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文档简介

一、CTAB法提取DNA主要试剂及配方：CTAB缓冲液（2%）：试剂用量(g/L)CTAB20NaCl81.816Tris-base7444EDTA-Na212.114巯基乙醇 23mLpH 8.0 称量好后65水浴，搅拌，直至完全溶解，然后定容，调pH24:1溶液：24:1为体积比，如果是一瓶新的三氯甲烷（500mL），可直接加入21mL异戊醇即可。70%乙醇：二、CTAB法提取DNA的简要步骤步骤备注1将新鲜叶片叶脉去掉，剪碎置于研钵中，加入液氮快速研磨成粉末状，转入2mL离心管，加入65预热的CTAB提取液900 uL充分混匀，65保温40 -60min，在此期间轻轻颠倒离心管几次。加入CTAB后，需及时充分混匀，然后水浴。开始混匀可以使劲，后面的混匀要轻，保证DNA的完整性。此步骤是裂解细胞，释放细胞产物2水浴完后，冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)混合液轻轻摇动10 min。12000 r/min离心10 min；第一次抽提24:1尽量加满2mL的离心管，摇和离心的时候尽量轻拿轻放。此步骤是用氯仿抽提有机相，异戊醇的作用是去除气泡。3取上清液，再用等体积的氯仿/异戊醇抽提一次，12000 r/min离心10 min；离心后，DNA溶于上层水相，变性蛋白溶于下层氯仿，第二次24:1抽提加1mL即可。4小心吸出上清液于另一2mL离心管中，加入0.6倍上清液体积的异丙醇，缓慢混匀，于-20冰箱中沉淀DNA；第二次吸上清尽量不要吸到中间层，按需要浓度大小，可选择性吸取。异丙醇用前需预冷。5挑出成团的DNA，用70乙醇洗23次；挑出的DNA还是含有一定的杂质，因此，第一次70%乙醇洗时间建议长些，一般不低于10分钟，期间上下摇晃几次，但不可太长，否则DNA要断裂6无水乙醇洗1次；7倒干残余乙醇，自然干燥也可以进行真空干燥8加无菌水溶解DNARNA酶可以加到水中，溶解DNA9 RNA去除，按100微升DNA溶液加1微升RNA酶10溶解后放置几小时后（尽量过夜）便可电泳检测，浓度测定三、提取过程中可能出现的一些情况（主要是提玉米DNA）可能出现的情况可能原因建议第一次24:1抽提后上清是绿色的浑浊液体。样取的较多1、样品取样适量；2、加CTAB时可以适量多点。第一次上清是褐色的（正常情况应该是浅黄色，透明）样品在裂解过程中被氧化了或是降解了。取样的时候尽量取了及时放在液氮中；确定巯基乙醇按比例加在了CTAB缓冲液中；再者，样磨完了加CTAB缓冲液的时候速度要快，混匀要充分；如果机器磨样，尽量倒出钢珠，再加CTAB缓冲液。加入异丙醇后没见絮状沉淀取样太少；样品碾磨不够好12000r/min离心2min，一般都会有沉淀附着管壁，同样可以收集到DNA。DNA电泳检测时候有拖尾，点样孔不干净拖尾是DNA降解，点样孔不干净是含有部分蛋白对于这两种情况，只能尽量做好每一步，减少每
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