增强免疫力功能试验.doc

增强免疫力功能试验一、 实验目的与要求1 熟悉动物实验的操作技术与要求；2 掌握保健食品增强免疫力功能检验与评价的方法。二、 实验原理1 免疫力是人体免疫系统进行自我保护的一种能力，主要的作用之一是指身体抵抗细菌或病毒等感染的能力。健全的免疫系统主要有三大功能： 1) 防御功能保护机体不受损害，帮助机体消灭外来的细菌、病毒以及避免发生疾病；2) 稳定清洁功能不断清除衰老死亡的细胞，保持体内的净化更新；3) 监控功能及时识别和清除染色体畸变或基因突变的细胞，防止肿瘤和癌变的发生。2 机体的免疫力功能包括细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能和NK细胞活性4个方面，通过检测动物实验后免疫系统的变化来判断样品是否具有增强免疫力的功能。三、 实验仪器与试剂仪器试剂（1） 200目筛网（2） 24孔培养板（3） 96孔培养板（平底）（4） 玻片架（5） 微量血凝实验板（6） 血色素吸管（7） 手术器械（8） 打孔器（9） 计时器（10） 二氧化碳培养箱（11） 超净工作台（12） 恒温水浴（13） 离心机（14） 酶标仪（15） 721型分光光度计（16） 显微镜（1） 生理盐水（2） 丙酮（3） 甲醇（4） 盐酸（5） 异丙醇都氏试剂（碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL）（9） Na2CO3（10） RPMI1640培养液（11） 小牛血清（12） 2巯基乙醇（2ME）（13） 青霉素（14） 链霉素（15） 刀豆蛋白A（ConA）（16） Hanks液（17） PBS缓冲液（pH7.27.4）（18） SA缓冲液（19） 琼脂糖（20） 印度墨汁（21） SRBC（22） 鸡红细胞（23） YAC-1细胞（24） 补体（豚鼠血清）（25） MTT（26） Giemsa染液；（27） 乳酸锂或乳酸钠；（28） 硝基氯化四氮唑（INT）（29） 吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）（30） NAD（31） 0.2mol/L的TrisHCl缓冲液（pH8.2）（32） 1%NP40或2.5%Triton四、 实验方法与步骤1 样品处理与给予方式（1） 对于水溶性样品，用蒸馏水配制成溶液或悬浮液灌胃给予动物；对于脂溶性样品，用调和油配制成溶液或悬浮液灌胃给予动物。（2） 受试样品推荐量较大，超过实验动物的灌胃量、加入饮水或掺入饲料的承受量等情况时，可适当减少受试样品中的非功效成分的含量。（3） 对于含乙醇的受试样品，原则上应使用其定型的产品进行功能实验，其三个剂量组的乙醇含量与定型产品相同。如受试样品的推荐量较大，超过动物最大灌胃量时，允许将其进行浓缩，但最终的浓缩液体应恢复原乙醇含量。如乙醇含量超过15%，允许将其含量降至15%。调整受试样品乙醇含量应使用原产品的酒基。（4） 液体受试样品需要浓缩时，应尽可能选择不破坏其功效成分的方法。一般可选择6070减压进行浓缩。浓缩的倍数依具体实验要求而定。（5） 对于以冲泡形式饮用的受试样品（如袋泡剂），可使用该受试样品的水提取物进行功能实验，提取的方式应与产品推荐饮用的方式相同。如产品无特殊推荐饮用方式，则采用下述提取的条件： 常压，温度8090，时间3060min，水量为受试样品体积的10倍以上，提取2次，将其合并浓缩至所需浓度。（6） 必须经口给予受试样品，首选灌胃。如无法灌胃则加入饮水或掺入饲料中，计算受试样品的给予量。（7） 以载体和功效成分（或原料）组成的受试样品，当载体本身可能具有相同功能时，应将该载体作为对照。2 动物实验（1） 动物选择： 推荐用近交系小鼠，20g2g，单一性别，每组1015只。（2） 剂量分组： 实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10倍为其中一个剂量组，另设两个剂量组，必要时设阳性对照组。（3） 样品给予时间： 所有试验动物均食用全价营养配合饲料，动物自由摄食、摄水。给予受试物的灌胃体积为20ml/（kgBw）。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，免疫模型动物实验可适当延长。3 指标检测A ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（MTT法）1) 试剂配制i 完全培养液：RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1% Pen/Strep/Glutamine (100, liquid)及510-5mol/L的-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.07.2，即完全培养液。ii ConA液： 用双蒸水配制成100g/ml的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20）中保存。iii 无菌Hanks液： 用前以3.5%的无菌NaHCO3调pH7.27.4。iv MTT液： 将5mg MTT溶于1ml pH7.2的PBS中，现配现用。v 酸性异丙醇溶液： 96ml异丙醇中加入4ml 1mol/L的HCl，临用前配制。2) 脾细胞悬液制备： 无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，用Hanks液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于1ml完全培养液中，用台酚蓝染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3106个/ml。3) 淋巴细胞增殖反应： 将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75l ConA液（相当于7.5g/ml），另一孔作为对照，置5% CO2，37 CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/ml）50l/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装36孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2ml比色杯中，721型分光光度计上在波长570nm测定OD值。B 抗体生成细胞检测（Jerne改良玻片法）1) SRBC： 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4冰箱保存备用，可保存2周。2) 制备补体： 采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清），将1ml压积SRBC加入5ml豚鼠血清中，4冰箱放置30min，经常振荡，离心取上清，分装，-70保存。用时以SA缓冲液按1815稀释。3) 玻片涂膜： 在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖（0.5g琼脂糖加双蒸水至100ml，加热溶解），待干后放片盒可长期保存备用。4) 免疫动物： 取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min，计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC 51072108个。也可将压积SRBC用生理盐水配成2%（V/V）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml。5) 脾细胞悬液制备： 将SRBC免疫45天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hanks液的小平皿内，轻轻撕碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，离心（1000r/min）10min，用Hanks液洗2遍，最后将细胞悬浮在5ml RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5106个/ml。也可将细胞悬浮在8ml Hanks液，测定脾空斑形成数。6) 空斑的测定： 将表层培养基（1g琼脂糖加双蒸水至100ml）加热溶解后，放45水浴保温，与等量pH7.27.4的2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50l 10%SRBC（V/V，用SA液配制），20l脾细胞悬液（5106个/ml）或25l脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育11.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体（18）加到玻片架凹槽内，继续温育11.5h后，计数溶血空斑数。C 半数溶血值(HC50)的测定原理:用SRBC免疫动物后，产生抗SRBC抗体(溶血素)，与SRBC一起孵育，在补体参与下，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量.仪器和材料:721分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、都式试剂(碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000mL)实验步骤:1) SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4冰箱保存备用，可保存2周。2) 制备补体:采集豚鼠血，分离出血清(至少5只豚鼠的混合血清)，使用前将1mL压积SRBC加入到5mL豚鼠血清中，放4冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装小瓶，70保存。用时以SA液按110稀释。3) 免疫动物及血清分离:取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。45d后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。4) 溶血反应:取血清用SA缓冲液稀释(一般为200500倍)。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入10%(v/v)SRBC 0.5mL，补体1mL(用SA液按1：10稀释)，另设不加血清的对照管(以SA液代替)。置37恒温水浴中保温1530min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL，都氏试剂3mL于试管内，同时取10%(v/v)SRBC 0.25mL加都氏试剂至4mL，于另一支试管内，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。5) 数据处理及结果判定:一般用方差分析进行数据统计，溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下列公式计算，受试物组的HC50显著高于对照组的HC50，即可判定该项试验结果阳性。D 小鼠碳廓清实验1) 溶液配制i 注射用墨汁： 将印度墨汁原液用生理盐水稀释34倍。ii Na2CO3溶液取0.1g Na2CO3，加蒸馏水至100ml。2) 注射墨汁： 称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每10g体重0.1ml计算。待墨汁注入，立即计时。3) 测定： 注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20l，并立即将其加到2ml 0.1% Na2CO3溶液中。用721型分光光度计在600nm波长处测光密度值（OD），以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。按下列公式计算吞噬指数：a = 体重（肝重+脾重） k =(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)E NK细胞活性测定（乳酸脱氢酶测定法）1) CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit2) 靶细胞的传代（YAC-1细胞）： 实验前24h将靶细胞进行传代培养。应用前以Hanks液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4105个/ml。3) 脾细胞悬液的制备（效应细胞）： 无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，或用Hanks液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5ml灭菌水20s，裂解红细胞后再加入0.5ml 2倍Hanks液及8ml Hanks液，1000r/min，10min离心，用1ml含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1%冰醋酸稀释后计数（活细胞数应在95%以上），用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2107个/ml。4) NK细胞活性检测： 取靶细胞和效应细胞各100l（效靶比501），加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100l，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40或2.5% Triton各100l；上述各项均设三个复孔，于37、5%CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100l置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100l，反应3min，每孔加入1mol/L的HCl 30l，在酶标仪490nm处测定光密度值（OD）。按下式计算NK细胞活性 五、 实验结果与分析1 增强免疫力功能判定在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品增强免疫力功能。2 细胞免疫功能结果判定细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。3 体液免疫功能结果判定体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。4 单核巨噬细胞功能结果判定单核巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核巨噬细胞功能结果阳性。5 NK细胞活性结果判定NK细胞活性测定实验的两个剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。六、 注意事项1 MTT法测定ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验时，选择有丝分裂原时ConA的浓度很重要，ConA的浓度过高会产生抑制作用，不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳刺激分裂浓度。2 二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应操作时，应避免DNFB与皮肤接触。3 血清溶血素的测定时，血清稀释要充分混匀，最后一个稀释度应不出现凝集现象。4 小鼠碳廓清实验测定时，静脉注入碳粒的量、取血时间、取血量一定要准确；墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，临用前应摇匀；使用新的墨汁时，应在实验前摸索一个最适墨汁注入量，即正常小鼠在2030min内不易廓清，而激活的小鼠可明显廓清。5 NK细胞活性测定时，靶细胞和效应细胞必须新鲜，细胞存活率应大于95%；比色时环境温度应保持恒定；LDH基质液应临用前配制；在一定范围内，NK细胞活性与效靶比值成正比，一般效靶比值不应超过1001。一原理溶血空斑实验是体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的一种方法，即将经绵羊红细胞（SRBC）免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，于37作用下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。每个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑实验具有特异性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。二材料与试剂1、材料平皿（直径5.5cm 1.5cm），温箱（37），水浴箱（45），离心机，显微镜及白细胞计数器，18g25g昆明系小鼠等。2、试剂（1）SRBC悬液 取无菌脱纤绵羊血（或阿氏液保存的血液），用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗3次，每次2000r/min离心5min，最后取压积红细胞，悬于灭菌pH值7.2PBS（含Ca2+、Mg2+）中，使成为20%浓度，经细胞计数后，调整细胞浓度为2.00109个/ml；（2）0.1mol/L pH值7.2PBS（含Ca2+、Mg2+）；（3）低层和顶层琼脂 将抗补体作用小的琼脂（日本琼脂粉或旅大水产制品厂的产品）用PBS配成1.4%和0.7%两种浓度。将0.7%的琼脂分装小试管，每管1.5ml备用；（4）DEAE-右旋糖酐 分子量5万，用蒸馏水配成1%浓度备用；（5）补体 采集3只以上豚鼠血清，应用时用PBS稀释成1:30浓度（如不加DEAE-右旋糖酐，可采用原补体或做1:5稀释）。三操作方法1、免疫脾细胞悬液的制备（1）小鼠免疫 每只小鼠经尾静脉或腹腔注入上述SRBC悬液0.2ml；（2）脾细胞悬液的制备 将免疫后第四天的小鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入含含Ca2+、Mg2+冷的pH7.2的PBS中漂洗后，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用弯头镊子挤压脾细胞，稍静置，吸上清液至离心管中，1500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS，混匀，按白细胞计数法计算脾细胞数，最后用PBS调整细胞数至1.00107个/ml，一般每只鼠脾脏细胞数为11081.5108。2、倾注底层琼脂将1.4%琼脂凝胶加热融化后，倾注于水平位置的平皿内，每皿2ml3ml，凝固后，置37温箱，平皿反扣，开盖1h后备用。3、顶层琼脂的制备将0.7%的琼脂融化后，置于45恒温水浴箱中，依次加入以下试剂：（1）2.00109/mlSRBC悬液0.1ml；（2）1%DEAE-右旋糖酐0.05ml；（3）1.00107/ml脾细胞悬液0.1ml。迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静置约15min，放37温育1h1.5h。4、加补体从温箱中取出平皿，每皿加入1:30稀释的新鲜豚鼠血清1.5ml（如