试验准备将试验所用溶液预温至37。1.2.2 细胞制备培养足够的293细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA液消化，收集细胞，重悬于DMEM2%培养液，配成1105个细胞/毫升的细胞悬液，共30ml。96孔板中每孔加入100ml细胞悬液，共3块96孔板，置37，5%CO2孵箱中培养2小时。1.2.3 样品制备以DMEM2%为样品稀释液稀释样品，以10倍稀释度做梯度稀释，稀释至10-13。分别做3份稀释。具体操作如下：取13支2.5ml的离心管，分别加入1.8ml DMEM2%，取200ml待测样品加入10-1稀释度的离心管，反复吹打5次，混匀。更换枪头，取200ml 10-1稀释度的样品加入10-2稀释度的离心管，反复吹打5次，混匀。重复以上操作，直至样品稀释至10-13。1.2.4 测定过程按稀释度从高到低(从10-13至10-6)依次在每行中分别加入同一稀释度的100ml样品，每个稀释度的样品各做10个复孔(即加在96孔板的每一行110孔内)。其中每一行的1112孔内分别加入100ml DMEM2%作为空白对照。做三块复板。置于37，5%CO2孵箱中培养10天。1.2.5 结果判定96孔板中的阴性对照的细胞形态正常，没有出现任何致细胞病变效应；96孔板上的最低稀释浓度应该100%出现致细胞病变效应，而最高稀释浓度应该0%出现致细胞病变效应。该次试验结果有效。观察96孔板的每一孔的致细胞病变效应(CPE)，统计每一个稀释度出现CPE效应的比率(100%出现CPE效应为1，以此类推)。TCID50测定的典型结果如下图所示：12345678910111210-1310-1210-1110-1010-910-810-710-6阴性对照1.3 结果计算试验数据采用KRBER法进行处理。按下列公式计算结果：100ml样品的病毒滴度=101+(s-0.5)S为每个稀释度出现CPE效应的比率之和(从10-1开始)那么，1ml样品的病毒滴度=10101+(s-0.5)=102+(s-0.5) (IU/ml)十、病毒比滴度（比活性IU）测定，病毒感染滴度/病毒颗粒数（IUVP）应高于33腺病毒比滴度 = 滴度/颗粒数 100%十一、E1A区、E2B区、AAV及插入基因的检测一）E1A区的检测293细胞含有复制缺陷型腺病毒复制所必需的E1A基因，在重组腺病毒生产过程中可能发生同源重组，导致复制型腺病毒（RCA）的出现。为确保重组腺病毒产品中没有RCA的出现，我们采用PCR方法检测是否有E1A区的存在。一 试验材料1 扩增引物PA1：5 ATTACCGAAGAAATGGCCGC 3PA2：5 CCCATTTAACACGCCATGCA 3均用无菌水配制成10mM的溶液。2 DNA分子量标准1kb DNA Ladder购自GIBCO/Invitrogen。3 对照品纯化后野生型腺病毒DNA。二 试验步骤 1 293细胞总DNA的抽提培养293细胞，按现代医学试验方法所述提取细胞DNA。2 PCR扩增取抽提好的DNA或阳性对照1l为模板，依次加入H2O 28l；10扩增缓冲液 5l；2.5mM dNTP 4l；10M引物各5l；1U/l Taq DNA聚合酶2l。同时设置阴性对照，不加模板DNA。于94预变性5分钟后，做30次循环：94 30秒；55 30秒；72 45秒。最后72延伸10分钟。3 电泳将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，60V，1小时后，凝胶成像系统测定样品的分子量大小。三结果判定 阳性对照应为1.07kb10%，样品应为阴性。二）E2B区的检测设计E2B区的特异引物，PCR扩增腺病毒载体特征基因E2B区，并通过1%琼脂糖凝胶电泳测定PCR产物的分子量，DNA分子量标准为GIBCO/Invitrogen的100bp DNA Ladder。1 试验材料1.1 扩增引物PB1：5 TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG 3PB2：5 CATCTGAACTCAAAGGGTGG 3均用无菌水配制成10mM的溶液。1.2 DNA分子量标准100bp DNA Ladder购自GIBCO/Invitrogen。1.3 对照品阳性对照质粒pAdE-2。2. 试验步骤2.1 PCR扩增取抽提好的DNA或阳性对照1l为模板，依次加入H2O 28l；10扩增缓冲液5l；2.5mM dNTP 4l；10M引物各5l；1U /ul Taq酶2l。同时设置阴性对照，不加入模板DNA。于94预变性5分钟后，做30次循环：94 30秒；55 30秒；72 45秒。最后72延伸10分钟。2.2 电泳将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，60V，1小时后，凝胶成像系统测定样品的分子量大小，应为0.86kb10%。三）AAV的检测腺病毒与AAV常伴随发生，为保证制剂的单一性、纯粹性，对AAV的检测就相当重要。一般均采用特异引物通过PCR方法对AAV的特异条带进行扩增，结果应为阴性。1 试验材料1.1 扩增引物Pan1：5AACTGGACCAATGAAAACTTTCC 3Pan2：5 AAAAAGTCTTTGACTTCCTGCTT 3均用无菌水配制成10mM的溶液。1.2 DNA分子量标准100bp DNA Ladder购自GIBCO/Invitrogen。1.3 对照品AAV阳性对照DNA。2. 试验步骤2.1 PCR扩增取抽提好的DNA或阳性对照1l为模板，依次加入H2O 28l；10扩增缓冲液 5l；2.5mM dNTP 4l；10M引物各5l；1U/l Taq DNA聚合酶2l。同时设置阴性对照，不加模板DNA。于94预变性5分钟后，做30次循环：94 30秒；59 30秒；72 45秒。最后72延伸10分钟。2.2 电泳将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，60V，1小时后，凝胶成像系统测定，AAV检测应为阴性。阳性产物扩增条带大小应为340bp。四）插入基因的检测1) 接种5105 293细胞/2ml DMEM 10%/孔于6孔板，置于孵箱，37，5%CO2培养过夜； 2) 第二天，移去培养基，每孔加入500l DMEM 5%，同时分别加入50l的6.3项制备的病毒种子液，做好标记，轻轻混匀，置于孵箱，37，5%CO2培养90分钟； 3) 加入1.5ml DMEM 5%，小心混匀，继续培养48小时； 4) 收集培养上清液，按bFGF检测试剂盒和PDGF-BB检测试剂盒说明检测不同空斑的表达情况，取100l检测bFGF和PDGF-BB的表达。 十二、病毒外源因子检查：HPV、HCMV、HBV、HCV、HIV、HSV等根据相关试剂盒说明操作十三、内毒素测定药典（2010版第三部）附录E细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。效价内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH值在6.0-8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。内毒素限值的确定 药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中 L为供试品的细菌内毒素限值一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示； K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kgh）表示，注射剂K=5EU/（kgh）,放射性药品注射剂K=2.5EU/（kgh），鞘内用注射剂K=0.2EU/（kgh）； M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kgh）、mg/（kgh）或U/（kgh）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62m2计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。 按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。确定最大有效稀释倍数（MVD） 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数（1MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：MVD=cL/式中 L为供试品细菌内毒素限值； c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小稀释浓度c= / L； 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。方法1 凝胶法凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。根据鲎试剂灵敏度的标示值（），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2、0.5、0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm*75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓶18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水做阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口垂直放入371的恒温器中，保温60分钟2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓旋转180，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。当最大浓度2均为阳性，最低浓度0.25管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（c）。c =antilg(X/4)式中 X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当c在0.5和2（包括0.5和2）时方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。干扰试验 按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。表1 凝胶法干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液2B2/供试品溶液供试品溶液12421440.5480.254C2/检查用水检查用水12421440.5480.254D无/检查用水2注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）：Es=antilg（Xs/4）Et=antilg（Xt/4）式中 Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（lg）。当Es在0.52（包括0.5和2）及0.5 Es2 Es（包括0.5 Es和2 Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效的排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。检查法（1）凝胶限度试验 按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。表2 凝胶限度试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2B2/供试品溶液2C2/检查用水2D无/检查用水2注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。结果判断 保温60分钟2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。若溶液A 的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若溶液A 的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液A 的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，须进行复试。复试时，溶液A须做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定。（2）凝胶半定量试验 本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表3制备溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。结果判断 若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.52之间，试验有效。系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度按公式cE=antilg(X/2)。如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以。若内毒素浓度小于规定的限值，判定供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试品不符合规定。表3 凝胶半定量试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液检查用水12224282B2/供试品溶液122C2/检查用水检查用水12221240.5280.252D无/检查用水2注：A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。B为2浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）。C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。D为阴性对照。十四 效力试验插入基因表达活性测定，插入基因的生物学活性测定参照试剂盒说明书十五 复制型病毒（RCA）检测 A549细胞检测法，每301010VP中应不高于1RCA（即1RCA/301010VP）A549细胞培养法检测复制型腺病毒(RCA)RCA检测是重组腺病毒制品安全性检查的核心指标。在重组腺病毒生产过程中的多个阶段，通过与293细胞基因组的重组或其他途径都有可能产生RCA。目前，SFDA和FDA推荐采用A549细胞生物学法检测RCA。一. 试验材料所用试剂均需分析纯或者与指定产品相当，DMEM低糖型干粉培养基、F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自GIBCO。1 DMEM培养液每1L DMEM培养液添加1.8克碳酸氢钠，无菌过滤后4保