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常用破碎方法 1 第12章沉淀法 2 本章内容 基本原理与沉淀类型 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点发 聚乙二醇沉淀法 选择性沉淀法 结晶法 3 知识点 盐析法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法等方法 选择性变性沉淀法 金属离子沉淀法 重点 上述几种沉淀方法的概念 原理及其适用范围 盐析法的影响因素对沉淀效果的影响 并能根据实际情况予以灵活应用和选择 难点 常用沉淀方法的灵活运用 4 沉淀是通过改变条件或加入某种试剂 使溶液中的溶质由液相转变为固相析出的过程 它是古老 实用 简单的初步分离的方法 该法成本低 操作简单 不仅用于实验室中 也用于某些生产目的的制备过程 是分离纯化生物大分子 特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法 通过沉淀 将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相 而与杂质得到初步的分离 1基本原理与沉淀类型 5 1 1基本原理沉淀法纯化生命大分子物质的基本原理 根据各种物质的结构差异 如蛋白质分子表面疏水基团与亲水基团之间比例的差异 来改变溶液的某些性质 如pH 极性 离子强度 金属离子等 使抽提液中的有效成分的溶解度发生变化 因此 选择适当的溶液就能使欲分离的有效成分呈现最大溶解度 而使杂质呈现最小溶解度 或者相反 有效成分呈现最小溶解度 而杂质呈现最大溶解度 1基本原理与沉淀类型 6 1 2几种沉淀方法 1 盐析法 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化 2 有机溶剂沉淀 多用于蛋白质和酶 多糖 核酸以及生物小分子的分离纯化 3 等电点沉淀法 用于氨基酸 蛋白质及其他两性物质的沉淀 但此法单独应用较少 多与其他方法结合使用 4 非离子型聚合物沉淀法 用于生物大分子分离 5 选择性沉淀 热变性沉淀和酸碱变性沉淀 多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白 6 有机聚合物沉淀 是发展较快的一种新方法 主要使用PEG聚乙二醇 Polyethyeneglycol 作为沉淀剂 7 盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随盐浓度的增高而上升 当盐浓度增高到一定数值时 其溶解度又逐渐下降 直至蛋白质析出 盐析 2 盐析法 8 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域 已有八十多年的历史 其突出的优点是 成本低 不需要特别昂贵的设备 操作简单 安全 对许多生物活性物质具有稳定作用 9 蛋白质和酶均易溶于水 因为该分子的 COOH NH2和 OH都是亲水基团 这些基团与极性水分子相互作用形成水化层 包围于蛋白质分子周围形成1nm 100nm颗粒的亲水胶体 削弱了蛋白质分子之间的作用力 蛋白质分子表面极性基团越多 水化层越厚 蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大 因而溶解度也越大 2 1盐析的基本原理 10 亲水胶体在水中的稳定因素有两个 即电荷和水膜 因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性 所以加入大量中性盐后 夺走了水分子 破坏了水膜 暴露出疏水区域 同时又中和了电荷 破坏了亲水胶体 蛋白质分子即形成沉淀 盐析示意图如下页图所示 盐析的基本原理 续 11 12 13 高浓度的中性盐能够促使蛋白质等发生沉淀或絮凝现象 蛋白质的溶解度与盐浓度的关系可用Cohn方程式来表示 2 2盐析的Cohn方程式 式中 S 离子强度I时的蛋白质的溶解度 g L So 纯溶剂 即I 0 时 蛋白质的溶解度 g L KS 盐析常数 与温度和pH无关 14 I 离子强度 等于mi 离子i的摩尔数 Zi 所带电荷 盐析的Cohn方程式 15 盐析的Cohn方程式 当温度一定时 S0对于某一溶质是一个常数 即因此可以得到 式中 值的大小取决于溶质的性质 不可能直接测定 是假定溶解度在I 0时 用外推法求出的 带有经验性质 为了计算方便一般用浓度代替离子强度 m 盐的摩尔数 16 2 3盐分级沉淀 1 盐的选择一般进行蛋白质沉淀时 常选用的是硫酸铵 因为硫酸铵与其他盐 如氯化钠 硫酸钾等 相比 具以下优点 溶解度大 对温度不敏感 当水的温度是25 时 硫酸铵的饱和溶解度为769g 其摩尔浓度为4 1mol L 当水的温度降至0 时 其饱和溶解度高达679g 其摩尔浓度为3 9mol L 这是其他盐类所不具备的 由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定 因而盐析操作也要求在低温下 0 4 进行 17 由下表可以看到 硫铵在0 时的溶解度 远远高于其它盐类 几种盐在不同温度下的溶解度 克 100毫升水 0 20 80 100 NH4 2SO470 675 495 3103Na2SO44 918 943 342 2NaH2PO41 67 893 8101 18 分级效果好 有些抽提液经过加适量的硫酸铵一步分级沉淀处理后 就可除去杂蛋白75 以上 有稳定蛋白质结构的作用 将2 3mol L硫酸铵盐析的蛋白质置低温下保存一年 其性质没有变化 价格低廉 废液可以肥田 但是用硫酸铵或其他盐类进行分级沉淀都有一个共同的缺点 即得到的样品欲继续纯化时 需花一定时间脱盐 19 2 硫酸铵盐析 A 固体法 最常用的是固体硫酸铵加入法 将其研成细粉 在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入粗制品溶液中 接近计划饱和度时 加盐的速度更要慢一些 尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀 在此过程中 溶液中的硫酸铵的浓度会不断提高 水分子会不断与硫酸铵结合 当加入的硫酸铵使溶液浓度达到 盐析点 时 蛋白质就沉淀出来 20 如 在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵 当饱和度达35 时 尿素酶基本上仍留在溶液中 而饱和度达55 时 尿素酶几乎全都沉淀出来 21 硫酸铵加入量的确定 计算法X G p2 p1 1 Ap2X为1L溶液所需加入的硫酸铵的克数 G为经验常数 0 515 20 513A为常数0 0 2720 0 29P2 P1为初始和最终溶液的饱和度 22 调整硫酸铵溶液饱和度计算表 查表法 23 盐析后要在冰浴中放置一段时间 待沉淀完全后再离心与过滤 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离 高浓度硫酸铵常用过滤方法 24 B 饱和溶液法 这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温和的力法 其操作是在蛋白质溶液中逐步加入预先调好pH的饱和硫酸铵溶液 此法比加入固体硫酸铵沉淀法温和 但是对于大体积样品不适用 因为硫酸铵溶液的大量加入 将导致样品溶液体积增加 例如 当样品达到50 硫酸铵饱和度时 其体积增加一倍 25 C 透析法 将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中 通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度 此法的盐浓度是以连续状态变化的 可以避免盐浓度局部升高产生的不良影响 所以分离效果好 但是 在实际应用过程由于受透析袋容积有限 盐析速度缓慢和硫酸铵耗费多等因子的制约 所以此法仅在要求较精确 样品体积小的试验使用 26 蛋白质的浓度 2 4盐析的影响因素 不同蛋白质的溶解度曲线 27 高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀 若蛋白质浓度过高 易产生各种蛋白质的共沉淀作用 低浓度的蛋白质 共沉淀作用小 但回收率降低 较适中的蛋白质浓度是2 5 3 0 相当于25mg mL 30mg mL 28 2 pH值对盐析的影响 在等电点处溶解度小 pH值常选在该蛋白质的等电点附近 盐析的影响因素 pH对 的影响 29 3 温度的影响 对于蛋白质 酶和多肽等生物大分子 在高离子强度溶液中 温度升高 它们的溶解度反而减小 在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的 一般情况下 可在室温下进行 但对于某些对温度敏感的酶 要求在0 4 下操作 以避免活力丧失 盐析的影响因素 30 温度的影响 p 31 4 离子强度和种类的影响 32 无机盐种类的影响 不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系 25 NaCl KCl MgSO4 NH4 SO4 Na2SO4 K2SO4 柠檬酸三钠 33 常用的脱盐方法是透析法和凝胶过滤法 在透析操作时 必须注意以下几点 透析袋处理 市场购买的透析袋 或透析纸 要用蒸馏水洗净 严格检查 无漏洞时 即可使用 2 5脱盐 34 样品中所含盐类易被金属或水解酶等破坏之时 透析袋需要用下列方法处理 将10cm长的透析袋置500ml含lmmol LEDTA Na2的2 碳酸氢钠溶液中煮沸10min 用干净镊子或戴橡皮手套取出 经蒸馏水煮沸 漂洗后 即可使用 35 透析液选择一般选用的透析液均为低离子强度的中性缓冲液 对含有辅基的酶透析时 在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂 为了防止微生物生长 透析应在4 进行或在透析液中添加0 02 NaN3 36 掌握透析时间透析操作在搅拌下进行时 样品液与透析体积之比以l 10较好 一般3h可达平衡 若透析在静止状态下过夜进行时 则比例应扩大到1 20以上 脱盐是否彻底 要经常检查 如除去的是硫酸铵 可用10 氯化钡检查 如除去的是氯化钠 可用10 硝酸银检查 直到透析液中检测不出硫酸钡或氯化银沉淀为止 即透析已完成 37 3 1基本原理有机溶剂对于许多蛋白质 酶 核酸 多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用 是较早使用的沉淀方法之一 3 有机溶剂沉淀法 38 有机溶剂沉淀原理图 39 降低水溶液的介电常数 向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数 减小溶剂的极性 从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力 导致蛋白质溶解度降低而沉淀 由于使用的有机溶剂与水互溶 它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子 破坏了蛋白质分子的水膜 因而发生沉淀作用 40 有机溶剂沉淀法的优点是 分辨能力比盐析法高 即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀 沉淀不用脱盐 过滤比较容易 如有必要 可用透析袋脱有机溶剂 因而在生化制备中有广泛的应用 其缺点 对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活 操作需在低温下进行 41 用于生物物质沉淀的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶 但与蛋白质无相互作用 沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇 甲醇和丙酮 为了获得沉淀而不着重于进行分离 可用溶液体积的倍数 如加入一倍 二倍 三倍原溶液体积的有机溶剂 来进行有机溶剂沉淀 3 2有机溶剂的选择和浓度的计算 42 使溶液中溶质沉淀需要达到一定的有机溶剂浓度 所需有机溶剂浓度和体积的计算按照如下公式 有机溶剂的选择和浓度的计算 式中 V 所需100 浓度的有机溶剂 V0 需沉淀的原溶液体积 S1 原溶液中有机溶剂的浓度 S2 要求达到的有机溶剂浓度 43 1 温度 多数生物大分子如蛋白质 酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感 温度稍高就会引起变性 且有机溶剂与水混合时产生放热反应 因此必须预冷 操作要在冰盐浴中进行 加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓 一般规律是温度越低 得到的蛋白质活性越高 3 3有机溶剂沉淀的影响因素 44 2 样品浓度 低浓度样品回收率低 要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀 高浓度样品 可以节省有机溶剂 减少变性的危险 但杂蛋白的共沉淀作用大 通常使用5mg mL 20mg mL的蛋白质初浓度为宜 有机溶剂沉淀的影响因素 3 pH值 选择在样品稳定的pH值范围内 通常是选在等电点附近 从而提高此沉淀法的分辨能力 45 4 离子强度 盐浓度太大或太小都有不利影响 通常盐浓度以不超过5 为宜 使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的 倍体积为宜 少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用 但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度 降低了沉淀效果 通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质 沉淀所得的固体样品 如果不是立即溶解进行下一步的分离 则应尽可能抽干沉淀 减少其中有机溶剂的含量 如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂 以免影响样品的生物活性 46 有机溶剂沉淀法的操作与硫酸铵盐析法相似 盐析法的注意事项在这里同样适用 此外 还有几点需要指出 1 低温下操作 由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引起蛋白质变性 因此必须把所用之有机溶剂预冷至一1O 而且整个操作要在低温下进行 2 中性盐作用 加入适量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度 可降低有机溶剂对蛋白质的变性作用 同时还可提高分级效果 但是 加入的量过多 则可引起蛋白质析出 影响有机溶剂的分级作用 因此 用有机溶剂沉淀蛋白质时 宜在稀盐溶液或低浓度缓冲液中进行 3 多价阳离子作用 有些蛋白质和多价阳离子 如Zn2 Cu2 等 能结合形成复合物 致使蛋白质在有机溶剂中的溶解度降低 这对在高浓度溶剂中才能沉淀的蛋白质特别有益 47 利用具有不同等电点的两性电解质 在达到电中性时溶解度最低 易发生沉淀 从而实现分离的方法 氨基酸 蛋白质 酶和核酸都是两性电解质 可以利用此法进行初步的沉淀分离 由于许多蛋白质的等电点十分接近 而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度 不能完全沉淀析出 因此 单独使用此法分辨率较低 因而此法常与盐析法 有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用 以提高沉淀能力和分离效果 此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白 而不用于沉淀目的物 4等电点沉淀法 48 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂 最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒 近年来广泛用于核酸和酶的纯化 其中应用最多的是 聚乙二醇 PolyethyleneGlycol简写为PEG HOCH2 CH2OCH2 nCH2OH n 4 它的亲水性强 溶干水和许多有机溶剂 对热稳定 有广泛围的分子量 在生物大分子制备中 用的较多的是分子量为6000 20000的PEG 5 聚乙二醇沉淀法 49 本方法的优点是 操作条件温和 不易引起生物大分子变性 沉淀效能高 少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子 沉淀后有机聚合物容易去除 因此应用范围颇广 但是 它也受各种因子如pH 离子强度 蛋白质浓度以及聚合物分子质量的影响 聚乙二醇沉淀法 50 6选择性沉淀法 是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异 选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯 使杂蛋白变性沉淀 而欲分离的有效成分则存在于溶液中 或者发生可逆性沉淀 从而达到纯化有效成分的目的 热变性 利用生物大分子对热的稳定性不同 加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在