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DNA/RNA合成 常见问题解答处理和保存1. 如何保存寡核苷酸?2. 如何重悬寡核苷酸?3. 如果寡核苷酸在室温中放置超过一星期，还可以使用吗?4. 荧光染料标记的寡核苷酸，在储存和使用过程中必须特殊处理吗?纯化和浓缩5. 如何定量合成的寡核苷酸?6. 如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸?7. 如一个18个碱基的寡核苷酸包括3个dG,4个dC,5个dA和6个dT, OD值是0.7，那 么它的量是多少?8. 如何计算寡核苷酸的分子量?9. 如何测定寡核苷酸的质量?10. 如何测定寡核苷酸的质量?11. 如何测定合成的寡核苷酸的Tm值?12. 为什么Bioneer提供的Tm值和我们的Tm值不同?13. 用什么方法调整寡核苷酸的浓度?14. 单位换算表合成与订购15. 如何合成寡核苷酸?16. 标准寡核苷酸结构17. Bioneer能合成的最长的寡核苷酸是多长?18. 当我预订50nmol的寡核苷酸，产品却不足50 nmol，为什么?19. 能合成出高百分比“G”的寡核苷酸吗?20. 能提供寡核糖核酸(RNA)合成吗?21. 合成的寡核苷酸在3 或5位有磷酸基吗?22. 简并引物及通用引物是什么?纯化方法23. 怎样纯化合成的寡核苷酸?24. 用于芯片分析的60 mer寡核苷酸如何被纯化呢?修饰寡核苷酸25. 修饰寡核苷酸26. 作为反义脱氧寡核苷酸的硫磷酰化寡核苷酸实验27. 怎样制备双链DNA?Q1. 如何保存寡核苷酸？ TOP 通常，寡核苷酸应该-20保存，该温度下能稳定保存一年以上。寡核苷酸在溶液中较为稳定，但易被污染的核酸酶降解，因此我们建议应干燥储存。若要以溶液形式储存，最好将其分装在几管中分别保存，反复冻融会使寡核苷酸降解。另外，酸性条件下，DNA会因为脱嘌呤作用而降解；碱性条件会使磷酸二酯键水解断裂。Q2. 如何重悬寡核苷酸？ TOP 为便于长期保存，我们建议使用TE缓冲液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA, pH8.0)，而不用无菌水来溶解寡核苷酸。重悬后，寡核苷酸应该在-20癈保存以长期使用。寡核苷酸在无菌水中很难溶解，加一定量的NaOH有助于寡核苷酸在水中溶解。Q3. 如果寡核苷酸在室温中放置超过一星期，还可以使用吗？ TOP 脱水的寡核苷酸是长期稳定的。即使在溶液状态寡核苷酸也相当稳定，通常情况(没有引入使寡核苷酸降解的污染物)即使在室温中放置超过一星期也能使用。Q4. 荧光染料标记的寡核苷酸，在储存和使用过程中必须特殊处理吗？ TOP 如果暴露在光线下，荧光染料标记的寡核苷酸比未标记的寡核苷酸更易降解，荧光强度会逐渐降低。为了保持其荧光效能，荧光染料标记的核苷酸应避光-20保存。由于Cy3和Cy5在pH大于9时易被降解，所以Cy3和Cy5修饰Q5. 如何定量合成的寡核苷酸? TOP 合成的寡核苷酸的量非常少，不能直接称重来定量。通常通过测量紫外吸光度值(OD值)来定量。Q6. 如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸？ TOP 寡核苷酸的量经常用OD值来描述。1个OD值是体积1ml寡核苷酸溶液，在内径1cm的比色杯中的吸光度值，约为33 mg寡核苷酸，序列不同的寡核苷酸OD值有所不同。因为在260nm处单个碱基的吸光度值是已知的，所以序列已知的寡核苷酸的浓度就可以测定。dT: 8.8 ml/moldG: 11.7 ml/mol dC: 7.3 ml/mol dA: 15.4 ml/mol 对于一段寡核苷酸，它的吸光度等于每个碱基的数目乘以它的吸光系数，然后将4种碱基的结果加起来就是整个寡核苷酸的吸光度。它的浓度可通过下式来计算 ：O.D. =C (内径1 cm的比色杯)Q7. 如一个18个碱基的寡核苷酸包括3个dG,4个dC,5个dA和6个dT, OD值是0.7，那么它的量是多少？ TOP首先，用下面公式计算18个碱基的寡核苷酸的吸光度是多少 ： = 11.7 3 + 7.3 4 + 15.4 5 + 8.8 6 = 194.1 (ml/ mmole)然后，通过下式来计算寡核苷酸的浓度：O.D. =C，C = O.D./CC = 0.7 /194.1 = 0.0036 (mol/ml) = 3.6 (nmol/ml)最后，OD值为0.7的18个碱基寡核苷酸的浓度是3.6nmol。Q8. 如何计算寡核苷酸的分子量? TOP寡核苷酸的分子量可以通过下式进行计算：M.W. =(NA 249.2) + (NC 225.2) + (NG 265.2) + (NT 240.2) + (寡核苷酸长度-1) 63.98 + 2.02NA =总 A数NC = 总C数NG = 总G数NT = 总T数Q9. 如何测定寡核苷酸的质量? TOP 通常，合成的寡核苷酸的质量用摩尔数来描述，常用nmol。用寡核苷酸的摩尔数或寡核苷酸的分子量可以计算寡核苷酸的量： 寡核苷酸质量(ng) =分子量(M.W.)摩尔数(nmol)Q10. 如果不知道寡核苷酸的碱基组成，有什么办法来定量合成的寡核苷酸？ TOP 1 OD值 的单 链寡 核苷酸大约33 mg，双链 寡 核 苷 酸 约为 50.mg。然而对于较短的寡核苷酸，上述值偏差较大。因此，最 好 用 Q6 中 提 到 的 适合于短 寡 核 苷 酸 质 量的计算方法，可以 得 到 更 精 确的 结 果。Q11. 如何测定合成的寡核苷酸的Tm值? TOP Tm(解链温度)是指50%双链被解开成单链时的温度。寡核苷酸浓度和盐浓度会影响Tm值的大小。Tm 值 有 多 种 计 算 方 法 。我 们 使 用 近 邻 法 ( P N A S 8 3 ,3 7 4 6- 5 0 )来计算。用这种方法计算前，也有多种方法来估测。如果是15个碱基以下，那么有一种好的方法来估算，对于A和T，可以乘以2癈，对于C和G，可以乘以4癈然后相加，这叫做Wallace法则。 Tm= 2 (A + T) + 4 (G + C)另一种方法来估计长链中GC含量Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - 500/L + 16.6 logM(L:寡核苷酸的长度；M:1价阳离子的浓度) 但这些方法不能消除碱基堆积的影响，结果并不准确，所以近邻法被广泛的应用。但是，对于在60-70 bp或15bp以下的寡核苷酸的测定，近邻法还是有缺点。 Bioneer使用的近邻法具有新的特点。它考虑到在退火过程中不同的碱基序列的影响，并且通过热力学来测定，可以更有效的测定Tm值。比如5 -GC-3 和5 -CG-3的序列用热力学方法测定结果是不同的。计算方法如下： 依靠热力学方法，焓和熵通过两个碱基来确定。salt是指一价阳离子的浓度，Oligo是指反应过程中的寡核苷酸浓度。R是指气体常数(1.987 calK-1mol-1)。Bioneer用近邻法计算Tm值时，使用的是50 mM的盐浓度和1 nM的寡核苷酸的浓度。 Bioneer会给每一个用户提供Tm值，但这只是估计值，我们不能保证精确性，因此这个值仅供用户参考。如果没有扩增出产物，你可以把退火温度降到Tm值以下45癈。如果有许多非特异性的产物，你需要改变实验条件如提高退火温度以得到正确的产物。Q12. 为什么Bioneer提供的Tm值和我们的Tm值不同? TOP Bioneer使用的Tm值的计算方法和我们通常的计算方法是不同的。我们通常只是简单的乘以A、G、C、T的数目，但序列不同碱基的Tm值亦会不同。如Tm值取决于序列中的每一个碱基，即使碱基数相同但序列不同时，Tm值也将不同。Q13. 用什么方法调整寡核苷酸的浓度？ TOP 首先，在Bioneer提供的数据表或报告单中的100 pmol/靗，是用来加入TE缓冲液或无菌水，以使管中寡核苷酸的终浓度达到100 pmol/靗。例如,数据表或报告单中是189.0和209.2时，则应向两个管中分别加入相应量的无菌水,即可使每个管中的寡核苷酸浓度达到100 pmol/l。每一个管中寡核苷酸含量通过下式可以计算如下：189.0l100 pmol/l = 18,900 pmol = 18.9 nmol,209.2l100 pmol/l = 20,920 pmol = 20.92 nmol如果所要的终浓度是0.5M，pmol/l需要换M。100 pmol/l = 100 106pmol/106l = 100106 10-12mol/L = 10-4mol/L= 10-4106 mol/L= 102mol /L= 100 M终浓度换算为100M，如果需要的浓度是0.5M的，加入终体积的1/200的引物量，以使引物终浓度为0.5M。PCR反应的终体积是50l，所以需要加50/200 = 0.25l的引物，以使终浓度达到0.5M。Q14. 单位换算表 TOP科学系统单位: 10-1 = deci d 101 = deca da 10-2 = centi c 102 = hecto h 10-3 = milli m 103 = kilo k 10-6 = micro m 106 = mega M 10-9 = nano n 109 = giga G 10-12 = pico p 1012 = tera T 10-15 = femto f 1015 = peta P 10-18 = atto a 1018 = exa E 10-21 = zepto z 1021 = zetta Z 10-24 = yocto y 1024 = yotta Y-寡核苷酸单位换算的例子:1 pmol/l= 110-12 mol/110-6L= 110-6 mol/L= 1mol/L= 1MQ15. 如何合成寡核苷酸? TOP 目前最流行的用于合成寡核苷酸的方法是通过使用“亚磷酸三脂”方 法 将 单 体 连 接 ，形 成 天 然的 3-5磷 酸 二 脂 键 。Koster发现了-氰乙基亚磷酰胺并作为构建单体，现在普遍的用于寡核苷酸的合成(Nucl. Acids Res. 1984, 12,4539; Tetrahedron Lett. 1983, 24,5843)。通过“亚磷酸三脂”的方法使用-氰乙基亚磷酰胺，合成效率能够达到(98%)而合成时间比其它寡核苷酸的合成方法更短。而且，由于单体-氰乙基亚磷酰胺在激活以前很稳定，这是对合成寡核苷酸来说所必需的，他们能储存更长的时间。当寡核苷酸共价的连接在固相载体上就可以使其不被过量溶解-氰乙基亚磷酰胺和结合试剂的作用下，寡核苷酸被合成。在各种各样的固相载体中，可控孔度玻片已经在近年广泛使用了，这种玻片是由均匀的玻璃基质组成，上面有固定尺寸的孔。 整个寡核苷酸的合成通过一系列的反应完成，其中包括四个循环反应：脱保护，连接，氧化，加帽。脱保护 通过第一个循环脱保护，CPG裂解出5保护基团DMT。酸性条件对于脱保护是必需的，通常使用3三氯乙酸。据报道，寡核苷酸在酸性环境中易脱嘌呤，尤其是对于腺苷。因为三氯乙酸有很强的酸性，所以用三氯乙酸脱保护时，反应时间不应该太长。比起三氯乙酸，二氯乙酸酸性较弱，能够在一些情况下避免脱嘌呤问题。脱保护后产生的DMT阳离子呈现出一种深橘色。通过测定吸光度，来监测反应效率。连接 脱保护后，CPG上的5-羟基暴露，结合核苷-氰乙基亚磷酰胺，三亚磷酸酯氧化变成磷酸三脂，然后按顺序连接。对于核苷-氰乙基亚磷酰胺，为了避免合成寡核苷酸过程中负反应的发生，碱基的环外氨基被保护以免形成酰胺结构。苯甲酰基用于保护酰苷和胞苷。另一方面，异丁酰基用于鸟苷碱基保护。胸苷碱基中没有环外的胺基，所以不需要保护。-氰乙基亚磷酰胺用于保护所有核苷的5-羟基。 因为核苷2-氰乙基亚磷酰胺在正常条件下非常稳定，不能直接和正在合成链上游离的5-羟基功能基团发生反应。所以，它们必须首先通过一种弱酸性激活剂激活。在各种激活剂中，四唑作为标准激活剂具有很强的激活作用。四唑已经被认为具有双重作用：它质子化2-氰乙基亚磷酰胺的二异丙氨基，产生亲核基团，形成具有活性的四唑膦中间产物。用这种被激活的核苷亚磷酰胺试剂耦联反应快(不到2分钟)，产量高。氧化 新合成的亚磷酸盐和核苷酸之间的键合不稳定，对酸和碱均很敏感。因此，三价的亚磷酸三脂被氧化成五价的磷酸三脂。碘是温和的氧化剂，在碱性的四氢呋喃溶液中作为氧的供体。此步反应非常快，在三十秒内就可以完成。加帽 因为结合反应在特定的时间内不能够定量，在每一步结合反应中都有一小段提前终止的序列产生。如果这些序列进一步参与反应，产物将很难从混合序列中分离出来。通过加帽，即将自由羟基乙酰化，解决了这个问题。乙酰化可由强的乙酰化试剂完成，该试剂是由等摩尔的醋酸酐和N-甲基咪唑组成，反应可在30秒内完成。氧化后，核苷酸加入，循环完成。寡核苷酸合成后，移去增长链5-末端的DMT基团，下一个核苷酸的聚合循环开始。整个寡核苷酸合成后，借助浓氨水的处理，寡核苷酸从固相载体上分离，同时碱基和磷酸基去保护。Q16. 标准寡核苷酸结构 TOPQ17. Bioneer能合成的最长的寡核苷酸是多长? TOP合成量0.025 mol: 50 mer合成量0.05 mol: 50 mer合成量0.1 mol: 100 mer合成量0.2 mol: 100 mer合成量1.0 mol: 130 merQ18. 当我预订50nmol的寡核苷酸，产品却不足50 nmol，为什么? TOP 50 nmol的寡核苷酸合成不意味着能得到50 nmol的最终产品。50 nmol是指在寡核苷酸合成开始时固相载体负荷的数量。寡核苷酸通常是反应所要求的量而不是最终产率，用户得到的核苷酸的数量自然要比要求的少。终产率受寡核苷酸长度、碱基组成和连接效率的影响。Q19. 能合成出高百分比“G”的寡核苷酸吗? TOP 众所周知，含高百分比的“G”寡核苷酸不容易被合成，特别是序列中包含一行“G”。有报道，如果有四个或更多的“G”排成一行，寡核苷酸将趋向形成鸟嘌呤四聚体(Poon and MacGregor,Biopolymers, 1998, 45, 427 -434)。通过次黄嘌呤核苷置换部分G，就能避免四聚体鸟苷的形成。Q20. 能提供寡核糖核酸(RNA)合成吗？ TOP 是的，我们能合成。我们能提供2-OH或/和2-O-甲基结构的寡核糖核苷酸，也能合成由DNA和RNA组成的寡核苷酸。Q21. 合成的寡核苷酸在3 或5位有磷酸基吗？ TOP 如果没有殊要求,合成的寡核苷酸在3或5端均无磷酸基。如果你想要3或5有磷酸基的寡核苷酸，你应该在订单上标注清楚在3或5端进行磷酸化修饰。Q22. 简并引物及通用引物是什么？ TOPR - a 或 gY - c 或 tM - a 或 cK - g 或 tS - g 或 cW - a 或 tV - a, c或 gH - a, t或 cB - g, t或 cD - g, a或 tN I:A I:T=I:G.形成稳定的碱基配对。包含肌苷的寡核苷酸借助PCR或探针杂交可用于检测或分析不同的或相似的DNA序列。硫磷酰修饰法： 经硫磷酰基化的寡核苷酸对核酸内切酶和核酸外切酶的降解有很好的抵抗作用，这种特性能增加反义寡核苷酸链在细胞内的效果。我们可以依据用户的需要，在寡核苷酸部分序列中用硫磷酰基置换核苷酸内部的磷酸基(在磷酸基中用一个硫原子代替一个氧原子)。双重修饰法(5荧光素3 Dabsyl & 5荧光素钠3 TAMRA 修饰)： 双重标记的寡核苷酸可在实时PCR中用来检测DNA的扩增。他们或者在反应中裂开(如TaqMan探针)或者在互补目的DNA存在的情况下经历一种构型变化(如分子信标)。许多探针利用寡核苷酸形成反向环构型的特征进行设计。实际上，通过除去供体荧光基团的淬灭作用，探针可指示反应的发生。PCR检测的5 核酸酶测定法(TaqMan探针)： 5核酸酶测定法被用来实时监测反应。这种测定法利用耐热性DNA聚合酶的5核酸外切酶的活性来检测正在进行的反应。耐热性DNA聚合酶能够从链状DNA的5端水解核苷酸，旧链在合成一条新链时被置换。裂解主要发生在置换的单链部分和DNA配对的双链部分的连接处。这导致单核苷酸和寡核苷酸从置换的DNA链的5末端被释放。DNA聚合酶的这种特性被用来监测反应。在5端核酸酶检测法中FRET DNA双重探针是短的寡核苷酸，与扩增DNA靶序列和修饰的3端互补，以至于他们不能在3端延长。他们在3和5末端用荧光基团标记。报告荧光染料被放置在5末端，粹灭剂被放置在探针的3末端。在完整的探针中，染料的荧光性被消除，在PCR反应中探针与靶序列杂交 ，借助耐热性DNA聚合酶的5核酸酶的活性，淬灭剂与报告基因分离，从而恢复报告基因的荧光性。两个探针被使用，一个用于正常序列，另一个用于3 bp缺失的互补序列。每个探针在5末端有不同的报告荧光，并且一个相同的粹灭剂染料连接在从5末端数的第七个核苷酸上。靶DNA的鉴定由荧光发射光谱决定。分子信标： 严格的说，荧光淬灭在使用DABCYL分子指示标中不是FRET相关的，因为它不能满足重叠光谱的标准。然而，以FRET为基础的淬灭也能被使用。分子信标被作为杂交探针后不久被应用于PCR，利用它们能够同互补DNA杂交的原理，它们能够被用来监测一个正在进行中的反应和在实时PCR中区别等位基因。反应完成后，反应物加入固定有分子信标的微量滴定孔中，借助读取产生的荧光检测产物。或者还可用封闭试管和实时程序来检测。在这种情况下，分子信标被直接加入到PCR混合物并且与扩增反应中新合成的DNA杂交。与TaqMan探针相比，分子信标优势在于能够进行多重PCR检测，因为，在理论上，他们能同时测定更多的产品。Q26. 作为反义脱氧寡核苷酸的硫磷酰化寡核苷酸 TOP 随着我们对分子生物学的理解不断加深，我们慢慢获得对分子水平疾病的认识。合理的药物设计变得更加可行。特别是在蛋白质水平上分子间的反应能够被完美的设计，通过生物合理的途径来提高结合性，分子间的相互作用成功的被应用和被最佳化。合成的脱氧寡核苷酸(ODNs)已经被Zamecnik和Stephenson提出作为一种新的潜在的治疗方法，这种方法以一种合理的方式与信使RNA疾病关联蛋白相互作用，并且特异的抑制它的合成。 这种被称为反义策略的方法的优势在于，通过众所周知的Watson-Crick碱基配对法则，即单链核酸与互补的寡核苷酸链相互作用形成双螺旋结构。每个蛋白分子均遵循分子生物学的基本机制合成：一个基因(双链DNA)携带一种特定蛋白质的遗传信息，被转录成作为信息携带者的单链mRNA，再以此作为模板在核糖体指导蛋白质的合成(翻译)。因此，反义策略不被限制于特定类型的疾病而能够被广泛地应用。天然的寡核苷酸(DNA和RNA)不能够达到作为反义药物候选物的标准，不同的化学修饰将克服现存的障碍，它将被细胞吸收，抵抗核酸酶的降解和提高与mRNA的亲和力。首先，脱氧寡核苷酸(ODNs)必须能够穿越细胞膜到达细胞质或细胞核。一旦进入细胞内部，ODNs就必须抵抗核酸酶的降解。最后，为了抑制致病基因的表达，ODNs必须能够特异性结合并对靶mRNA有高度的亲和力。早期在组织培养中观察到的ODNs的活性后曾认为，这些理论上的障碍不值得担心。然而，最近文章的数据分析显示这些理论上的障碍确实存在。 最近的研究焦点在于用化学方法改善ODNs的特性，主要集中在核苷酸酶抵抗力和mRNA亲和力的提高方面。mRNA亲和力对于反义策略非常重要，它常常用解链温度(Tm)所反映。双倍体核酸中，由于碱基堆积产生的P-P相互作用, 在260 nm紫外吸收被淬灭。加热可将其退火解链成单链，导致其在260 nm处的紫外的吸收增加。因此，假定一个二状态模型，会得到一个S形曲线，并能计算其热力学参数。这个吸收-温度曲线的中点被定义为Tm，它反映的当处于配对状态的寡核苷酸链与处于单