细胞生物学实验教案(生技).doc

HUBEI NORMAL UNIVERSITY实 验 课 教 案2007 2008 学年 第 1 学期院（系、所、部）： 生科院 教 研 室 ： 细胞遗传教研室 课 程 名 称 ： 细胞生物学实验 授 课 班 级 ： 授 课 教 师 ： 职 称 ： 讲 师 2007 年 9 月 8日教 案 目 录细胞生物学实验教学大纲2细胞生物学实验课程教学进度表 4实验一：动物细胞的基本形态观察和细胞计数5实验二：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察7实验三：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合9实验四：线粒体和液泡系的超活染色与观察10实验五：植物细胞微丝束的光学显微镜观察12实验六：叶绿体的分离与荧光观察14实验七：DNA 的显示Feulgen 应16实验八：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的观察19实验九：小鼠骨髓染色体标本的制备与观察21实验十：染色体C-带技术（生技）24实验十一：细胞内化学成分的显示方法酸性磷酸酶的显示（生技）25实验十二：开放性实验蚕豆（Vicia faba）根尖细胞微核监测技术27实验一：动物细胞的基本形态观察和细胞计数【课前预习】1细胞计数的基本原理？2细胞计数与细菌计数的异同点？【目的要求】制备不同细胞的临时制片，观察、了解细胞的基本形态；掌握细胞计数方法。【基本原理】细胞的形态结构与功能相关是很多细胞的共同特点，在分化程度较高的细胞更为明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成的。例如：具有收缩机能的肌细胞伸展为细长形；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一的树枝状突起；游离的血细胞为圆形、椭圆形或圆饼形。不论细胞的形状如何，细胞的结构一般分为三大部分：细胞膜、细胞质和细胞核。但也有例外。例如：哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。细胞计数一般用血细胞计数板，按白细胞计数方法进行计数。细胞计数时，先将培养细胞或血细胞稀释成细胞悬液，然后将细胞悬液滴入细胞计数板内，计数计数板上计数室四大格内的细胞数。根据计数室的容积及稀释倍数，即可计算出细胞浓度。【实验用品】1材料：鸡一只2器材和仪器：显微镜、载片、盖片、吸水纸、手术器材、解剖盘、血球计数板、小平皿、牙签3试剂：0.85生理盐水、Ringer 氏液【方法步骤】1制备10%的鸡血细胞悬液。2鸡血涂片的制备与观察取鸡血悬液，靠近一端滴在载片上将另一载片的一端呈45角紧贴在血滴的前缘，均匀用力向前推，使血液在载片上形成均匀的薄层 (图l1)。晾干，显微镜下观察。图11 血涂片的制备3细胞计数1）制备鸡红细胞悬液：用Ringer 液按确定的稀释倍数制成鸡红细胞悬液。2）熟悉血细胞计数板：血细胞计数板呈长方形，有2 个计数室。每个计数室分为9 个大正方格，每个大格边长为1mm ， 计数室的底与盖玻片间的距离为0.1mm ， 及每大格的容积为1mm1mm0.1mm=0.1mm3。四角的每个大格被分为16 个中格；中央的大格被分为25 个中格，中央的每个中格又被分为16 个小格。3）滴片：每人取1 付血细胞计数板及1 张盖玻片，用布将盖玻片擦净，把盖玻片盖在血细胞计数板槽上，然后用吸管将制备好的鸡血细胞悬液混匀，吸取血细胞悬液，滴1 滴于血细胞计数板的盖玻片一侧边缘，使细胞悬液自然流入计数室内。注意血细胞悬液不可滴的过多，如溢出或盖玻片内有气泡必须重做，否则将影响计数结果。该吸管加完样后不能再用。4）计数：在低倍镜下按图计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16 个小方格）内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。数出计数板上计数室四角四大格中的细胞数，如细胞压在格线上时，数上不数下，数左不数右。二次重复计数不应超过5。【实验结果】1鸡血涂片的制备与观察显微镜观察可见鸡红细胞为椭球形，有核。白细胞数目少，为圆形。2细胞浓度计算 将四大格的细胞总数除以4，得出平均每大格的细胞数，每大格的容积为0.1mm3，乘以10000 即为1000mm3（1ml）。因此，不同稀释倍数细胞悬液的细胞浓度可用下式计算：细胞浓度（细胞数ml）（四大格的细胞数4）10000稀释倍数【实验报告】1绘图：显微镜下观察的各种细胞形态2计数每毫升细胞悬液中的细胞数（注意单位：个/ml）3为什么细胞计数时，细胞悬液逸出凹槽外或有气泡时要重做？附： 必须注意的问题生物绘图方法绘图是生物实验报告的一种重要形式，其基本要求如下：1准备好3H 铅笔、橡皮、刀、尺子及绘图纸，将绘图纸放在观察物的有边、纸下不要垫书或纸张。2绘图时，特别注意观察物的形状、各部分的位置、比例和毗邻关系。3图的位置、大小要适宜，图占报告纸左上方2/3 的面积，并考虑注字的位置。4观察清楚后，选择典型的细胞或组织，左眼看显微镜，右眼配合右手，先用铅笔在纸上轻轻描出轮廓，使形状正确，然后再用清晰的线条绘出，线条粗细要均匀不要重复。5用圆小点表示明暗和立体感，点的大小要均匀，不能涂阴影。6图绘好后，要在图的右侧注明各部分结构名称，引线要直而平行，长短适度，各引线不能交叉，各线右端上下对齐，注字要用正楷，不能潦草，要自左向右写。7每一个图下面要注明图的名称、放大倍数。8绘图纸上所有注字（包括姓名、实验日期、题目等）均用铅笔书写，不能用其他笔写。实验二：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察【课前预习】1土豆凝集素的本质及其使红细胞凝集的原理？2在等渗溶液中细胞一定能维持正常形态吗？3预测红细胞在各种溶液中的溶血速度？【目的要求】1了解细胞糖被的特点和功能，了解植物凝集素的作用2了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度【基本原理】细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。【实验用品】1材料：土豆块茎，鸡（采血）2器材和仪器：显微镜、载片、盖片、天平、滴管、小烧杯、移液管、离心管、试管和试管架3试剂：0.85生理盐水、2鸡红细胞、PBS 缓冲液、Alsever 溶液、0.17M 氯化钠、0.17M 氯化铵、0.17M醋酸胺、0.17M 硝酸钠、0.12M 草酸铵、0.12M 硫酸钠、0.32M 葡萄糖、0.32M 甘油、0.32M 乙醇、0.32M丙酮【方法步骤】1制备土豆凝集素液和红细胞悬浮液，制备无血清的鸡红细胞悬液，使凝集素液和红细胞悬液混合，静置后，在光镜（低倍）下观察凝集素使红细胞凝集的现象。（以PBS 缓冲液加2血细胞作对照实验）土豆凝集素的制备：称取土豆去皮块茎2g , 加10 mL PBS缓冲液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素） , 载玻片上滴一滴土豆凝集素,再滴一滴2红细胞液,充分混匀静置20 min , 低倍显微镜下观察血球凝集现象。2观察10%的鸡红细胞悬液，可见该悬液为一种不透明的红色液体3观察溶血现象 取一支试管，再加入4ml 蒸馏水，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，混匀后注意观察溶液颜色的变化，可见溶液由不透明的红色变成透明的红色液体（可将试管贴靠在书上，隔着试管看书中的字，如发现溶血则文字可被看清）。4观察鸡红细胞对不同物质的通透性（1）取一支试管，和0.17M 的Nacl 溶液4ml，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，轻轻摇匀，用上述方法观察是否出现溶血现象，如出现溶血，记下发生溶血所需要的时间（从加入4ml 溶液算起）（2）按上述方法分别加入下列9种溶液是否导致红细胞溶血并记录实验结果。 0.17M 氯化铵 0.17M 硝酸钠 0.17M 硫酸钠 0.17M 醋酸胺 0.17M 草酸铵 0.17M 葡萄糖 0.17M 甘油 0.17M 乙醇 0.17M 丙酮【实验结果】1土豆凝集素能使鸡红细胞凝集，PBS 对照液中红细胞分散均匀 对照组：未凝血 实验组：凝血2细胞膜渗透性实验结果比较和分析试管编号 所加试剂和浓度 是否溶血 时 间 结果分析 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 【实验报告】1简图表示凝集素使血细胞凝集原理2怎样根据细胞膜渗透性实验结果分析确定物质进入细胞的速度？物质进入细胞的快慢有什么规律？实验三：聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合【课前预习】1介导细胞融合的方法有哪些？2细胞融合技术有哪些方面的应用？【目的要求】掌握细胞融合原理以及应用PEG 诱导细胞融合的方法。【基本原理】两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜，在特殊融合诱导物的作用下，两个细胞膜发生一定的变化，就可促进两个或多个细胞聚集，相接触的细胞膜之间融合，继之细胞质融合，形成一个大的融合细胞。人工细胞融合开始于五十年代，六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广。细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。不仅能产生同种细胞融合、种间细胞融合，而且也能诱导动植物细胞间产生融合。因此，融合细胞的研究为生物学无论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路。这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域，如研究核质关系、绘制染色体基因图谱、制备单克隆抗体、育种等。细胞融合的诱导物种类很多 常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus) ， 聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。聚乙二醇(PEG)结构为：HOH2C(CH2OCH2)nCH2OH，相对分子质量在200-6000 均可用作细胞融合剂。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。【实验用品】1材料 鸡红细胞2器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片3试剂 Alsver 液(pH7.4)、0.85生理盐水、GKN 液、50PEG（MW 4000）【方法步骤】1采血及鸡红细胞悬液的制备（同教材57 页）。2（共2 组）取鸡红细胞悬液1mL，移人10mL 离心管， 加入4mL 0.85生理盐水混匀。1000rmin 离心5 min。3弃上清液(用吸管吸去)，加0.85生理 盐水5mL，用指弹法（或吸管轻吹）将细胞团块弹散，混匀后1000rmin 离心5min；重复上述条件，再离心洗涤1 次。4收集最后1 次离心沉淀的血细胞，加入适量（58mL）的GKN 液，轻吹散，混匀。5（每4 人）取悬液1mL 到1 个试管中，加入0.5 mL 预热的50PEG 混匀，置于30水浴中温浴35min；取未融合和融合的血细胞悬液各1 滴分别滴于载玻片上的两侧，盖上盖玻片。6利用光学显微镜 (高倍) 以未融合细胞为对照观察2 个靠近细胞形成融合的过程。【结果观察】在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个同核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。【实验结果】在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个同核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。【实验报告】l在显微镜下按顺序绘制所观察到的细胞融合各阶段，并注明主要特点。2什么是同核体、异核体? 细胞融合主要有哪几种方法？简述细胞融合的应用。实验四：线粒体和液泡系的超活染色与观察【课前预习】1什么是液泡系？2为什么不能用一种活体染料同时观察多种细胞器？【目的要求】1. 观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、发育和分布2. 了解细胞和细胞器的超活染色技术【基本原理】线粒体是细胞内一种重要细胞器，细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B（Janus green B）是线垃体的专一性活细胞染色剂，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，从而使线粒体显色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。中性红对液泡系的染色具有专一性，将活细胞中的液泡系染成红色。【实验用品】1. 器材：显微镜、恒温水浴锅、剪刀、镊子、解剖刀、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸2. 试剂：Ringer 液、1/5000 詹纳斯绿B、1/3000 中性红3. 材料：人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞、小麦（或绿豆）幼根根尖【方法步骤】1线粒体的超活染色与观察1）口腔上皮细胞线粒体的超活染色：1/5000 詹纳斯绿B1-2 滴，口腔上皮细胞（牙签刮取），载玻片于37恒温染色10-15min，显微镜下观察。2）洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色与观察：1/5000 詹纳斯绿B 溶液1-2 滴，洋葱鳞茎内表皮，载玻片于37恒温水浴染色10-15min，显微镜下观察。2小麦（或绿豆）幼根根尖液泡系的中性红染色观察小麦（或绿豆）幼苗根尖（1-2cm）纵切面切片，1/3000 中性红溶液1 滴染色5-10min，载玻片于37恒温水浴，盖上盖玻片压扁根尖，显微镜下观察。【实验结果】口腔上皮细胞的线粒体分布 洋葱内表皮细胞线粒体分布 植物根尖液泡的中性红染色【实验报告】1绘出人口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布并简要分析。2绘出小麦幼根根尖组织液泡系的形态与分布并简要分析 。实验五：植物细胞微丝束的光学显微镜观察【课前预习】1为什么本实验中考马斯亮兰R250 染的是微丝？2实验中的各种试剂分别有何作用？【目的要求】掌握植物细胞骨架的光镜标本制作方法。【基本原理】细胞骨架在通常情况下不稳定：如低温、高压、饿酸处理等。当用适当浓度的TritonX-100 处理细胞时，能溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏显得更清晰，M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，经考马斯亮蓝R250 染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示。微丝、微管和中间纤维都是直径很小的结构，最大的单根微管才25nm 左右，只能在电镜下才能观察到。目前研究细胞骨架的主要方法是应用高压电镜或免疫荧光显微镜技术。本实验用普通光镜观察到细胞骨架，是因为骨架纤维成束分布、结构经染色后，有夸大作用。由于细胞经TritonX-100 抽提后剩下的主要是细胞骨架成分，使得显现更清晰。细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1% Triton X-100 处理细胞，可使细胞膜溶解，而细胞骨架系统的蛋白质被保存， 再用考马斯亮兰R250 染色，使得胞质中细胞骨架得以清晰显现。【实验用品】1材料：新鲜洋葱鳞茎2试剂1） M 缓冲液（pH 7.2）各成分终浓度为：50mmol/L 咪唑(MW:68.08)； 50mmol/L KCl(MW:74.55)； 0.5mmol/L MgCl26H2O(MW:203.30)； 1mmol/L EGTA(MW:380.36)；0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24)； 1mmol/L DTT(MW:154.3)2） 6mmol/L PBS 磷酸缓冲液 （pH 6.5）：KH2PO4 : Na2HPO4.2H2O = 7:33） 0.7% NaCl 生理盐水4） 1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于 M-缓冲液5） 3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL，PBS 88mL6） 0.2% 考马斯亮蓝R250 染液 200mL：考马斯亮蓝R250 0.2g；甲醇 46.5mL；冰乙酸 7mL；蒸馏水46.5mL3仪器：光学显微镜，镊子，剪刀，试管，表面皿，滴管，载玻片，盖玻片【方法步骤】【实验结果】洋葱鳞茎外层与内层的表皮细胞比较（放大倍数1020）洋葱鳞茎内层的表皮细胞骨架【实验报告】1光镜下观察到的细胞骨架有何形态特征？2请设计一个实验鉴定你所观察到的细胞骨架是哪一类型。附：各种主要试剂的作用1Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非离子去垢剂；适当浓度的Triton X-100，可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存2M缓冲液和磷酸缓冲液作用：维持细胞的渗透压3EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca2，主要是高浓度的Ca2可是微管解聚，因此加入EGTA 来降低Ca2的浓度。4戊二醛作用：良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态；5考马斯亮兰作用：非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）实验六：叶绿体的分离与荧光观察【课前预习】1分离细胞器的一般原理和方法？2叶绿体的荧光为什么不能用普通光学显微镜观察到？【目的要求】1通过对植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法2通过光镜鉴定叶绿体的纯度及了解叶绿体形状3观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，了解荧光显微镜的原理和使用方法【基本原理】细胞经过破碎后制成匀浆，在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。利用细胞各组分质量大小、形状和密度的不同，选择不同的离心力和离心时间，即可分离得到所需要的细胞器或大分子组分。几乎所有的植物组织中都有质体的存在。叶绿体是研究最透彻的质体。分离完整叶绿体有三个主要困难：1）有细胞壁包裹。破碎细胞的力量要能足以打破细胞壁的同时保持叶绿体的完整性。2）叶绿体中由于淀粉积累成致密颗粒会在离心过程中使叶绿体破碎。淀粉的积累可以通过自然植物在短光照时间和/或低光照强度的条件下生长而得以消除。若有必要可以在匀浆前将植物放在黑暗中24-48hr 以除去淀粉。3）匀浆过程中，液泡中储藏的有毒物质会释放出来。在有酚类化合物积累的物种中，可以通过在研磨缓冲液中加入可溶解的聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白（BSA）和巯基化合物来降低其有毒影响。菠菜是分离完整叶绿体的极好材料，其细胞中所含的质体较大，而且它们都能在不积累淀粉和酚类物质的条件下生长。菠菜的叶绿体/湿重比率较高。叶绿体具有荧光现象，可利用荧光显微镜观察。菠菜叶富含叶绿体，可采用徒手切片观察其形态和分布叶绿体的分离在等渗溶液中进行（0.38mol/L 甘露醇,4mmol/L50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)），以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。用8 层纱布除去组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后在3000g 条件下离心6min , 即可获得沉淀的叶绿体。离心技术可用于细胞器的分离。分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞成分的分离。常用离心技术一般包括差速离心法和密度梯度离心法。1）差速离心法采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度和离心时间下分批分离的方法，称为差速离心法。常用于从组织匀浆中分离各种细胞器，见表2-1。表2-1 差速离心形成的沉淀（植物）沉淀转速x 时间内容物A 150g x 20min 完整细胞B 1000g x 20min 细胞核，细胞碎片C 3000g x 6min 叶绿体D 10000g x20min 线粒体、溶酶体、微体E 105000g x120min 微粒体F 105000g x 20min +0.26% 脱氧胆酸纳核糖体2）密度梯度离心当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离。密度梯度离心主要有两种类型，速率区带离心和等密度梯度离心。等密度梯度离心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介质。介质梯度不需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大的核酸、亚细胞器和质粒等。【实验用品】1材料：菠菜2试剂：蒸馏水，0.35mol/L 氯化钠溶液，0.01%吖啶橙3器材：立式冰冻高速离心机、组织匀浆机、光学显微镜、荧光显微镜、天平、研钵、漏斗、50mL 离心管、纱布、载玻片、盖玻片等。【方法步骤】1叶绿体的制备1）选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g 于0.35mol/L 氯化钠溶液15ml 中置组织捣碎机或研钵中。2）利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，35min，或研磨成匀浆。3）用6 层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。4）取滤液4ml 在1000r/min 下离心2min，弃去沉淀。5）将上清液在3000r/min 下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。6）沉淀用0.35mol/L 氯化钠溶液悬浮。7）取叶绿体悬液1 滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察(荧光显微镜使用方法)时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1 滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即可观察。8）观察叶绿体的形态结构、叶绿体发射荧光的现象。2菠菜叶片徒手切片观察用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶片削一个斜面至于载片上，滴加1-2 滴0.35mol/L NaCl 溶液，加盖片后轻压，置于显微镜下仔细观察。观察三种细胞（细胞表皮细胞，保卫细胞，叶肉细胞）和叶绿体【实验结果】差速离心获得并纯化的叶绿体镜检为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。菠菜叶片徒手切片可以观察到三种细胞分别是边缘呈锯齿形的鳞片状的表皮细胞，构成气孔的成对的肾形保卫细胞，排列成珊栏状的长形和椭圆形叶肉细胞。【实验报告】1绘图：菠菜叶肉细胞的形态，示叶绿体。2观察经过加热和未加热这两种叶绿体在形态上的区别，并绘出草图。实验七：DNA 的显示Feulgen 反应【课前预习】1Feulgen 反应的实验原理和关键步骤是什么？2在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片？【目的要求】1熟悉并掌握Feulgen 反应的原理及其实验操作方法2对细胞的免疫组化研究方法有初步的认识【基本原理】Feulgen 反应（Feulgen reaction）是显示DNA 的最典型的组织化学反应，为学者Feulgen 和Rossenbeck于1924 年发明，简称为Feulgen 法。因对DNA 的显示反应具有高度专一性，故常被用来显示细胞内DNA的分布情况。自Feulgen 等发明该显示DNA 的Feulgen 反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA 分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff 试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说, DNA 经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA 的分布。其反应机制如下图所示。2HCl+Na2S2O52NaCl+SO2+H2SO3【实验用品】1器材 显微镜、立式染色缸、水浴锅2材料 香柏油，擦镜纸，盖玻片，载玻片3试剂1）schiff 氏试剂 将0.5g 碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5min 使之充分溶解，冷却至50时过滤，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25时，加入0.5g 偏重亚硫酸钠（Na2S2O3）无水亚硫酸钠（NaHSO3），在室温冷暗处至少放置24h（有时需23 天），使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4冰箱中（可保存数月或更长时间）。在使用前加入0.5g 活性碳, 摇1min,用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。2）亚硫酸水（洗涤剂）：用200ml 普通自来水（不要用蒸馏水, 以免引起误差）、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。3）1mol/L HCl（水解用）：取82.5ml 比重为1.19 的盐酸加蒸馏水1000ml 即成（应将盐酸缓缓加入水中）。【方法步骤】【实验结果】细胞核中的DNA 呈鲜亮的紫红色反应，它不但反应出DNA 存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色反应的深浅，来判断DNA 的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为负反应；但在有些材料的细胞质中，DNA 也会出现阳性反应。 小鼠肝切片Feulgen 染色【实验报告】1绘图表示Feulgen 反应的染色结果。2总结Feulgen 反应染色结果的影响因素。附：Feulgen 方法应注意的几个问题：1对照切片的制做：进行Feulgen 反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff 剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff 试剂中最多不要超过1 h （0.5h 即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA 水解，从而出现假的正反应。2固定剂的选择：以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen 反应。如Bhampy 固定剂、Helly 固定剂、Flemming 固定剂、OsO4 固定剂、Carnoy 固定剂、zenker 固定剂和Bouin-Aller 固定剂。但在上述固定剂中，以OsO4 和Carnoy 效果较好，OsO4（1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4 价钱较贵，故一般多采用Carnoy 固定液。在Feulgen 反应中，不能单独使用Bouin 定液，因为它是Feulgen 反应的最坏固定剂，但经Aller 改进后的Bouin-Aller 固定液效果却较好。3水解时间：Feulgen 反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为812min。但是水解时间长短也要视标本的类型（如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。4Schiff 试剂的作用：Feulgen 反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff 试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA 染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff 试剂的配制方法也可影响DNA 的染色反应。实验八：小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的观察【课前预习】实验前给小鼠腹腔注射台盼兰淀粉肉汤的目的是什么？【目的要求】1了解小鼠腹腔巨噬细胞吞噬现象的原理2熟悉细胞吞噬作用的基本过程【基本原理】细胞的吞噬作用在单细胞动物是摄取营养物质的方式，在高等动物内的巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞等具有吞噬功能，是机体非特异性免疫功能的重要组成部分。巨噬细胞是由骨髓干细胞分化生成，当病原微生物或其他异物侵入机体时，巨噬细胞由于具有趋化性，便向异物处聚集，巨噬细胞可将之内吞入胞质，形成吞噬泡，然后在胞内与溶酶体融合，将异物消化分解。吞噬泡的形成需要有微丝及其结合蛋白的帮助，如果用降解微丝的药物细胞松弛素B 处理细胞，则可阻断吞噬泡的形成；免疫抑制剂环磷酰胺（CYP）对巨噬细胞的吞噬作用也有影响。巨噬细胞起源于骨髓，经血液进入组织中而成，分布于全身各处。当机体受到某些损伤因素时（如微生物或其它病原体或异物侵入），能招引巨噬细胞，同时巨噬细胞有趋化性，主动向病原体或异物游走，在接触到病原体或异物时，细胞膜凹陷伸出伪足包围异物，并发生胞吞作用形成吞噬泡，继而细胞质中的溶酶体与吞噬泡融合，消化分解异物。含台盼蓝的淀粉肉汤，可使腹腔中有较多的吞噬细胞，以供观察吞噬活动。【实验用品】1材料：小白鼠、1%鸡红细胞悬液2试剂：6%的淀粉肉汤（含台盼蓝），0.9%生理盐水3仪器设备：显微镜、注射器、注射针头、吸管、试管架、解剖刀、解剖镊、载玻片、盖玻片、记号笔【方法步骤】1实验前二天，每天向小鼠腹腔注射6%淀粉肉汤（含台盼兰，起标记作用）1ml 以刺激腹腔产生较多的巨噬细胞（此步由教师在实验前进行完毕）。2实验时，每组取一只上述处理的小鼠，腹腔注射1% 鸡血悬液0.51ml，注射后轻揉小鼠腹部以使红细胞悬液分散均匀。320 分钟后，用颈椎脱臼法处死小鼠，迅速剖开小鼠腹部，向腹腔部注射0.51ml 生理盐水，用吸管轻轻使生理盐水与腹腔液混匀。4用吸管抽取腹腔液，滴片，然后盖上盖玻片。5镜检【实验结果】在高倍镜下可见有许多较大的圆形和形状不规则的巨噬细胞，因未染色细胞核不易见到，其胞质中含有数量不等的兰色圆形小颗粒（即吞入的含台盼兰的淀粉肉汤所形成）；还可见少量黄色椭圆形有明显细胞核的鸡红细胞，慢慢移动玻片标本，仔细观察视野中的巨噬细胞表面，有的红细胞已部分被吞入；有的巨噬细胞内已吞入了一个或多个红细胞形成吞噬泡。未被吞噬的鸡红细胞和吞噬了鸡红细胞的巨噬细胞【实验报告】1镜检时，你能在视野中看到几种类型的细胞？绘图说明巨噬细胞吞噬过程。2巨噬细胞将如何进一步处理被吞噬的红细胞？实验九：小鼠骨髓染色体标本的制备与观察【课前预习】1秋水仙素的作用是什么？20.4的KCl 溶液起什么作用？【目的要求】掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法，了解各操作步骤的原理；识别小鼠染色体的数目及特点。【基本原理】在真核生物中, 染色体的数量和形态具有物种的特异性, 迄今一直可以此作为物种分类的基本依据之一。染色体作为遗传物质-DNA 的载体, 对生物的遗传、变异、进化和个体发生, 以及细胞的增殖和生理过程的平衡控制等都具有十分重要的意义。每一个物种的细胞一般都有一定数目、形状和大小的染色体。将体细胞核中全部染色体按照其大小、着丝粒位置，以至带型有序地排列起来，此模式图象排列即为核型（karyotype）或染色体组型。核型分析均是以中期染色体为标准，对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图象，并将其剪裁排列即成。华裔学者庄有兴（Joe Hin Tjio）和瑞典学者A.Levan 合作, 利用低渗法研究胎儿肺组织的染色体标本制做方法，终于在1956 年首次确定了人类的染色体数目是46 条，而不是前人所主张的48 条，这为后来的人类核型研究奠定了基础。自身正处于活跃分裂状态或用植物血球凝集素（phytohemagglutinin，PHA）处理后处于分裂状态的组织或细胞，均可用于染色体标本的制作与分析。在正常动物体中，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织，可不经PHA 处理直接用来制作染色体标本。但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些。骨髓细胞具有高度的分裂活性，经秋水仙素或秋水酰胺处理后，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。对于骨髓染色体标本的制作，一般包括以下几个要点：1）用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期，使中期染色体停留在赤道面处；2）用低渗法使将细胞膨胀，再经固定液固定，尽可能使染色体的结构保持不变，在滴片时细胞被胀破，使细胞的染色体铺展到载片上；3）空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平，经Giemsa 染色后便可观察到染色体的显微图象。【实验用品】1器材：解剖器具、注射器、离心机、离心管、恒温水浴箱、载玻片、酒精灯等；2试剂 0.1%秋水仙素溶液、Carnoys 固定液（甲醇：冰醋酸3：1）、0.075 mol / L KCI 溶液、Giemsa染液等。3材料：小鼠【方法步骤】1取小白鼠，于实验前34 小时，腹腔注射秋水仙素（按每克体重4 微克）。2用颈椎脱臼法处死小白鼠，取其股骨及肱骨，去掉骨上的肌肉。3将骨剪碎于10ml 的0075 mol/L 氯化钾溶液中；剪碎吹打过滤于刻度离心管中（用两层擦镜纸过滤）。4放入37水浴锅中静置30 分钟。5取出加入新配制的卡诺固定液（甲醇3：冰醋酸1）。用吸管轻轻混匀进行预固定，然后以1000 转分钟离心9 分钟，弃去上清液。6加固 定液8 毫升，混匀，静置20 分钟，以1000 转分钟离心9 分钟，弃去上清液。7加入新配固定液8 毫升（视细胞多少而定）制成细胞悬液，用吸管吸取细胞悬液，滴23 滴于预冷的载玻片上，并吹散细胞。将载玻片在酒精灯上微烤。再用电吹风将标本吹干（或空气干燥）。8滴Giemsa 染液68 滴于载玻片上，室温下染色3 分钟左右，自来水冲洗，用电吹风吹干（或空气干燥）。（注：鸡染色体的制作方法基本相同）。9将制好的玻片标本在低倍镜下观察，然后换高倍镜找到分散良好的分裂相，再转油镜仔细观察。【实验结果】在显微镜下，染色体被染成紫红色，胞浆完全不着色。对于分散好的染色体, 其间相互散开, 短臂收缩适中, 二条姐妹染色单体大致平行分离, 着丝粒清晰可见。小鼠的染色体数为40 条，多为端部和亚端部染色体，只有2 对亚中部着丝粒染色体。【实验报告】1通过对自己制做的小鼠染色体标本观察，总结小鼠染色体的形态特征。2对于分散好的染色体，进行染色体计数。3请你分析一下在本实验中造成染色体标本制作不佳的可能原因有哪些？附 染色体标本制做质量不佳的可能原因：1秋水仙素用量太多或处理时间过长，都会导致染色体的过分缩短或着丝点迅速裂解，最终使染色体被破坏或溶解。2低渗处理极为重要，低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度时, 细胞会破裂，成膜上浮；不足时则染色体积在一起，因此，低渗处理直接影响染色体分散之好坏。3离心速度太高或离心时间过长。细胞团块不易打散；速度过低或离心时间过短, 使 细胞不易沉降，会失去大量分裂相。4固定液要随用随配, 固定彻底后再打散细胞团块, 否则细胞容易破碎, 染色体分散亦受到影响。5载玻片如有油脂或冷却不够亦影响的铺展。固定（fication）目的是保持细胞自然形态，防止细胞自溶和细菌所致的腐败；固定液能沉淀和凝固细胞内蛋白质和破下细胞内溶酶体酶，使细胞不但保持自然形态，而且结构清晰，易于着色。因此标本愈新鲜，固定愈及时，细胞结构愈清晰，染色效果愈好。染 色1染色的目的和原理：染色的日的是借助于一种或多种染料，使组织和细胞内结构分别着不同的染色，这样在显微镜下能清楚地观察细胞内部结构，作出正确判断。组织细胞染色原理至今尚无满意的解释，可能是物理作用，也可能是化学作用，或者是两者综合作用的结果。染色的物理作用是利用毛细管现象，渗透、吸收和吸附作用，使染料的色素颗粒牢固地进入组织细胞，并使其显色。染色的化学作用是渗入组织细胞的染料与其相应的物质起化学反应，产生有色的化合物。各染料都具有两种性质，即产生颜色；征收被组织形成亲和力。这两种性质主要由发色基因和助色基因所产生的。发色基团：苯的衍生物具有可见光区吸收带。这些衍生物显不的吸收带与其价键的不稳定性有关，如对苯二酚为无色，当其氧化后失去两个氢原子，它的分子或则变为有黄色的对醌，这种产生颜色的醌式环称为发色基团。若一种化合物含有几个环，只要其中有一个醌式环就会发出颜色，称此发色基团为色原（chromogen）.助色基团：是一种能使化合物以生电离作用的辅助原子团（酸碱性基团）。它能使染色的色泽进一步加深，并使其与被染色组织具有亲和力。助色基团的性质决定染料是酸性碱性。碱性染料具有碱性助色基团，在溶媒中产生的带色部分为带正电荷的阳离子，吻与组织细胞内带负电荷的物质结合而显色。如细胞核内的主要化学成分脱氧化核糖核酸易被苏木素染成紫蓝色，称嗜碱性。酸性染料具有酸性用力色基团，在溶酶中产生带色部分为阴离子，易与组织细胞内带正电荷部分结合而显色，此性质被称为嗜酸性，如细胞浆内订成分为蛋白质，易与伊红或橘黄结合呈红色或橘黄色。2常用染色方法：临床日常工作中较为常用的染色方法有下列3 种：（1）巴氏染色法：本法染色特点是细胞具有多色性颜色，色彩鲜艳多彩。涂片染色的透明性好，胞质颗粒分明，胞核结构清晰，如鳞状上皮过度角化细胞胞质呈橘黄色；角化细胞显粉红色；而角化前细胞显浅绿色或浅蓝色，适用于上皮细胞染色或观察阴道涂片中激素水平对上皮细胞的影响。此方法的缺点是染色程序比较复杂。（2）苏木精伊红（hemotoxylin eosin,HE）染色法：该方法染色透明度好，核与胞质对比鲜明。染色步骤简便，效果稳定。适用于痰液涂片，觖质核呈紫蓝色，胞质淡玫瑰红色，红细胞呈淡朱红色。（3）瑞特吉姆萨染色法（wrightgiemsaatain）；本方法多用于血液，骨髓细胞学检查。胞质内颗粒与核安危质结构显示较清晰。操作简便。实验十：染色体C-带技术（生技做）【课前预习】1染色体分带技术的类型及其应用？2染色体C-带的含义、显带操作及其原理？【目的要求】1了解染色体分带技术的类型及其应用2学习染色体C-带技术的显带操作及其基本原理【基本原理】C-带最初是着丝粒异染色质（centromere heterochromatin)带纹的简称，后来为结构异染色质（con