第六章-发酵工程基本操作.ppt

第六章发酵工程基本操作 一 灭菌 sterilization 第一节严格消毒灭菌 除菌的方法 培养基的加热灭菌 包括常压或蒸汽高压加热法 空气的过滤除菌紫外线或电离辐射化学药物灭菌 二 灭菌设备l 高压蒸汽灭菌手提式灭菌锅立式或卧式灭菌锅多用于少量培养基的灭菌 一般能装几十瓶或几百瓶 灭菌柜 三 灭菌操作 一 空罐灭菌空罐灭菌也称空消 无论是种子罐 发酵罐 还是尿素 或液氨 罐 消泡罐 当培养基 或物料 尚未进罐前对罐进行预先灭菌 为空罐灭菌 为了杀死所有微生物特别是耐热的的芽孢 空罐灭菌要求温度较高 灭菌时间较长 只有这样才能杀死设备中各死角残存的杂菌或芽孢 二 实罐灭菌将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热 达到预定灭菌温度后 维持一定时间 再冷却到发酵温度 然后接种发酵 这叫做实罐灭菌 又称分批灭菌 三路进汽 蒸汽直接从通风 取样和出料口进入罐内直接加热 直到所规定的温度 并维持一定的时间 这就是所谓的 三路进汽 三 连续加压灭菌法 在发酵行业里也称 连消法 此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用 主要操作 将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热 维持和冷却 然后才进入发酵罐 培养基一般在135 140 下处理5 15秒钟 连续加压灭菌法优点 采用高温瞬时灭菌 故既可杀灭微生物 又可最大限度减少营养成分破坏 提高了原料利用率 比 实罐灭菌 120 30分钟 提高产量5 10 提高了发酵罐 锅炉的利用率 降低了劳动强度 适宜自动化操作 采用高温灭菌的原理及优点 杀死微生物芽孢的活化能大于维生素分解的活化能 灭菌中总体上希望尽可能的杀灭微生物 同时少破坏营养成分 灭菌温度上升 灭菌速度常数增加速度大于培养基成分破坏增加的速度 因此 灭菌温度上升 则杀死微生物速度增加大于培养基成分破坏速度的增加 因而生产中多采用高温或超高温灭菌 其在杀灭微生物的同时可减少培养基营养成分的破坏 培养基连消工艺流程图 四 影响培养基灭菌的因素 1 pH值的影响pH值对微生物的耐热性影响很大 pH为6 0 8 0时微生物最不易死亡 pH 6 0时氢离子易渗入微生物的细胞内 2 培养基成分培养基的成分中 油脂 糖类 蛋白质都是传热的不良介质 会增加微生物的耐热性 使灭菌困难 浓度较高的培养基相对需要较高温度和较长时间灭菌 3 培养基中的颗粒物质培养基中的颗粒物质大 灭菌困难 反之 灭菌容易 一般说来 含有颗粒对培养基灭菌影响不大 但在培养基混有较大颗粒 特别是存在凝结成团的胶体时 会影响灭菌效果 必须过滤除去 1 过滤除菌法是将液体或气体用微孔薄膜过滤 使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留 从而达到除菌目的 在体外培养时 过滤除菌大多用于遇热容易变性而失效的试剂或培养液 五 其他除菌方法 2 还可以用气体灭菌剂如环氧乙烷等对个别成分进行灭菌处理 六 灭菌效果监测 高压蒸汽灭菌效果监测 1 高压蒸汽灭菌指示卡 将卡片放入灭菌器不同部位 观察灭菌后指示卡颜色变化 2 芽孢菌片法 将染有嗜热脂肪杆菌芽孢105cfu ml的菌片包好 放入灭菌器内 灭菌后作细菌计数测定 对照是不经灭菌的菌片 芽孢完全被杀灭或杀灭率达99 9999 为合格 紫外线消毒效果监测 微型紫外线强度计 第二节空气除菌 一 空气除菌概述 发酵对空气处理要求随发酵产品和菌种不同而异 半固体制曲和酵母生产中无菌要求不十分严格 一般无需复杂的空气净化处理 密闭的深层通气发酵需严格的纯净培养 进入发酵罐前空气必须进行冷却 脱水 脱油和过滤除菌等处理 发酵对空气无菌程度的要求 发酵对无菌空气的要求是 无菌 无灰尘 无杂质 无水 无油等 空气要做到绝对无菌在目前是不可能的 也是不经济的 发酵对无菌空气的无菌程度要求是 只要在发酵过程中不因无菌空气染菌而造成损失即可 在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过 药品生产管理规范 中洁净度标准洁净级别尘粒数 粒 L 菌落数粒径 0 5 m100 3 5 110000 350 3100000 3500 10 100000 35000暂缺 二 空气除菌的方法 一 辐射杀菌 二 热杀菌 三 静电除菌 四 过滤除菌 热灭菌 热空气进入培养系统之前 一般均需用压缩机压缩 提高压力 空气压缩后温度可达到120 以上 保持一定时间后 便可杀菌 大型空气压缩机 静电除菌 静电除尘器可除去空气中的水雾 油雾 尘埃 同时也除去微生物 原理 利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌目的 对于一些直径小的微粒 所带电荷小 不能被吸附而沉降 介质过滤除菌 介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层 将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中 而达到除菌的目的 从可靠性 经济适用与便于控制等方面考虑 目前仍以介质过滤法较好 也是大多数发酵厂广泛采用的方法 三 发酵生产中制备无菌空气流程 一 空气除菌流程分析 要保持过滤器有比较高的过滤效率 应维持一定气流速度和不受油 水干扰 要保持不受油 水干扰则要有一系列冷却 分离 加热的设备 1高空取气管 高空取气管是远离地面几十米的管子 一般而言 地面附近空气中所含的微生物和灰尘等均比高空空气中含的多 每升高10米 空气中杂菌可降低一个数量级 因此从高空取气要比从低空取气有利得多 2除尘装置 3油水分离器 其内部同时采用直接拦截 惯性碰撞 布朗扩散及凝聚等机理 能有效地去除空气中的水 油雾 尘埃 内部不锈钢丝网可清洗 使用寿命长 4空气贮罐 两级分离 冷却 加热空气除菌 利用压缩机抽吸作用 使空气先经中 高效过滤后 再进入空气压缩机 再经冷却 分离 进入主过滤器过滤 就可获得无菌程度很高的空气 高效前置过滤除菌流程 空气净化的流程 吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤进入空气压缩机 120 150 冷却 20 25 除去油 水 再加热至30 35 最后通过总过滤器和分过滤器除菌 获得洁净度 压力 温度和流量都符合要求的无菌空气 四 过滤除菌设备原理 概述 目前发酵工厂采用的空气过滤设备大多数是传统的深层过滤设备 滤层厚度一般为1 2米 所用的过滤介质一般是棉花 活性炭 玻璃纤维 焦炭等 空气过滤 一 深层过滤原理 棉花的纤维直径一般为16 20微米 填充系数为8 时 棉花纤维所形成网格的孔隙为20 50微米 微粒大小为 0 5 2微米 微粒气流运动方向改变引起微粒对滤层纤维产生惯性冲击滞留 阻截滞留 重力沉降 布朗扩散 静电吸附等作用而把微粒滞留在纤维表面上 纤维介质阻留微粒的机制 1 阻截滞留 微粒随空气气流向前运动 随气流运动的粒子在接近纤维表面的部分由于与过滤介质接触而被纤维吸附捕集 这种作用称之为阻截滞留 空气流速愈小 纤维直径愈细 阻拦截留作用愈大 2 惯性冲击滞留 当微粒随气流以一定速度向纤维垂直运动因受纤维阻挡而急剧改变运动方向时 微粒惯性作用使其仍沿原方向前进碰撞到纤维表面 产生摩擦粘附而使微粒被截留在纤维表面 这种作用称惯性冲击滞留 截留区域的大小决定于微粒运动的惯性力 所以 气流速度愈大 惯性力大 截留效果也愈好 此外 其作用也与纤维直径有关 纤维愈细 捕集效果愈好 惯性冲击滞留在介质除尘中起主要作用 3 布朗扩散运动 直径小于1 m的微粒在运动中往往产生一种不规则的布朗运动 使微粒间相互凝集成较大的粒子 从而发生重力沉降或被介质阻留 但是这种作用只有在气流速度较低时才较显著 重力沉降作用 重力沉降是一个稳定的分离作用 当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时 微粒就容易沉降 静电吸附作用 干空气对非导体物质相对运动摩擦产生诱导电荷 纤维和树脂处理过的纤维 尤其是一些合成纤维更为显著 悬浮在空气中的微生物微粒大多带有不同的电荷 这些带电的微粒会受带异性电荷的物体所吸引而沉降 二 空气过滤除菌介质 棉花 纤维细长 16 20 m 填充150 200kg 立方米 玻璃纤维 直径8 19 m 直径越小越好 但小易断 缺点 更换时碎末飞扬 过敏 活性炭 大表面 物理吸附 空气阻力小 常夹带在二层棉花中降低阻力 超细玻璃纤维纸 拦截为主 直径1 1 5 m 有较高过滤效率 缺点为强度差 受热后松散 石棉滤板 蓝石棉20 加80 纸浆混合打浆 强度大 过滤效率低 耐蒸气反复杀菌 烧结材料过滤介质 聚乙烯醇过滤板 新型过滤介质 微孔滤膜 影响介质过滤效率的因素 介质纤维直径越小 过滤效率越高 对于相同介质 过滤效率与介质滤层厚度 介质填充密度和空气流量有关 三 过滤器的类型 棉花 活性炭过滤器棉花是最常用的过滤介质 通常用纤维不太长的原棉 其具有一定的弹性 经湿热灭菌 干燥后仍能保持原有疏松状态 过滤阻力较活性炭大 10 12倍 活性炭常被加工成粒状 其过滤效率比棉花低 但具有阻力小 吸附力强 可吸附空气中有害物质 如油 水 的特点 通常与棉花介质一起使用 减少过滤层的阻力 棉花活性炭过滤器的过滤效率可达99 其过滤介质装填为 上部和下部装填棉花 其厚度为总过滤层的2 1 4 1 3 中间再装入1 2 1 3厚度的活性炭 一般棉花的填充密度为150 200公斤 米3 活性炭40 450公斤 米3 过滤器失效 1 活性炭灰化压缩空气进入过滤器后引起活性炭颗粒间相互碰撞摩擦 久而成为粉末 灰化 活性炭的体积逐渐变小 过滤器内空间逐渐增大 到达 定程度时 便会发生棉花成90 翻身现象 空气会未经过滤而进入罐内 引起染菌 2 棉花粉末化棉花经过多次加热灭菌后 颜色逐渐变深 靠近过滤器壁的棉花受夹层蒸气烤干 受热剧烈 容易变成粉末而被空气带走 造成过滤层有缝隙 使过滤层疏松而漏风 甚至还因过高的压力和过长时间烘烤而引起棉花活性炭着火 2 Bio x过滤器英国DomnickHunter公司用直径为0 5 m玻璃纤维制成1mm厚的滤材 再以较粗玻璃无纺布做内外衬 再在内 外以不锈钢网固定 作成滤筒状 它能滤除0 01 m颗粒 过滤效率为99 9999 填充率为6 空气流量大 压力降小 结构简单 体积小 安装方便 缺点是强度不大 易损而失效 受潮也失效 3 高流量过滤器DomnickHunter公司开发的聚四氟乙烯 PTFE 材料为滤芯的高流量过滤器 它结合了深层过滤技术和新的膜折叠技术 其过滤机理和过滤效率均同Bio x过滤器 但所用材料PTEE是一种坚韧的疏水性材质 增加了过滤面积 使空气流量为Bio x的3倍 延长了使用寿命 这种过滤器的空隙率达94 大于普通的膜过滤器 4 聚乙烯醇 PVA 过滤器将聚乙烯醇 PVA 乙酰化并以耐热树脂涂敷 制成片式过滤器 能够经受蒸气反复灭菌 有效孔径20 30 m的PVA过滤器 只需要0 2 0 3cm厚的一层就能满足空气除菌的需要 除菌效率达99 9999 以上 压力降小 使用可达一年以上 杀菌及干燥时间极短 更换方便 占地面积小 5 其它过滤器 第三节水处理工艺 石英砂过滤活性炭过滤离子交换柱蒸馏 1华雨制药 2 生物制品一厂 原水罐 机械过滤 石英砂过滤 活性炭过滤 中间罐 离子交换 膜过滤 反渗透 纯水罐 五效蒸馏 哈医大药学院工厂 石英砂过滤 活性炭过滤 反渗透 离子交换 蒸馏 纯水 第四节染菌的控制 一 染菌的原因归结起来是 设备 管道 阀门漏损 灭菌不彻底 空气净化不好 无菌操作不严或菌种不纯等 二 染菌控制加强接种室等重要车间的消毒管理工作 定期检查消毒效果 严格无菌操作技术 如果新菌种不纯 则需反复分离 已出现杂菌菌落或噬菌斑的试管斜面菌种 应废弃对于菌种扩大培养的工艺条件要严格控制 二 湿热灭菌原理 1 生物热死动力学 对数残存定律 dN dt KNN 菌体个数 个 t 灭菌时间 min k 反应速度常数 min 1 dN dt 菌受热死亡速率 个 min LnN N0 KtN N0e Kt以菌的残留数LnN N0的对数与时间t作图 得出一条直线 其斜率为 K P222图14 1 如何通过实验根据对数残存定律确定某一温度 某一微生物的K 1 K与菌种的特性有关相同温度下 微生物越耐热 k值越小 相同温度下 微生物越不耐热 k值越大 2 反应速率常数K 2 K与灭菌温度有关K Ae E RT 阿累尼乌斯方程 LnK LnA E RTA 比例常数R 气体常数 J molK T 绝对温度 K E 杀死细菌所需的活化能 J mol 第二节培养基和发酵设备的灭菌工艺 一 培养基灭菌时间的选择t 1 k Ln N0 N 其中K 一般耐热的细菌芽孢的K值N0 细菌及芽孢数之和N 10 3 二 培养基灭菌温度的选择选择即能达到灭菌要求 又保证营养成分不被破坏的温度 1 培养基营养成分破坏动力学方程 dC dt K C dC dt 营养物降解速度mol LhC 营养物浓度mol LK 营养物降解反应速度常数1 st 时间 S Ln C C0 K tK A e E RTLnK LnA E RTA 比例常数R 气体常数 J molK T 绝对温度 K E 营养物破坏所需的活化能 J mol 2 根据实验结果灭菌活化能大于培养基破坏活化能E E P225表14 113 灭菌反应营养物破坏反应T1LnK1 LnA E RT1LnK1 LnA E RT1T2LnK2 LnA E RT2LnK2 LnA E RT2Ln K2 K1 E R 1 T1 1 T2 Ln K2 K1 E R 1 T1 1 T2 Ln K2 K1 ELn K2 K1 E Ln K2 K1 Ln K2 K1 K2 K1 K2 K1 当温度升高时微生物死亡速度常数比营养物质降解速度常数变化得大 4 达到相同灭菌效果 T越高 K越大 所需t越短 采用高温短时 HTST 灭