米曲霉生产糖化酶初稿.doc

年产2000吨糖化酶工艺设计论文一、绪言1.1糖化酶简介1.1.1糖化酶特性及性状葡萄糖淀粉酶又称一淀粉酶, 简称糖化酶，是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶，是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白。一般真菌产生的糖化酶稳定性比酵母高, 细菌产生的糖化酶耐高温性能优于真菌。一般糖化酶都具有较窄的pH 值适应范围, 但最适pH 一般为4.56.5，糖化酶最适反应温度为 4060，糖化酶的等电点一般范围在 pH3.77.4，这一性质具有种属特异性。糖化酶对底物的水解速率不仅取决于酶的分子结构, 同时也受到底物结构及大小的影响，碳链越长, 亲和性越大。糖化酶主要作用于a- 1,4糖苷键, 对a- 1,6 和a- 1,3 糖苷键也具有活性作用。糖化酶对底物的亲和力, 除了与酶本身的结构有关外, 还与寡糖链本身的长度有关。因此，糖化酶在工业上有广泛的应用。糖化酶为米黄色粉末，液体糖化酶为棕黄色液体。其有效成分为水溶性的酶蛋白分子，在50以下较稳定，在50下保温2小时酶活性损失3%,60半小时以上，酶活性损失显著增加。在液体中，pH为3.5-4.5时，耐热性较强；pH2.5以下时，酶的耐热性最差。糖化酶制品随作用温度升高而活力增大，超过60时又随作用温度升高而获刑急剧下降，本品最适合作用温度为60，最适合pH在4.5左右。1.1.2糖化酶结构及作用机制糖化酶是一种含甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白。它的分子量为60 000100 000。糖化酶是糖苷水解酶的一种, 它一般由催化域( catalyticdomain,C D) 、淀粉结合域(Starch- binding domain,SBD) 及连接CD 与SBD 的O- 糖基化连接域( O- glycosylatedlinker domain) 组成。黑曲霉、泡盛曲霉和子囊菌酵母糖化酶的催化域构型类似, 都有12 股- 螺旋参与折叠成“ 桶状”结构6。淀粉结合域对糖化酶的功能有很大影响, 如果缺失会让水解非水溶性底物的速度明显降低, 而降解水溶性底物的速度不变。SBD 上有两个结合位点, 可以结合两分子的底物。SBD 扭转了淀粉链的方向, 使更多底物向催化域中心靠近。糖化酶的连接域( Link domain) 起连接CD 与SBD 的作用, 连接域一般被O- 糖基化修饰。糖化酶作用于淀粉、糊精、糖原分子的非还原型末端, 依次切开- 1, 4 糖苷键, 生成葡萄糖。糖化酶底物专一性较低, 除了能从非还原性末端断裂- 1, 4 糖苷键外, 也能水解- 1, 6 糖苷键和-1, 3 糖苷键, 但是相对水解速度较慢, 水解- 1, 6糖苷键的比速率仅为- 1, 4 糖苷键的0.2%。它们也能作用于支链淀粉的- 1, 6 键, 但是速度也很慢, 因此分解产物都是葡萄糖。糖化酶对淀粉的分解能力与酶活力、吸附性、解支能力、原料的性质、温度、pH 等糖化工艺条件有关。底物的水解速率主要受底物分子的大小及结构的影响, 同时也受水解碳链序列中下一个键的影响。其底物亲和性与底物的碳链长度呈线性关系, 碳链越长底物亲和力就越大; 糖化酶所水解的底物分子越大其水解速度就越快, 而且酶的水解速度还受到底物分子排列上的下一个键影响, 邻近- 1 , 4 链的- 1, 6 糖苷键较独立的- 1, 6 链更易被打开。1.1.3糖化酶的应用糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；还大量用于生产各种规格的葡萄糖。它在食品生产中有广泛的应用。我国传统酿酒生产大多使用淀粉质原料, 以曲为糖化剂, 采用固态发酵法, 但成本高, 出酒率低。糖化酶的应用使粮醅入酵后发酵升温快, 幅度大, 提高原料的出酒率, 缩短发酵周期。在湘泉浓香型白酒的混蒸混烧工艺中添加糖化酶, 结果发现有助于提高己酸乙酯的含量, 抑制乙酸乙酯的生成, 取得了产量与质量的双赢。在混蒸混烧工艺中添加糖化酶, 在转型时可以明显缩短转型期, 在生产中可以使酒醅发酵更彻底、更充分, 提高出酒率。糖化酶应用于黄酒生产， 出酒率高达92.06%, 感官鉴定也得到了优。传统小曲酒的生产, 通常是以传统小曲作为糖化剂, 采用先培菌糖化后发酵工艺, 有学者用糖化酶代替部分小曲作为发酵剂, 同时对培菌糖化的时间、温度、用曲量进行了研究, 对提高淀粉的利用率和小曲的产量均有增长。在啤酒生产上可以应用糖化酶, 采用多温度段糖化工艺, 提高了麦汁可发酵糖的比例, 制成了风味独特的干啤酒。在食用醋生产中, 应用糖化酶可以解决企业自制酒母质量不稳定和夏季高温等生产难题, 使食用醋生产正常进行。糖化酶在天然产物提取中也有一定的作用。因为皂素在植物中大多以糖苷的形式存在, 游离的甙元极少, 为了提高皂素的收率, 可以在酸水解之前先对黄姜原料进行酶解, 这样既可以减少酸用量, 又能明显地提高皂素的收获率与质量。山药汁容易沉淀并有令人难以接受的臭味。针对这个问题有研究人员将山药干片先用水提取, 然后再用酶水解, 应用此工艺加工出来的山药汁, 沉淀少、无臭味, 并且酶用量少、酶解时间短。在医学上，糖化酶也有重要的用途，它可以用过消化药物的成分，来帮助消化；在检验鼠疫菌过程中，用尿嘧啶糖化酶来防止PCR产物污染。1.1.4糖化酶生产的研究状况葡萄搪淀粉的底物专一性较低, 不仅能从淀粉非还原端水解 -1,4-葡萄糖苷键, 且能部分地水解 -1,6-, 甚至 -1,3-葡萄糖苷键, 将直链或支链淀粉水解为右旋糖。该酶最初研究始于1938 年, 人们试图用真菌淀粉酶取代麦芽生产酒精。1941年用米曲霉麸曲生产酒精, 并部分取代了麦芽生产。1951年Phillips和Caldwell和Kerr等分别从德氏根霉和黑曲霉分离得到了类同于-淀粉酶的淀粉水解酶, 分别称葡萄糖淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶。两者均水解淀粉为右旋糖。从水解底物淀粉的能力, 研究者将来源不同的真菌糖化酶分为两组, 即德氏根霉型和黑曲霉型, 前者水解淀粉可达100% , 而后者水解淀粉仅80% 左右。为了寻找既经济有效，又能充分发挥糖化酶菌种的生产能力的发酵工艺，国内外科学工作者作了大量的研究与探索。东德研究发现，先将预培养的双抱拟内袍霉种入PHS.5、玉米浆3%、菜籽油5%、磷酸氢二按0.3%和磷酸二氢钠0.2%的培养液中，于30搅拌通气24小时后，加入预培养的米曲霉、l%淀粉和0.5%碳酸钙连续发酵72小时，浓缩的发酵清液中含糖化酶3000u/ml和一淀粉酶7000U/ml。印度研究了用农副产物制出的黑曲霉产糖化酶培养基，结果发现，联合使用以上各种不同物料、糖化酶产量为半合成培养基的10一15倍。用10%麦鼓浸出物和8%脱脂大豆粉组成的培养液、产量最高。在国内，山西省生物研究所许艳萍等用黑曲霉变异株Uvll一22和UVll一33进行了用玉米粉、高梁粉、土豆淀粉、甘薯淀粉、糊精、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖作碳源的比较和用豆饼粉、玉米浆、米糠、麦皮、蛋白陈、酵母膏、硝酸按、尿素等不同N源的比较，C源以玉米粉为好，有机N源以豆饼粉和玉米浆为最好，无机氮是硝酸按最好。另外，还进行了玉米粉、玉米浆、豆饼粉的不同配比试验，结果发现，当它们的浓度分别为10%、3%、4%时效果最好，最高摇瓶酶活可达10353U/nll，应用于15m3发酵罐酶活可达8792U/ml。四川省食品发酵工业研究设计院研究玉米粉、花生枯、玉米浆的不同配比对黑曲霉变异株N87一67生产糖化酶的影响时发现，当其浓度分别为18%、2.5%、2.5%时，20m3自吸式发酵罐生产能力可达19259u/ml，10m3罐可达20355u/ml。1. 1.5糖化酶生产的重要性糖化酶在工业生产中的应用非常广泛，在酒精工业中糖化酶制剂可代替自制麸曲简化生产工艺，提高生产效率； 在淀粉糖工业中，利用糖化酶水解淀粉的高度专一性，避免无机酸水解淀粉糖苷键的随机性， 控制糖浆产品的糖分组成， 提高产品纯度，克服酸水解时对生产设备的腐蚀； 在干啤酒酿造过程中，可提高麦汁中可发酵性糖的含量； 在白酒和曲酒生产中，以糖化酶代替酒曲，可以提高出酒率，降低粮耗，改善酒的口味，提高质量； 在味精、柠檬酸等生产过程中，首先利用淀粉酶、糖化酶将其主要原料淀粉转化成低分子量糖类，再经发酵得到谷氨酸和柠檬酸。因此，糖化酶在轻工、食品、医药、发酵等行业中具有广泛的应用价值，受到国内外学者的高度重视。了解影响糖化酶生产的各种因素，熟悉并掌握米曲霉生产糖化酶的生产工艺，优化改善生产过程中的部分环节，设计出一条合理的生产工艺流程，提高糖化酶的生产量，创造更高的经济效益就县得十分重要。1.2糖化酶产生菌糖化酶具有的经济价值和某些特殊用途，一直受到国内外许多研究人员的关注，要实现其大规模工业化生产, 关键在于获得能使生淀粉有效水解的糖化酶，目前糖化酶产生菌有曲霉、根霉、噬纤维菌属和芽孢杆菌等, 真正用于工业生产的微生物很少, 主要原因是菌种的稳定性和产酶量往往很难达到工业化生产的需求。根霉和曲霉是糖化酶的主要生产菌株, 而曲霉以米曲霉和黑曲霉应用最为广泛，也是研究得最多的生产菌株。在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得, 从细菌中也分离到热稳定的糖化酶, 人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。就目前而言，生产上普遍应用黑曲霉。虽然目前生产上普遍应用黑曲霉，但米曲霉在生产糖化酶时有其自身优势。1.2.1米曲霉性质特征及应用1.2.1.1米曲霉的生物学特征 米曲霉是一种好气性真菌，属于半知菌亚门曲霉属。菌丝一般呈黄绿色，后为黄褐色，分生抱子梗生长在厚壁的足细胞上，分生抱子头呈放射形，项囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生抱子球形平滑，少数有刺。米曲霉菌落生长快，质地疏松，菌落生长较快，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处，是一种重要的工业微生物，其主要特征是菌丝体具有横隔。在土豆天然培养基上培养开始为白色的菌丝体，两天后即开始产抱子变绿;从平板反面看成同心圆，内圈颜色较深，外圈颜色很浅成白色。生长pH6.5-6.8，最适温度32-35，产酶温度28-30。米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产乳糖酶外，还可产蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、纤维素酶、植酸酶等。1.2.1.2米曲霉的应用米曲霉具有丰富的酶系，能产生多种稳定性高，能耐较高温度蛋白酶和糖酶，是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、果胶酶和曲酸等，引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。米曲霉在工业上的应用:用于发酵生产豆豉、豆酱；与黑曲霉、绿色木霉复合发酵用于酱油生产；用于饲料工业；用于酿酒制曲、生产低醇乳糖饮料。（1）生产乳糖酶消除乳糖不耐症，促进糖类的吸收由于乳糖不耐症的普遍存在，许多人无法接受牛乳这种天然且具有良好平衡性的食品，成为阻碍我国乳品工业发展的主要障碍之一。乳糖酶能将乳糖水解为易吸收和甜味品质好的半乳糖和葡萄糖，又能通过半乳糖昔反应合成低聚半乳糖，可以有效的消除人体对乳糖不耐症的症状。关于这方面的研究近年来倍受人们的关注。（2）用于发醉生产豆豉、豆酱豆豉、豆酱是我国古老的大豆发酵制品之一，营养丰富，药食兼用，对我国人民的饮食文化和医疗保健发挥着重大作用。在其传统的酿造工艺中，米曲霉用来酿造豆豉、豆酱在我国应用最早最广。由于古时没有显微镜，看不见微生物的个体形态，但人们通过微生物的群体形态“黄衣”来控制微生物的生长繁殖。随着科学发展，在前人基础上相继出现改良的多菌制曲和无盐固态发酵工艺，已达到相当高的水平，在生产实践中产生了良好的效果。（3）与黑曲舞、绿色木霉复合发醉用于告油生产酱油酿造主要靠米曲霉的作用，在米曲霉生产过程中能分泌多种酶系，其中包括重要的蛋白酶。天然发酵酱油就利用蛋白酶的水解作用，将豆类中的蛋白质降解成多肤、氨基酸等可溶性含氮物，且口味好，营养丰富，是营养性风味调料的发展方向。米曲霉与黑曲霉共同作用生产酱油，不但提高了蛋白质利用率，而且提高了酱油产量和风味。米曲霉与绿色木霉混合制曲生产酱油，由于绿色木霉产生丰富的纤维素酶、半纤维素酶破坏了包裹蛋白质原料的细胞壁，使蛋白质、淀粉类游离出来，被米曲霉产生的蛋白酶和淀粉酶充分分解，提高了蛋白质的利用率。纤维素酶还能将原料中的纤维素部分转化成糖，有利于美拉德反应，既提高了酱油还原糖又增加了色度。（4）用于饲料工业米曲霉辅以细菌和酵母菌来发酵猪血粉及其配料，可生产出蛋白含量高达69%，香味浓郁，且富含游离氨基酸，维生素D3、烟酸、Fe等，消化率高、适口性好的发酵血粉饲料，作为禽畜高蛋白源或饲料添加剂。（5）发醉生产曲酸曲酸是微生物好氧发酵产生的一种具有抗菌作用的有机酸，在食品、化妆品、医药等领域都具有重要的用途。它易溶于水，并具有较强的广谱抗菌能力和良好的热稳定性，而且不会影响食品的口味、香气及质感，有很好的食品保鲜防腐功用。（6）用于酿酒制曲曲霉可用作糖化剂发酵酿造酒，曲霉中用的较为普遍的是米曲霉。米曲霉在酿酒过程中曲的主要作用是为酒母和酒醛提供酶源，使原料中的淀粉、蛋白质和脂肪等溶出和分解;其次米曲霉在繁殖和产酶的同时，产生葡萄糖、氨基酸、维生素等成分，为酵母提供营养来源，并生成有机酸、高级醇及酷类等成分;米曲霉产生的曲香及辅料成分，可作为酒的前体物质赋予酒以独特的风味。1.2.2黑曲霉性质及简介黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。生长适温37，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产。总之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。黑曲霉广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。黑曲霉是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。 生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。可用来测定锰、铜、钼、锌等微量元素和作为霉腐试验菌。干酪成熟中污染会使干酪表面变黑、变质，对奶油也会产生变色。1.2.3米曲霉和黑曲霉比较（1）两种曲霉比较黑曲霉UV-48和米曲霉花-4的酶系及糖化性质。米曲霉具有远比黑曲霉UV-48高的液化酶活性和略高的糖化酶活性, 但米曲霉花-4 生产酶时对温度比较敏感, 其辅助酶系（纤维素酶和蛋白酶）生产早于黑曲霉UV-48 而。米曲霉花-4液化酶热稳定性低, 糖化酶热稳定性高, 但二者均耐酸酸；黑曲霉UV-48液化酶热稳定性高但不耐酸, 糖化酶热稳定性低但耐酸和碱。（2）米曲霉优势曲霉可用作糖化剂发酵酿造酒，曲霉中用的较为普遍的是米曲霉。米曲霉在酿酒过程中曲的主要作用是为酒母和酒醛提供酶源，使原料中的淀粉、蛋白质和脂肪等溶出和分解;其次米曲霉在繁殖和产酶的同时，产生葡萄糖、氨基酸、维生素等成分，为酵母提供营养来源，并生成有机酸、高级醇及酷类等成分;米曲霉产生的曲香及辅料成分，可作为酒的前体物质赋予酒以独特的风味。2、 米曲霉生产糖化酶方法糖化酶制剂的生产有固态发酵法和液体深层发酵法2大类。2.1液体发酵液体深层发酵法又称沉没培养法或通气培养法。这是目前我国糖化酶制剂生产中广泛采用的方法。这种培养方法是将培养基放在装有搅拌和通气装置的密封发酵罐内，营养物质和pH值的调节可以随时通过相应的管道来进行。深层发酵法具有机械化程度高、罐内条件容易控制、生产周期短和酸的产量高等优点。2.2固体发酵糖化酶固体发酵采用静态固体发酵，静态固体发酵生产线由空气静化过滤系统、遂道式发酵间、配料间、粉碎间、包装间、菌种恒温培养室、产品干燥室、卧式蒸汽灭菌柜、无菌水罐、供热、供水、供电等系统组成，其工艺路线为：原料粉碎配料分盘灭菌冷却接种发酵干燥粉碎过筛包装成品。3、 糖化酶生产工艺3.1工艺流程原料配料发酵罐消毒冷却接种通风培养酶液加硫酸盐析过滤湿酶成型干燥成品粗酶制剂。3.2糖化酶下游处理技术糖化酶的处理工艺过程分为预处理、固液分离、液体浓缩、酶的沉淀干燥四个工序。国外采用的无机絮凝剂有硫酸铝、碱式氯化铝、氯化铁、锌盐等能在水中形成各种氢氧化物凝胶;采用的有机高分子絮凝剂有聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸(或钠盐) 、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酞胺等。其中聚丙烯酞胺最常用。国内使用的无机澄清剂有高岭土、活性炭酸性白土和硅藻土。有机高分子絮凝剂有聚丙烯酸胺、梭甲基纤维素等, 但以聚丙烯酞胺最常用。国内外最普遍采用的固液分离设备是板框压滤机, 除此以外, 国外还有管式、多室式、碟式及篮式离心机, 国内主要采用篮式离心机, 也有少数管式离心机的厂家。国内外糖化酶的浓缩方式已从蒸发浓缩发展到超滤浓缩。目前采用的超滤装置有搅拌室式、浅道式系统、套筒膜式和中空纤维。沉淀酶方式, 国内外仍普遍用了、硫酸铵或硫酸钠等中性盐类盐析糖化酶。成品糖化酶可分为液体酶和固体酶两种，而固体酶的制备方法又可分为盐析法、有机溶剂沉淀法及吸附法等。采用一条合理的提取工艺，可制备系列酶产品以满足不同行业的需求及降低成品的成本，目前国内对液体酶产品采用的浓缩方法有2种，一种为依靠热源来蒸发产品中的水分。另一种为利用渗透膜超滤除去产品中的水分。比较2种方法，前者设备投资大、耗能多；而后者投资少、耗能低，且操作简单、清洗方便、维修及更换成本低，产品收率高。渗透膜超滤浓缩方法，絮凝工艺是提取工艺中最关键的一步，直接决定板框过滤等工序的工作与产品的质量。3.3糖化酶生产存在的问题传统的糖化酶提取采用盐析法，盐析法将硫酸铵投入放罐的发酵液中，产品制成固体剂型。制成固体剂型优点是易于保存， 在存放过程中酶的稳定性较好。但是产品含有大量的盐及培养基残渣，不仅不符合食品卫生要求，而且产生大量的废水，污染环境、腐蚀设备。近几年由于硫酸铵紧缺、价格上涨使许多酶制剂生产厂家陷入困境，已经成为迫切需要解决的问题，这就需要设计一条新的生产工艺路线。在临床上，糖化酶制剂用于消化作用。食物经过消化道，在消化、吸收的过程中需要消化酶的参加。例如碳水化合物在口腔及小肠接受淀粉酶及双糖酶的作用，分解为葡萄糖。所以，萎缩性胃炎、胃无力、胃下垂或由肠道疾病而导致消化不良的，可以服用含糖化酶的药物。由于糖化酶在医学方面的应用，需要提高其纯度，所以生产高纯度的糖化酶就成为工业生产的要求。二、糖化酶生产方法和工艺2. 1、发酵方法的选择酶的种类虽然繁多，产酶微生物的菌种又各导，但其发酵生产的工艺流程大体是相似的，一般有固态发酵法和液体深层发酵法之分。但是，对于所选用的菌种，究竟采用固态发酵法还是液体深层发酵法，这应由微生物的种类和酶的种类不同而决定。微生物酶制剂生产的一般工艺流程如图所示：直接发酵，或经酸水解酶水解为糊精和糖固态发酵（通风式、曲盘、帘子）麸皮培养基为主要原料，2045培养1-7天成品曲原料淀粉原料其他原料原始菌种试管培养扩大培养液体深层发酵（冷却）防腐剂、助滤剂（或凝聚剂）除菌体（倾析、过滤、离心）用水抽提弃取滤渣干燥粉碎麸皮曲酶液添加澄清促进剂倾析、过滤、离心浓缩后加溶剂沉淀酶盐析加硫酸钠或硫酸铵添加稳定剂、防腐剂稀释酶液真空浓缩加粘合剂成型粒状酶制剂干燥粉碎、过筛、加填料精制酶粉液体酶制剂喷粉（添加充料）粉碎、过筛粗制酶粉2. 1. 1液体深层发酵（1）液体深层发酵法简述液体深层发酵法是目前最广泛应用的微生物酶制剂发酵的生产方法，也是其他需氧发酵产品如抗生素、氨基酸、有机酸、维生素等最常用的生产方法。液体深层发酵法的要点是：将原料加水调制成浆状(即培养基)投入发酵罐，经蒸汽灭菌，保压冷却到25-40，接入预先培养成熟的种子，在边搅拌边通入无菌空气下进行发酵。菌种在不同生理时期的发酵温度通过夹套用冷水加以调节。发酵全过程必须严格控制无菌条件、温度、pH、产酶率、以及培养基关键组分的消耗比例等各项工艺指标，定期取样，镜检化验。如有必要，可以随时流加营养成分或诱导物等实行定向发酵，流加缓冲液或酸碱溶液调节生长或产酸pH。当酶活性出现高峰稳定值，即表示发酵最适终止期的到来。待发酵结束，一般应及时处理。（2）液体深层发酵的优点液体深层培养的特点是窑易按照产酶菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气搅拌、瀑度与培养基中氢离子浓度等影响，选择最佳培养条件。通过培养条件的研究，可以大幅度提高酶的产量。液体深层发酵法机械化程度较高，不仅发酵条件易较控制，而且酶的产率高、质量好，因此，许多酶制剂产品都趋向采用液体深层发酵法来生产。2. 1.2固体发酵（1）固态发酵简述固态发酵法又称曲法培养，是指利用自然底物做碳源及能源,或利用惰性底物做固体支持物,其体系无水或接近于无水的任何发酵过程。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术，近年来又有新的发展。固态发酵法通常在麯房内将物料铺成薄层在麯盘或帘子上，然后置于多层的架子上。原料（麸皮等）可以采用长牙蒸煮或蒸汽灭菌（30-120min）后，降温到25-40摄氏度，接种培养17天。培养基含水量大约保持在60左右，不宜过量，否则物料层将失去应有的疏松结构，便得十分紧密，阻碍空气流通。厚层或对及培养是时可以添加1520的谷糠做疏松材料，以改善通气效果。培养过程中，微生物边繁殖边产酶，并释放大量的发酵热和二氧化碳，在麯盘或帘子的不同位置，以及厚层的不同部位，物料的品温分布是不均匀的，应及时采取降温措施。在正常的情况下，产酶菌株占有绝对的生长优势，潜在的杂菌处于劣势，即使基质局部染菌也无关大局。但是如果风量过大，曲层因失水而变得干燥，菌丝体发育滞缓且容易萎缩。如果冷风温度与物料品温相差悬殊，旺盛繁殖的初生菌丝受骤冷而卷曲，复苏困难。如出现这种情况，杂菌就有可能滋长蔓延，有导致酸败和腐败的危险。因此，温度及湿度的控制是固态发酵的关键。为了提高生产效率，节省劳力，也可采用通风制曲法生产。（2）固态发酵法的优缺点与液体发酵相比，固体发酵存在一些缺点：第一，固态培养基不容易搅拌均匀，发酵期间传质、传热及氧传逆率都较慢，尤其是在发酵过程中会产生大量热，导致局部温度过高，水分活度下降以及溶氧不足，影响糖化酶活力；第二，发酵周期过长，劳动强度过大；第三，种曲接种过程中，搬运种曲会引起孢子到处飞扬，造成周围环境的污染，损失较大。2. 1. 3发酵方法的确定综上所述，液体培养与固体培养，各有所长，各有所短，究竟采用哪种方式，需要根据菌种性能和酶系类型，还要结合其体条件(如投资、设备、器材等)因地制宜。一般说来多数霉菌和一些细菌、放线菌利用固态培养法可能获得较高的酶活性。因此，通过对液体发酵和固体发酵的优缺点比较，我们可以总结出适合米曲霉生产糖化酶的发酵方法，以液体发酵最为适宜。2 . 2糖化酶的预处理2. 3生产中关键技术的确定 絮凝等技术 2. 4、工艺流程的确定工艺流程如下: 无菌空气制备系统菌种斜面试管摇瓶培养种子罐发酵罐原料粉碎配料发酵液过滤超滤浓缩酒精沉淀粉状型成品包装液状型成品气流干燥工艺流程说明:液体深层发酵生产糖化酶的新工艺主要有四大部分组成,即无菌空气系统、原料处理、菌种与发酵、发酵液内糖化酶的提取。无菌空气制备系统 空气经压缩机压缩至一定压力以克服过程系统的一系列阻力后，先进入贮气罐、冷却器、油水分离器、气液分离、空气加热器、空气总过滤器、分过滤器，最后进入种子罐和发酵罐。原料处理 生产的主要原料，如玉米、豆饼和麸皮等农副产物，均需经粉碎后，再通过筛子筛选。菌种与发酵 菌种采用米曲霉，在麸皮培养基中培养成熟后备用。为了扩大接种量，要先做种子罐。种子罐内加入培养基，经实罐灭菌，冷却至培养温度后，接入上述种子，按要求的温度与通风量进行培养。发酵官网20m 按总浓度15%的原料投入发酵罐，经消毒冷却后，接入上述种子培养液，经通气搅拌，在控制ph值、温度下培养发酵结束后，放入贮存罐内。在发酵过程中严格控制产量和质量。三、物料衡算3. 1经济分析3. 2生产设备、设施3. 3物料衡算内容3. 3. 1原料消耗计算3. 3. 2发酵罐体积选择3. 3. 3发酵物料衡算3. 3. 4成品与发酵液量的计算3. 3. 5热量衡算四、发酵罐的设计4. 1发酵罐尺寸设计4. 1. 1发酵罐体积计算4. 1. 2发酵罐各尺寸设计4. 2发酵罐其它相关参数的计算和设定五、生产设备及设备的选型5. 1生产设备5. 2各种设备的选型工艺计算1. 物料衡算技术指标实际投料浓度15发酵液糖化酶活性80009000u/ml发酵周期4天生产周期5天提取总收率68%发酵罐装料系数80%发酵清夜收得率88%生产天数300天/年物料衡算发酵液含酶量按8400单位/毫升，平均总收率68%，产品酶计算单位取104单位/克，则每立方米发酵液产糖化酶为： 年产2000吨酶，则每年需发酵液体积为：2000108/571.2=3500（m3）每年以300天计算，则每天需发酵液体积为：3500/300=11.67（m3/d）如果装料系数为80%，生产周期120小时，则发酵罐总体积为：取20立方米发酵罐4只，装料系数为80%，则每年生产罐批数为：按年生产300天计算，则219/300=0.7（罐/天） 即三天内处理2只发酵罐，糖化酶发酵采用分批发酵法，所以以下每批发酵罐内物料为基准进行物料衡算：20吨罐装也为80%，其发酵液量为：2080%=16(t)湿固形物重量 社发酵罐内固形物4.5%，则含水50%的湿固形物重为：清酶液重量 设损失为2%:（16-1.44）（1-2%）=14.27（t）清酶液比重取1.023吨/m3则清酶液体积为：14.27/1.023=14（m3）浓缩后体积 清酶液浓缩5倍，则浓缩酶液体积为14/5=2.8（m3）酒精添加量 设酒精添加体积比为1:2.5，则酒精添加体积为： 2.82.5=7（m3）酒精比重取0.816，则酒精添加量为：70.816=5.722（t）生淀粉添加量 按处理液体积的1%计，生淀粉添加量为：（2.52.8+2.8）1%=100（kg）酒精液中含酶固形物浓度： 过滤后的湿酶重量（含水45%，损失5%） 湿酶比重为1.2吨/m3，则湿酶体积为： 1.25/1.2=1.05（m3