2细胞培养及建立泡沫细胞模型.doc

2)实验手段 (1)细胞培养及建立泡沫细胞模型 将THP-1细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于370C, 5 CO:培养箱静置培养。该细胞株属人类单核细胞系，在培养液中呈簇集状悬浮生长，倍增时间大约在26 h后。细胞浓度控制在106/mL，每两天换液一次，每四天传代一次。细胞复苏后，传至3 = 5代后方可用于建模。 (2)建立巨噬细胞模型取对数生长期的细胞，分为正常组和模型组，调整细胞浓度为106/mL，接种于6孔培养板，每孔2 mL。正常组在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中培养。模型组先置于含160 nmol/L PMA的RPMI 1640基础培养液中培养72 h，贴壁后轻轻吸去上清液，PBS洗3遍，更换10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液，即得巨噬细胞。巨噬细胞的鉴定己在发表文献中完成。 (3)建立巨噬源性泡沫细胞模型 将获得的巨噬细胞更换含3%胎牛血清的RPMI 1640培养液，并加入终浓度为80 mg/L的Ox-LDL，共同孵育48 h，油红。染色后，镜下观察细胞内充满橘红色脂滴，即得泡沫细胞模型，此过程即为泡沫化。 (4)针对CaSR的si RNA的构建及转染 根据公认的si RNA设计原则(Nat Biotech 2004; 22: 326-330)设计针对CaSR的3条siRNA，选用验证后效果最好的一条。同时合成阳性对照和阴性对照。转染试剂选用Invitrogen公司生产的LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagento siRNA目标序列的选取原则: 工从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找AA二连序列，并记下其3端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。注意:GC含量在4_5 070-_5 _5%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效;在设计siRNA时不要针对_5和3端的非编码区Cuntranslated regions UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。 1)细胞总RNA提取:按Trizol试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下:在细胞中加入冰预冷的Trizol试剂，室温静置_5 min;加200 1氯仿，充分摇匀1_5sec，室温静置2-3 min ; 4 0C，12000rpm离心1 _5 min，取上层无色水相层转移至新EP管;加等体积异丙醇，室温静置l Omin 4 0C 12000rpm离心l Omin，管壁底处可见乳白色沉淀，即为RNA;弃上清，加7 _5%乙醇1 ml 4 0C 7_500rpm离心_5 min，洗涤二次;弃上层乙醇，无菌环境风干RNA沉淀。用20州DEPC处理的双蒸馏水(ddH20)溶解RNA沉淀，-80 0C备用;取4川总RNA加至200川灭菌水中，在紫外分光光度仪上测定其ODZo和ODZSo，计算ODZo/ODZSo。样品总RNA ug枢1) = OD26ox40x稀释倍数(50 ) /1000 o OD26o/ODZgo在1.8-2.0之间为样品较纯。 2)反转录反应:在20川反应体积中进行，成分如下:总RNA tug (5川)，随机引物1 1 DEPC处理的ddH20 4.51 70 0C冰浴l Omin;加10林1逆转录反应液(l Oxbuffer 21MgCL241 dNTP21 inhibitor0.51，逆转录酶11) 420C冰浴60min 99 0C冰浴_5 min-20 0C保存备用。 3)引物扩增设计:根据Genebank序列，设计各个引物序列并合成。 4)实时定量PCR实验方法:使用宝生物工程(大连)有限公司的SYRB. Premix ExTaqTM和Light Cycler PCR扩增仪(Roche)进行荧光扩增;求出CT值。(6)激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定THP-1细胞内游离钙的变化 取6孔板进行THP-1细胞培养，事先在6孔板中加入盖玻片。取6孔培养板中的盖玻片，D一Hanks液冲洗2遍，用1OOL的钙离子探针Fluo-3 /AM与F-127混合工作液(10 mol/LFluo-3 /AM, 0.02070 F-127)滴于盖玻片上，370C避光40 min D一Hanks液再次冲洗玻片3遍，洗去多余染料，保留少许D-Hanks液平衡细胞10 min，分组施加因素后，于10 min内利用LSCM进行细胞内Ca2+浓度检测。(7)油红O染色 油红O属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三醋结合呈小脂滴状。脂溶性染料能溶于组织和细胞中的脂类，它在脂类中的溶解度比在溶剂中大。当组织切片置人染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质(如脂滴)中，使组织内的脂滴呈橘红色。 细胞接种于6孔培养板内，诱导建模结束后，吸去上清液，用PBS洗三次，冰冻的4多聚甲醛固定_5 min， PBS洗一次，再置于丙二醇中固定_5 min，轻轻吸去丙二醇，加入0. _5%油红O的丙二醇溶液，置60烤箱中染色1 _5 min，用8_5%丙二醇冲洗_5 min，再用PBS洗三次，蒸馏水清洗1次，苏木素复染2-5 min 1 07oHCL分色及返蓝后封片。置显微镜下观察并摄像，细胞内脂质为红色，胞核为蓝色。 参考文献:Zheng XD, Li Q, Tang XB, Liang SJ, Chen LP, Zhang S, Wang ZG, Guo L, Zhang R, Zhu DL. Source of the elevationCa2+ evoked by I S-HETE in pulmonary arterial myocytes. European Journal of Pharmacology 2008;601:16-22(8)细胞内胆固醇含量的测定 细胞内胆固醇的提取:细胞接种于6孔培养板内，培养结束后，吸去上清液，冰预冷PBS洗三次，用细胞刮刀刮取细胞，加1 mL冰预冷0.9%生理盐水重悬细胞，反复冻融三次，冰浴中超声破碎_5 min，得细胞裂解液，分装，每份200匹，-700C贮存，用于测定总胆固醇和游离胆固醇。 总胆固醇的提取:取160L上述细胞裂解液，加300L 15 KOH乙醇溶液，_50 0C水解2h，加正己烷一异丙醇(4:1)SOOL涡漩30 s 40C下3600 r/min离心_5 min，取上层。继用正己烷一异丙醇(4:1)如上法抽提两次，合并三次抽提的有机相，减压真空干燥，加20L内标储备液，用甲醇并定容至2 mL，摇匀，作为总胆固醇供试品溶液。 游离胆固醇的提取:取160L上述细胞裂解液，加300L乙醇，加正己烷一异丙醇(4:1)500匹涡漩30 s 40C下3600 r/min离心_5 min，取上层。继用正己烷一异丙醇(4:1)如上法抽提两次，合并三次抽提的有机相，减压真空干燥，加20L内标储备溶解并定容至2mL，摇匀，作为游离胆固醇供试品溶液。 HPLC测定胆固醇:色谱柱:Hypersil C 18柱(2.1 mmx150 mm 3m);流动相:甲醇一水(90:10);流速:0.5 mL/min;柱温:室温;进样量:10 Lo 参考文献:唐朝克，王佐，易光辉，万载阳，刘录山，袁中华，王燕，危当亘，阮长耿，杨永宗.Rolipram对THP-1巨 噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出和ABCA1表达的影响.中国药理学通报.2003 oct;19(10):1177-82 (9) ELISA法检测细胞因子的分泌情况 按每孔2x1护个细胞接种于24孔板中，含有160nmo1/L PMA的培养液培养72小时后，PBS洗三遍，各组加入处理因素，继续培养24小时。收集细胞培养上清液。从平衡至室温的密封袋中取出实验所需板条，留空白孔。加O.lml离心后的细胞培养上清液于反应孔中，置370C孵育90分钟。然后洗板_5次。(同时做空白孔，标准品空)。于各反应孔中，加入新鲜稀释的生物素化抗体工作液0.1m1 370C孵育1小时，洗板_5次。加酶结合工作液O.lml 370C避光孵育30分钟，洗板_5次。加入O.lml显色底物液，370C避光孵育1 _5分钟于各反应孔中加入终卜液O.lml混匀后即可测量ODq50值。(10)Western Blot检测蛋白表达变化 1)总蛋白的提取:收集细胞，加入冰预冷的蛋白裂解液(lmmol/L PMSF pH7.4)混匀，超声破碎细胞;4 0C 12000rpm，离心1 _5min，取上清液，用考马斯亮蓝法染色，测定蛋白含量;取上清加入_5*上样缓冲液(体积比4: 1) 1000C沸水中煮_5 min，-20 0C备用。 2 ) SDS-PAGE电泳:按照胶配置方法配制不同浓度PAGE胶，电泳置染料抵达分离胶底部，断开电源，取下凝胶。切下带有要转移蛋白泳道的凝胶，右下角作一标记以确定方向及正反而。 3)转膜:剪1块与凝胶大小相同的NC膜(不能大于凝胶)，右下角作一标记，浸泡于转移缓冲液中，大约_5 min o剪8块滤纸，右下角作一标记，其大小略与凝胶相同 (不能大于凝胶)。将剪好的滤纸在转移缓冲液中浸泡，按阳极到阴极(从下至上)川页序安装转移装置:平放底部电极，在底部电极上放置4张浸泡好的滤纸，精确对齐，将NC膜放在滤纸上，排除气泡。把SDS-PAGE电泳凝胶转移到去转移缓冲液中漂洗，平放于NC膜上，用玻棒挤出所有气泡，在其上再放置4张浸泡好的滤纸，排出气泡。将上层电极放于夹层物上，连接电源，根据凝胶而积按1 mA/cm2接通电源。 4)封17:转移结束后，在TBS-T液内清洗20min，加_5%脱脂奶粉，37 0C封闭lho _5)一抗孵育:封闭结束后，用TBS-T稀释第一抗体，将NC滤膜置于其中，4 0C震荡过夜。 6)显迹:TBS-T液漂洗NC膜3次/l Omin，将膜与TBS-T稀释二抗孵育，室温下振荡1h; TBS-T漂洗NC膜3次/lOmin; TBS液漂NC膜3次/l Omin X光胶片上曝光，随后显影、定影，用图像分析系统测定蛋白条带的光密度，进行定量分析。 (11)免疫荧光技术检测蛋白表达定位 1)细胞生长贴在玻片上，细胞密度适中，大约60-7_5%满片即可。 2)取出细胞后用4%多聚甲醛固定1 _5分钟，现用现配。 3) PBS冲洗。 4) 0.107oTriton作用20分钟。 5) PBS冲洗。 6) 10%正常血清封闭10分钟。: 7)加入一抗，4度孵育过夜。8) PBS冲洗4次，各_5分钟。9)加入荧光二抗，室温30分钟。10) PBS冲洗4次，各_5分钟。11) 90%甘油封片。12)避光保存，荧光显微镜下观察并照相记录。3)关键技术(详见:2)实验手段)(1) CaSR的siRNA的设计及转染平台的建立 由于巨噬细胞是终末分化的细胞，转染相对较难。siRNA的转染需要注意如下几点: 工纯化siRNA II避免RNA酶污染III避免使用抗生素W通过看家基因作为阳性对照优化转染和检测条件。 (2)细胞内游离钙的测定 激光共聚焦显微镜用于细胞内游离钙的测定，由于钙离子探针Fluo-3 /AM是荧光染料，所以处理后细胞需要避光放置，并减少各组监测时间差，尽量消除染料自身淬灭而产生的误差。 (3)细胞内胆固醇的测定 细胞内胆固醇的测定需用高效液相色谱，对于这一设备的应用，安静稳定的检测环境、恒流恒温的流动项对于获得可信的实验结果是必须的。胆固醇检测所需的色谱柱为Hypersil C 18柱(2.1 mmx150 mm 3m)，其运行条件是:流动相:甲醇一水(90:10);流速:0.5 mL/min;柱温:室温;进样量:10匹。2.可行性分析 (1)理论的可行性众多研究业己证明，巨噬细胞的泡沫化和致炎细胞因子的过度释放在动脉粥样硬化的发生中起关键作用。我们的前期实验结果己揭示CaSR在巨噬细胞有功能性表达，并且激活后可以促进巨噬细胞细胞因子的释放。可见，我们的假说在理论上是可行的。 C2)研究方法和实验条件的可行性本项目采用的所有实验手段是国内外研究中广泛采用方法，技术十分成熟，申请者及其他主要实验者己熟练掌握相关技术。哈尔滨医科大学病生教研室及基础医学院己具备开展本课题研究所需的实验条件及仪器设备。 (3)研究队伍的可行性本课题组所在研究室在CaSR与心血管相关疾病的研究上居国内外领先水平。到目前为卜，我们实验室己经发现CaSR在心肌细胞、血管平滑肌细胞、肝细胞和巨噬细胞均有表达，在缺血再灌注损伤、心肌肥大、动脉粥样硬化多种病理过程中发挥重要作用。本课题组成员由具有多年分子生物学和细胞生物学科研经验的中青年学者组成，前期试验结果己发表SCI论文多篇。(四)本项目的特色与创新之处。 1.本项目首次在巨噬细胞水平将动脉粥样硬化这一病理过程与CaSR的功能联系起来，国内外尚未见类似报道。研究结果将从新的视角进一步动脉粥样硬化的发生机制，为其有效防治提供新思路和新靶点。 2.本试验采用抑制剂的应用与siRNA技术作为平行观察手段，为以上的结论打下夯实的基础。(五)年度研究计划及预期研究结果。1.年度研究计划1 2012年1月一2012年12月完成CaSR沉默SiRNA的构建，并建立稳定的转染平台，完成对在沉默CaSR后THP-1源性巨噬细胞的CaSR活性的检测。2) 2013年1月一2013年12月完成观察Ox-LDL对THP-1源性巨噬细胞CaSR 的表达和活性的影响，以及检测CaSR的活化是否影响巨噬细胞泡沫化过程。3) 2014年1月一2014年6月观察CaSR的活化对泡沫化巨噬细胞合成分泌细胞 因子功能的影响4) 2014年7月一2014年12月完善研究内容，根据需要补充试验。统计资料， 撰写论文，结题。2.预期研究结果 (1)研究工作将能够比较系统地阐明CaSR与巨噬细胞泡沫化，以及细胞因子分泌功能之间的联系，进一步说