2017-18学年高中生物第一章微生物培养技术1.3测定微生物的数量1素材.docx

1.3 测定微生物的数量单细胞微生物个体生长时间很短，很快进入繁殖阶段，生长和繁殖难以分开，个体生长很难测定，而且实际应用意义不大，因此，它们的生长不是依据细胞大小，而是以群体的生长作为单细胞微生物生长的指标。群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法等。测量细胞物质的方法有细胞干重的测定、细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定、代谢产物的测定等。总之，测定方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况加以选择。一.目的和要求1.了解微生物数量测定常用的方法和平板计数的原理。2. 掌握血球计数板计数的原理和显微镜直接计数的方法。3.掌握平板计数的方法和应用范围。二.基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（01mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。血球计数板构造如图-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格（图-2）；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图-1，C）。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即1625=400小方格。每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为01mm，所以计数室的容积为01mm3。在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数因1ml=1cm3=1000mm3，平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。三.实验器材酿酒酵母菌悬液，大肠杆菌悬液，牛肉膏蛋白胨培养基，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。1ml无菌吸管，无菌平皿，盛有4 5 ml无菌水的试管，试管架和记号笔等。四.操作步骤(一) 显微镜直接计数法1稀释 将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。2镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。3加样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。4显微镜计数静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有510个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。5清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。（二）. 平板菌落计数法1编号：取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有45ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2稀释用1ml无菌吸管精确地吸取05ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸05ml放入10-2试管中，吸吹三次，其余依次类推。整个稀释过程如图-3。3取样用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液02ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。4倒平板于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约1015ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37温室中培养。5计数培养24小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中总活菌数=同一稀释度三次重复的菌落平均数稀释倍数5一般选择每个平板上长有30300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般以三个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。平板菌蓓计数法的操作除上述的以外，还可用涂布平板的方法进行。二者操作基本相同，所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基溶化后倒平板，待凝固后编号，并37温室中烘烤30分钟左右，使其干燥，然后用无菌吸管吸取02ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上2030分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37的温室中培养。五.实验报告1结果将结果记录于下表中。 A表示五个中方格中的总菌数； B表示菌液稀释倍数。2. 将计数结果填入下表。2思考题 (1)根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些