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科技计划项目可行性研究报告（编写提纲）(1) 立项的背景和意义；结膜为一层薄而透明的黏膜组织，由分层的柱状上皮细胞、纤维组织层和基底细胞层组成，富含血管和神经。原发性或复发性翼状胬肉是常见的眼表疾病, 为结膜组织变性所致一种增殖性病变，具体表现为睑裂区结膜纤维血管组织增生、变性侵犯角膜，多为双眼发病，发展到一定程度，可引起角膜散光、遮挡瞳孔区，从而导致视力下降。翼状胬肉治疗以手术切除为主，而单纯的手术切除复发率较高，由于各种原因引起的结膜缺损的修复，临床有效的治疗方法是用正常结膜或结膜替代物行结膜重建。目前，结膜组织的修复材料主要有羊膜、自体结膜修复、口腔黏膜和下鼻甲黏膜，然而羊膜生物来源的安全性仍受到怀疑。传统的自体组织移植方法优点在于组织易于成活，无机体排斥反应，但又有难于克服的弊端：自体供区来源有限，特别是较大面积的缺损修复时；增加患者二次创伤的痛苦。而安全合适的结膜修复材料的研究成为必要。b5E2RGbCAP本次申请的项目从材料的显微尺度出发，研究溶液状态下胶原纤维聚集的机理，达到显微结构可控的目的，从而控制基支架的宏观结构和性能，进一步优化基支架与添加辅助材料的组合，以最大程度的仿生天然结膜的结构；为克服疤痕组织的形成和新生血管的复发，在修复体支架制备过程中，可同时加入抗代谢药物（5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C等），使得支架同时作为缓释载体，以便寻找结膜修复的有效治疗方法。p1EanqFDPw通过建立兔眼结膜缺损模型，对制备的复合仿生人工结膜进行活体观察，评价其在活体动物眼的生物相容性，术后眼组织反应和结膜修复过程，并运用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫印迹（Western blot），免疫组化等检测方法，观察复合材料对手术区血管内皮生长因子 (VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子 (FGF2)的表达量的影响，同时观察其抗增殖作用的远期效果，以探索其在眼科的应用前景。DXDiTa9E3d(2) 国内外研究现状和发展趋势；结膜为一层薄而透明的黏膜组织，由分层的柱状上皮细胞、纤维组织层和基底细胞层组成，富含血管和神经。结膜覆盖在眼睑后面和前部巩膜表面，根据所在位置分为睑结膜、球结膜和穹窿部结膜。结膜不仅具有眼表屏障功能，还含有相关的淋巴组织，包含了免疫球蛋白、中性粒细胞和淋巴细胞、肥大细胞、浆细胞等。此外，结膜基底层本身含有抗原提呈细胞，结膜作为黏膜相关淋巴组织促进调节性免疫应答的发生1。结膜大部分表面暴露于外界，易受外界环境的刺激和微生物感染而致病，最常见的疾病为结膜炎，其次为变形疾病。结膜上皮细胞的创伤愈合与其他的黏膜细胞相似，上皮细胞的损伤2, 3通常在1-2天内可修复。而结膜基质的修复伴有新生血管的生长，修复过程受血管生成数量、炎症反应程度、组织更新速度等因素影响。结膜浅表层通常由疏松组织构成，损伤后不能恢复为与原先完全相同的组织，深层的纤维组织层损伤修复后，成纤维细胞过度增生，分泌胶原使结膜组织粘附于巩膜，这也是内眼手术后结膜疤痕组织形成的原因。RTCrpUDGiT原发性或复发性翼状胬肉是常见的眼表疾病, 为结膜组织变性所致一种增殖性病变，具体表现为睑裂区结膜纤维血管组织增生、变性侵犯角膜，多为双眼发病，发展到一定程度，可引起角膜散光、遮挡瞳孔区，从而导致视力下降。翼状胬肉发病在赤道部达22%，在高纬度地区低于2%，术后易复发，而其确切病因和发病机制尚未完全弄清，流行病学显示两个因素与其发生有密切关系，一是所居住地区的地理位置和环境，二是暴露于日光及风沙下得时间。热带地区的居民以及长时间从事户外工作的人翼状胬肉的发病率均高。翼状胬肉治疗以手术切除为主，而单纯的手术切除复发率较高，在30%-57.34%。目前在临床上翼状胬肉切除手术中联合丝裂霉素或联合结膜移植、结膜上皮细胞移植、羊膜移植4, 5等。结膜是眼表组织的重要组成部分，结膜大面积受损不仅使原有功能丧失，而且可导致瘢痕形成及睑球粘连而致盲。由于各种原因引起的结膜缺损的修复，临床有效的治疗方法是用正常结膜或结膜替代物行结膜重建。目前，结膜组织的修复材料主要有羊膜、自体结膜修复、口腔黏膜和下鼻甲黏膜6-8等。传统的自体组织移植方法优点在于组织易于成活，无机体排斥反应，但又有难于克服的弊端：自体供区来源有限，特别是较大面积的缺损修复时；增加患者二次创伤的痛苦。增加了手术中操作和风险性。而结膜结构及其功能正常在角膜修复过程中也起着至关重要的作用9。5PCzVD7HxA目前，这些复合的手术方式虽然可以降低复发率，但其潜在的风险和并发症也限制了任何一种术式成为标准的手术方式。如长期局部丝裂霉素点眼可能会引发巩膜坏死、角膜毒性水肿、继发性青光眼，甚至突发性药物毒性白内障等严重眼部病变；自体或异体结膜移植、结膜上皮细胞移植由于异体移植材料来源狭窄而令手术难以开展，且术后可能出现排斥反应，而自体的结膜、结膜上皮细胞移植可能造成局部组织缺损、瘢痕形成等，会影响未来手术如白内障、青光眼手术的操作10, 11。所以临床工作者始终在寻找具有替代性的生物膜来替代受损部位的结膜，羊膜就是其一。羊膜基质中含有的多种蛋白酶抑制剂，不但能抑制胬肉纤维细胞的分化，并能促进结膜上皮细胞的增殖、分化，有利于角膜上皮细胞的生长、移行和防止其调亡，羊膜细胞外基质是指将完整羊膜经过处理后，去除其上皮细胞或使上皮细胞失活，保留基底膜与致密层，其中胶原含量较高，羊膜是目前比较理想的结膜修复支架。但角膜缘缺损较大患者单纯行羊膜移植术效果不佳，需再联合结膜上皮细胞移植术，才能更好地重建角膜表面结构。同时羊膜的生物来源的安全性仍受到怀疑，其并不能完全消除病毒传染的可能，羊膜是否还含有其他不为人所知的细胞因子，已经检测出的几种生长因子的确切机制尚未十分明了；新鲜羊膜中的各种活性成份是否会对内眼手术有影响；羊膜移植术进行眼表重建具有的抑制基质细胞增生及抑制新生血管形成的机制有待进一步研究。因而安全合适的结膜修复材料的研究成为必要。jLBHrnAILg生物材料与组织之间的相互作用最终决定着组织再生是否成功，而大量的研究也表明，细胞的生长行为主要取决于其与周围环境的相互作用。在影响材料与细胞的相互作用的因素中，生物材料的微拓扑结构影响细胞的粘附、增殖和分化12，并且纳米级的拓扑结构可以在更大的程度上介导细胞的行为13。在很多组织再生过程中，例如肌腱、神经、角膜、椎间盘等组织的再生，可以引导细胞的定向生长14, 15。xHAQX74J0X胶原独特的结构，使它不仅可以构成细胞外基质的骨架结构，而且能与细胞相互作用并影响细胞的形态16、骨架组装及增殖与分化，具有优良的生物相容性和生物安全性。由于胶原是细胞外基质的主要蛋白质成分，在构建组织结构中起到非常重要的作用，所以在组织工程中，胶原是一种优先考虑的支架制备原材料17。微纳米生物活性颗粒材料在组织再生中的应用主要包括基因载体18、生物活性分子控释载体19、三维多孔组织工程支架生物活性增强材料20等。溶胶-凝胶生物活性玻璃由于独特的纳米孔结构，高的比表面积，从而具有高的生物活性和促进细胞增殖、分化的能力21。Webster22等人的研究表明，纳米生物材料能够刺激材料与细胞的相互作用。因此，研究微纳米生物活性玻璃的表面结构控制以及微纳米的表面结构对其生物学性质的影响是很重要的。LDAYtRyKfE图1钙磷离子与胶原纤维之间的作用根据Larry L Hench23的研究胶原与钙盐之间可形成一定的配位键（如图1），我们认为钙离子可影响胶原的二级结构，可使胶原纤维聚集态发生变化，而生物活性玻璃水环境中，能在短时间内释放出大量的钙离子、磷酸根离子，可达到影响胶原纤维显微形貌和性质24, 25的目的；胶原纤维聚集态的变化，直接表现为溶液中胶原纤维束直径的变化，这也最终决定了以胶原为基支架的力学性能和生物降解性能。透明质酸26是有N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸的双糖重复单元构成的黏多糖类物质，也是细胞外基质的重要成分，广泛存在于动物组织细胞间质、眼玻璃体和皮肤中，调节渗透压、调控大分子物质的转运、在细胞周围形成物理屏障以及调节细胞功能等。同时，在植入过程中，本研究采用生物胶技术27，将人工结膜与组织相黏贴，生物胶可以把细小血管黏接起来，并且能避免缝合术的一些副作用，简化手术过程，减少患者痛苦；这比传统的血管缝合术更高效，并且能接合仅0.2毫米粗的血管，而缝合术很难处理直径1毫米以下的血管，同时针线造成的损伤会增加血管栓塞的风险，新方法则没有这种风险。Zzz6ZB2Ltk参考文献1 Corrales RM, Calonge M, Herreras JM, Saez V, Mayo A, Chaves FJ. Levels of mucin gene expression in normal human conjunctival epithelium in vivo. Current eye research. 2003;27:323-8.dvzfvkwMI12 Lu R, Zhang X, Huang D, Huang B, Gao N, Wang Z, et al. Conjunctival reconstruction with progenitor cell-derived autologous epidermal sheets in rhesus monkey. PloS one. 2011;6:e25713.rqyn14ZNXI3 Pflugfelder SC, Stern ME. Future directions in therapeutic interventions for conjunctival inflammatory disorders. Current opinion in allergy and clinical immunology. 2007;7:450-3.EmxvxOtOco4 Ilavska M, Kardos L. The reconstruction of conjunctival socket after enucleation of the eye in post-two possibilities of surgical solution. Ceska a slovenska oftalmologie : casopis Ceske oftalmologicke spolecnosti a Slovenske oftalmologicke spolecnosti. 2011;67:97-100.SixE2yXPq55 Asoklis RS, Damijonaityte A, Butkiene L, Makselis A, Petroska D, Pajaujis M, et al. Ocular surface reconstruction using amniotic membrane following excision of conjunctival and limbal tumors. Eur J Ophthalmol. 2011;21:552-8.6ewMyirQFL6 Lee JH, Sa HS, Woo KI, Kim YD. Prepuce Mucosal Graft for Forniceal and Conjunctival Sac Reconstruction in Surgically Intractable Symblepharon. Ophthal Plast Recons. 2011;27:103-6.kavU42VRUs7 Sommer K, Lucke J, Gehrking E, Neppert B. Reconstruction of large conjunctival and orbital defects with preserved amniotic membrane. Laryngo Rhino Otol. 2010;89:132-5.y6v3ALoS898 Xu J, Zhao JY, Xin R, Wang HX, Xu YC, Zhang JS. Effect of amniotic membrane transplantation on rabbit conjunctival surface reconstruction at the recovering stage of alkali burn. Int J Ophthalmol-Chi. 2009;2:238-44.M2ub6vSTnP9 Schrader S, Notara M, Beaconsfield M, Tuft SJ, Daniels JT, Geerling G. Tissue engineering for conjunctival reconstruction: established methods and future outlooks. Current eye research. 2009;34:913-24.0YujCfmUCw10 谭经果. 自体结膜移植治疗翼状胬肉疗效观察. 中国冶金工业医学杂志. 2010;27:266-7.eUts8ZQVRd11 沈志兵. 自体结膜移植与羊膜移植治疗翼状胬肉疗效比较. 四川医学. 2010;31:1115-7.sQsAEJkW5T12 Zinger O, Zhao G, Schwartz Z, Simpson J, Wieland M, Landolt D, et al. Differential regulation of osteoblasts by substrate microstructural features. Biomaterials. 2005;26:1837-47.GMsIasNXkA13 Hasirci V, Vrana E, Zorlutuna P, Ndreu A, Yilgor P, Basmanav FB, et al. Nanobiomaterials: a review of the existing science and technology, and new approaches. Journal of biomaterials science Polymer edition. 2006;17:1241-68.TIrRGchYzg14 Gomez N, Lu Y, Chen S, Schmidt CE. Immobilized nerve growth factor and microtopography have distinct effects on polarization versus axon elongation in hippocampal cells in culture. Biomaterials. 2007;28:271-84.7EqZcWLZNX15 Teixeira AI, McKie GA, Foley JD, Bertics PJ, Nealey PF, Murphy CJ. The effect of environmental factors on the response of human corneal epithelial cells to nanoscale substrate topography. Biomaterials. 2006;27:3945-54.lzq7IGf02E16 Sasaki J, Fujisaki H, Adachi E, Irie S, Hattori S. Delay of cell cycle progression and induction death of cancer cells on type I collagen fibrils corrected. Connect Tissue Res. 2011;52:167-77.zvpgeqJ1hk17 Bhowmik R, Katti K, Katti D. Mechanics of molecular collagen is influenced by hydroxyapatite in natural bone. J Mater Sci. 2007;42:8795-803.NrpoJac3v118 G Z, YB L, SW L. Preparation of a nano-hydroxyapatite/chitosan/konjac glucomannan composite as a novel degradable drug delivery system. JOURNAL OF CERAMIC PROCESSING RESEARCH. 2008;9:353-7.1nowfTG4KI19 Liu TY, Chen SY, Liu DM, Liou SC. On the study of BSA-loaded calcium-deficient hydroxyapatite nano-carriers for controlled drug delivery. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 2005;107:112-21.fjnFLDa5Zo20 Wang X, Song G, Lou T. Fabrication and characterization of nano composite scaffold of poly(L-lactic acid)/hydroxyapatite. Journal of materials science Materials in medicine. 2010;21:183-8.tfnNhnE6e521 Sepulveda P, Jones JR, Hench LL. In vitro dissolution of melt-derived 45S5 and sol-gel derived 58S bioactive glasses. Journal of biomedical materials research. 2002;61:301-11.HbmVN777sL22 Webster TJ, Ergun C, Doremus RH, Siegel RW, Bizios R. Specific proteins mediate enhanced osteoblast adhesion on nanophase ceramics. Journal of biomedical materials research. 2000;51:475-83.V7l4jRB8Hs23 Orfice R, Hench L, Brennan A. Evaluation of the interactions between collagen and the surface of a bioactive glass during in vitro test. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 2009;90A:114-20.83lcPA59W924 Bowness JM. Calcium Binding by Chondroitin Sulfate Associated with Collagen. Biochim Biophys Acta. 1962;58:134-6.mZkklkzaaP25 Marelli B, Ghezzi CE, Mohn D, Stark WJ, Barralet JE, Boccaccini AR, et al. Accelerated mineralization of dense collagen-nano bioactive glass hybrid gels increases scaffold stiffness and regulates osteoblastic function. Biomaterials. 2011;32:8915-26.AVktR43bpw26 Uccello-Barretta G, Nazzi S, Zambito Y, Di Colo G, Balzano F, Sanso M. Synergistic interaction between TS-polysaccharide and hyaluronic acid: Implications in the formulation of eye drops. Int J Pharm. 2010;395:122-31.ORjBnOwcEd27 Koranyi G, Seregard S, Kopp ED. Cut and paste: a no suture, small incision approach to pterygium surgery. British Journal of Ophthalmology. 2004;88:911-4.2MiJTy0dTT28 Detorakis ET, Zaravinos A, Spandidos DA. Growth factor expression in ophthalmic pterygia and normal conjunctiva. International journal of molecular medicine. 2010;25:513-6.gIiSpiue7A29 Livezeanu C, Craitoiu MM, Manescu R, Mocanu C, Craitoiu S. Angiogenesis in the pathogenesis of pterygium. Romanian journal of morphology and embryology = Revue roumaine de morphologie et embryologie. 2011;52:837-44.uEh0U1Yfmh(3) 研究开发内容和技术关键；研究开发内容：（1）建立生物活性玻璃对溶液状态下I型胶原构象及其纤维聚集态的影响机理；（2）人工结膜修复支架的构建及其性能研究、工艺优化；（3）人工结膜修复支架的负载结膜上皮细胞及其体外生物性能评价；（4）结膜缺损模型的建立及人工结膜修复支架的体内评价；（5）在分子水平上评价人工结膜修复支架的抗增殖作用。技术关键：（1）通过控制溶液的离子种类和浓度，以及溶液的pH值，提出I型胶原在不同溶液环境中胶原纤维聚集态改变的机理；IAg9qLsgBX（2）根据胶原纤维不同的聚集态，按照结构仿生的设想，胶原基人工结膜修复体的构建；（3）应用合适的兔眼结膜缺损模型，胶原基人工结膜修复体体内体外性能的评价及其的修复机理的提出。(4) 预期目标（主要技术经济指标、知识产权申请情况、应用前景）；（1）生物活性玻璃对I型胶原构象及其显微形貌影响机理的建立；（2）人工结膜修复体的构建，及其在体内体外性能的评价；（3）期间在国内外期刊上发表论文2篇以上；（4）并申请有关制备胶原基结膜修复体支架制备的专利1项；（5）培养研究生2-3名。应用前景：本课题所研发的胶原基人工结膜，将有望应用于临床胬肉切除手术治疗，替代传统的羊膜或自体结膜，并大大减轻患者的痛苦，且减少手术时间等带来可能；如能应用临床高发病率的翼状胬肉的治疗，有较大的经济效益。WwghWvVhPE(5) 研究方案、技术路线、组织方式与课题分解；研究方案：（1）探求I型胶原在不同溶液环境中胶原纤维聚集态改变的机理研究利用傅里叶红外光谱仪（FTIR）、拉曼光谱仪（Raman）、圆二色光谱仪（CD）、电感耦合等离子体原子发射光谱仪（ICP）、差示扫描量热仪(DSC/DTA)和扫描电子显微镜（SEM）等，分析生物活性玻璃与溶液状态下胶原纤维构象的影响，探讨不同条件下溶液中胶原纤维聚集态的改变机理。从前期试验（图2）的光学显微镜照片可以看出，溶液中I型胶原纤维受到生物活性玻璃的影响而使其聚集态增强，固化后直接的结果就是构成了直径更大的胶原纤维束，后期修复体支架材料的力学性能、降解性能等都受其控制。asfpsfpi4k图2 生物活性玻璃对溶液状态中I型胶原纤维聚集态的影响（未发表）（2）胶原基人工结膜修复体的制备及其性能研究以胶原纤维聚集态改变的机理为根据，以仿照天然结膜的结构与性能为目标，通过对制备人工结膜修复体过程中温度与湿度、凝胶条件以及干燥条件等工艺参数的控制，制备出不同结构和性能的修复支架；对其力学性能、表面形貌、热力学性能、表面接触角、吸水率、保水率，体外降解等性能进行测试研究。ooeyYZTjj1（3）胶原基人工结膜修复体的负载结膜上皮细胞及其体外生物性能研究本实验通过对兔结膜上皮细胞的原代培养，为利用体外结膜上皮移植及诱导干细胞生成结膜样细胞提供理想的结膜上皮细胞。BkeGuInkxI将兔结膜上皮细胞接种胶原基人工结膜修复支架，考察细胞在支架中的增殖与分化，研究材料与细胞之间的相互作用，进一步优化人工结膜修复支架的性能。PgdO0sRlMo（4）结膜缺损模型的建立及胶原基人工结膜修复体的体内试验建立兔眼的结膜缺损模型，将胶原基人工结膜修复体与生物胶结合后，植入动物模型，观察修复过程，对其修复机理进行研究。3cdXwckm15（5）在分子水平评价胶原基人工结膜的抗增殖作用提取手术区域结膜组织，用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫印迹（Western blot），免疫组化等检测方法，评价复合材料对术后结膜组织VEGF和FGF2等参与血管生成过程的影响因子的表达。h8c52WOngM技术路线图：图3 项目研究技术路线图课题分解：（1）研究生物活性玻璃对溶液状态下I型胶原构象及其纤维聚集态变化的影响因素，并提出其变化机理；（2）制备出以I型胶原为基体，透明质酸和生物活性玻璃等为添加剂，仿生制备人工结膜修复支架；（3）构建兔眼结膜缺损模型，通过体内体外实验，优化人工结膜修复支架的结构和性能。（4）用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫印迹（Western blot），免疫组化等检测方法，观察复合材料对手术区血管内皮生长因子 (VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子 (FGF2)的表达，以在分子水平上准确评价支架的抗增殖作用。v4bdyGious(6) 计划进度安排；本课题计划两年内完成。具体安排和进度如下：2012.07-2012.10研究生物活性玻璃对溶液状态中I型胶原的构象和纤维聚集态改变的机理；2012.11-2013.06构建以I型胶原基复合生物活性玻璃的人工结膜修复体，并对其体外性能进行