钙成像实验操作及数据处理ppt课件.ppt

刘丝丝2017年8月25日 钙成像实验操作及数据处理 1 钙成像实验操作 2 1 钙成像原理 基本原理 利用钙离子指示剂监测组织或细胞内钙离子浓度 进而反映组织或细胞内某些活动或反应 钙离子指示剂 能够指示钙离子的可视化物质 3 2 实验操作 操作步骤 1 Fluo 4工作液配制 每管Fluo 4AM 8 lDMSO 2 lF 127 2 Fluo 4工作液使用 储液稀释1000倍使用 倍稀释数可根据实验调节 1mlDMEM 1 lFluo 4工作液 主要试剂及仪器 Fluo 4指示剂 DMSO F 127 DMEM HBSS 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜 4 2 实验操作 3 Fluo 4指示剂孵育 将培养皿中原培养基弃去 加入500 1000 lFluo 4溶液 37 孵育20min 4 清洗 将Fluo 4溶液弃去 用不含有钙 镁离子的HBSS溶液清洗3遍 每次2 3min 最后加上相应的浴液开始拍摄 5 钙离子成像 使用普通荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜进行拍摄 以LeicaSP5的CLSM为例 激发光 488nm采用xyt时间轴拍摄模式 Timeinterval 3s Frames 200 根据实验而定 5 钙成像数据处理 6 必备软件 ImageJ MATLAB Origin Photoshop AdobeIllustrator 7 1 图片处理 采集数据 soft stiff stiff stiff soft soft 1 1 新建 件夹X 将待分析的组图 件 200张 考 件夹X中1 2 导 图 打开ImageJ后 File Import Imagesequence 会弹出新框SequenceOptions 点OK 1 3 变换颜色 Image LookupTables 16 colors 注意 如果是彩色的先转成灰度图 1 4 调对 度 Image Adjust Brightness Contrast 会弹出新框B C 将图 调节到最佳 Apply 会弹出新框ApplyLUTtoall200 imagenumbers slicesinthestack ChooseYES 8 1 图片处理 采集数据 soft stiff stiff stiff soft soft 1 5 选细胞 Analyze Tools ROIManager 会弹出新框ROIManager 把ShowallandLabels前 打钩 主菜单栏 选择选择不同形状 具圈细胞 PS 先选择背景 再选择细胞 每圈 个细胞后点Add 圈完所有细胞后截屏保存图 PS 保存了标记细胞个数和顺序 新建 件夹X中1 6 数据导出 ROIManager More MultiMeasure 会弹出新框MultiMeasure 将MeasureAll200 imagenumbers Slices打钩 OK Results 会弹出新框Results File Saveas 将Results数据保存为Excel格式命名Results xls 新建 件夹X中 9 1 图片处理 采集数据 soft stiff stiff soft soft 1 7 在 件夹X中 新建 个Excel 件 将数据粘贴 新的Excel中命名为Results1 xls 只保留编号 Mean Slice三列 将Area列删除1 8 ClosetheprogramImageJ 在Analyze里面的SetMeasurements可以设置Mean值 10 2 Matlab数据处理 soft stiff stiff soft soft 2 0 starttheprogramMatlab2 1 复制程序 将程序 件CalciumFlow20101105 m拷 新建 件夹X中 此时 件夹X中应包括 原始图 件夹 截屏图 Results xls Results1 xls CalciumFlow20101105 m2 2 导 件夹X 打开Matlab后 点右上 按钮 会弹出新框浏览 件夹 选中需导 的 件夹X后点确定 此时Matlab程序左侧会出现CurrentFolder 列出了 件夹X中所有 件2 3 双击打开 件夹X中新建的Excel 件Results1 xls 切勿打开原Excel 件 程序上 会弹出Results1 xls中的数据 点按钮Import ImportData 11 2 Matlab数据处理 soft stiff stiff soft soft 2 4 修改程序 双击左侧打开 件夹X中CalciumFlow20101105 m 弹出程序语 根据每次图 具体情况修改程序 包括修改三条路径 foutin fopen fin fopen fout fopen 所圈细胞个数 nreg 总图 数 np 基线baseline nnp 20 15 10 5 的图 数 以及拍摄时间间隔 tstep 2 5 运 程序 点击运 按钮 如若运 成功 左侧 件夹X中会出现in txt和out txt 件 则表明运 成功 否侧会出现运 错误提醒2 6 ClosetheprogramMatlab 12 3 Origin数据作图 soft stiff stiff soft soft 3 0starttheprogramOrigins3 1 打开OriginPro8 5后 File Import SingleASCII 弹出新框导 件夹X中out txt 件 弹出Book3 2 点击Book的左上 全选后