核酸研究的基本技术.ppt

江红三所五室 核酸研究的基本技术 1 核酸的分离 纯化和鉴定 基因组DNA 质粒 总RNA2 PCR技术 反应体系 常见的PCR技术 PCR产物的克隆 表达 鉴定3 核酸分子的杂交 Southern blotNorthern blot4 新基因的克隆和功能研究 Tm值 DNA的熔点或解链温度 概念 指加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度 一 核酸的分离 纯化和鉴定基因组DNA的分离 纯化 PCR Southern blot 构建基因组文库实验材料 哺乳动物组织 50 100mg 哺乳动物细胞 5x106 107 实验步骤 RT匀浆 TEpH8 0组织 液氮冻存 研磨 消化 EDTA SDS 蛋白酶K RNase37 55 抽提 酚 氯仿 异戊醇沉淀 异丙醇 NaAc 无水乙醇洗涤 75 乙醇干燥 风干溶解 TE H2O 注意事项 1 试剂 pH值准确2 蛋白酶K 20mg ml 分装 20 避免反复冻融3 抽提 完全 不要触及蛋白层4 干燥 避免过分5 操作 小心 机械剪切作用 80 100kb 2 总RNA的分离纯化 RT PCR Northern blot实验材料 哺乳动物组织 50 100mg 哺乳动物细胞 5x106 107 实验步骤 匀浆 Trizol组织 液氮冻存 研磨 抽提 氯仿沉淀 异丙醇 NaAc 无水乙醇RT15min洗涤 75 乙醇干燥 风干溶解 DEPC H2O保存 分装 70 避免反复冻融 注意事项 1 无RNase环境 手套勤换 试剂专用 DEPC处理玻璃器皿 180 C干烤8小时以上塑料器皿 氯仿冲洗0 1 DEPC水溶液浸泡 RT12h或37 C2h 高压灭菌去除DEPC 1 核酸的定量 OD260 DNA RNA OD280 蛋白质浓度 1OD260 50 g mldsDNA40 g mlssDNA 总RNA35 g ml单链RNA20 g ml单链寡核苷酸核酸纯度 OD260 OD280DNA1 8RNA1 7 2 12 0OD260和OD280应大于0 05 2 核酸的凝胶电泳 分离 纯化琼脂糖凝胶电泳 agarose 水平 TAE EB 2ng 紫外灯 迁移率 同样大小的分子超螺旋 线性分子 缺口或松弛 DNAMarker DL2000 DNA Hind 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE Acr Bis 垂直 银盐染色非变性 变性 4 质粒 概念 细菌等微生物细胞染色体以外 能独立进行复制和遗传 赋予宿主细胞一定生物学性状的共价闭环双链DNA分子 载体 指可容忍外源DNA片段插入 可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的DNA分子 如 细菌质粒 噬菌体和某些病毒 组成 复制子 启动子 多克隆位点 选择标记基因 复制子 ColE1 pMB1 pSC101 控制着质粒在细菌中的拷贝数 启动子 位于表达载体 启动基因的转录 如Ptac PCMV PSV40等 多克隆位点 MCS 人工合成的含多个单一限制性内切酶识别位点的一段特殊的DNA序列 便于酶切 插入重组和克隆DNA分子 选择标记基因 Ampr Tetr Kanr Neor 分类 按用途分类克隆载体表达载体 含有强启动子 使克隆化的外源基因转录产生大量的mRNA 依其发挥作用的宿主细胞不同 分为原核 真核 酵母 昆虫 病毒表达载体 按复制能力分类严谨性质粒 它们的复制伴随着染色体复制 1 几个拷贝 松弛型质粒 它们的复制与染色体复制无关 10 200拷贝 常用 穿梭质粒 人工构建两种不同复制起点和选择标记两种不同的宿主细胞中存活和复制转移基因基因表达活性和功能 分离 碱裂解法 煮沸法 剧烈 小质粒去污剂 SDS 裂解法 易受损的大质粒 15kb 碱裂解法 收菌重悬 TE 葡萄糖裂解 变性 NaOH SDS5min中和 复性 KAc抽提 酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 沉淀 异丙醇洗涤 70 乙醇溶解 TE RNaseA 纯化 氯化铯 溴化乙锭梯度平衡离心聚乙二醇分级沉淀法 Kit 碱裂解 DNA介质 硅胶 玻璃奶 互补现象 pUC系列质粒 lac操纵子 半乳糖苷酶氨基端 细菌 半乳糖苷酶N 末端缺陷型 蓝色菌落 外源DNA插入 白色菌落 半乳糖苷酶 缺陷型 蓝白筛选 1 原理2 反应体系3 类型4 PCR产物的克隆 表达和鉴定 二 PCR 聚合酶链式反应 技术 1985 MullisK PCR Klenow1988 Saiki Taq酶 1 原理 模板变性 引物退火 DNApol进行DNA合成 PCR产物呈指数方式增加25 30个循环理论109实际105 107 2 PCR反应体系 25 100 l 1 模板DNA 单链或双链DNA 避免DNA聚合酶抑制剂和能结合DNA的蛋白质污染 1 0 1 g 2 引物 人工合成的两段与待扩增靶DNA侧翼片段互补的寡核苷酸 20pmol 3 Mg2 的浓度 反应产物的特异性和产量 1 5mmol L 4 dNTP 50 200 mol L 四种dNTP浓度相同 5 TaqDNA聚合酶 Klenow Taq酶 高保真Taq酶 2 5U 100 l 6 参数 94 5min 30 94 30sec 55 30sec 72 1min 72 7min 1 长度一般为18 25个碱基 2 尽可能选择碱基随机分布的序列 3 两条引物的G C的百分比应尽量相似 多为45 55 4 避免引物内部形成二级结构 5 两引物之间不应发生互补 特别是在3 端 6 引物3 末端碱基可以影响Taq酶的延伸效率 最好选T G或C 而非A 7 引物5 端允许有一段序列不与模板配对 内切酶 保护碱基 引物设计原则 退火温度计算公式 1 T 2 A T 4 G C 3 52 T 22 1 46ln 3 5ln 2 GorC AorT 20 35nt3 T 81 5 16 6lg J 0 41 G C 600 l 0 63 FA J monovalentcationsl oligonucleotidelengthFA formamide14 70nt Taq酶合成延伸速率 22 0 25nt sec 37 1 5nt sec 55 24nt sec 70 60nt sec1 Taq酶单克隆抗体 低温与Taq酶结合 抑制活性 高温与Taq酶解离 释放活性 2 模板变性后加入Taq酶 热启动PCR 提高特异性 3 影响因素 模板 ng级的质粒DNA g级基因组DNA 引物 引物浓度不宜偏高 否则易形成引物二聚体 Mg2 浓度 特异性及产量dNTPs浓度 正确性和产量Taq酶用量 非特异性循环参数 常规为25 30个循环 对照 阳性对照阴性对照 不加模板 4 特点 特异性 有效性 忠实性 操作简便省时 灵敏度高 特异性较强 但有一定的假阳性率 提高退火温度可以提高特异性 对原始材料的质量要求较低 有一定程度的单核苷酸错误掺入 因为TaqDNA聚和酶缺乏3 5 核酸外切酶活性 不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入 1 反转录PCR RT PCR 5 常见类型 PCR 关键 总RNA完整性反转录引物 随机引物 特异下游引物 第一轮PCR 第二轮PCR 2 巢式PCR 模板数低 3 RACE cDNA末端的快速克隆 AAAAA m7Gppp 5 3 5 RACE 3 RACE 3 RACE 5 RACE 方法一 Cap Finder 方法二GeneRacer 连接头 cDNA第一链 5 末端 3 末端 1 第一链的合成至关重要1 确定所需的mRNA的存在2 mRNA中存在的稳定二级结构可能对反转录有影响 采用热稳定的具反转录活性的DNA聚合酶2 反转录结束后通过两次NH4Ac沉淀去除多余dNTP和引物3 内源性同聚序列的影响1 降低引物的用量0 5pmol gmRNA 20 l反应体积2 避免太低的杂交温度 注意 4 长片段PCR Taq酶 LATaq酶5U 50 l反应dNTP 2 5mM8 l延伸 5min循环 25 6 差异PCR 5 DNA指纹分析 随机引物 遗传学图谱绘制 系统生物学 发育生物学 1 大量扩增目的核酸片段2 克隆新基因3 生物多态性的研究4 核酸测序5 在核酸中引入突变6 检测基因的整合 表达情况7 疾病的诊断 6 PCR在生物学中的应用 1 需突变位点位于基因两侧 只需在合成引物时 直接加上突变碱基即可 2 当突变位于基因的中间部位时 可以采用以下两种方法进行突变 在基因中引入突变 方法一 方法二 DNA的序列测定 Sanger双脱氧链终止法测序的原理 单链模板DNA 测序引物 5 3 4种dNTP 包括 32P dNTP DNA聚合酶 ddTTP ddCTP ddGTP ddATP 造成链末端终止的双脱氧核苷酸 新合成的DNA 1 阴阳性对照2 配制PCR混合物PCRbuffer dNTP H2O3 控制污染 靶序列污染 气溶胶紫外线照射更换实验场所 设备 试剂暂停实验 7 注意事项 8 限制性核酸内切酶 核酸酶 是一类能切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键 使核酸分子多核苷酸链发生水解的蛋白酶 基因工程中最常用的核酸酶是核酸内切酶 限制性核酸内切酶 简称限制酶 是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶 它能特异地结合于限制酶识别序列或其附近的位点 并在此切割双链DNA分子 概念 分类 I类 识别部位复杂 特异性差 在识别序列周围400 7000bp范围内切割DNA II类 能识别双链DNA的特定序列并进行切割 产生特异的DNA片段 常规应用于分子克隆中 III类 在识别位点周围27 27bp范围内切割DNA 命名原则 EcoRI 第一个大写字母 属的缩写两个小写字母 种的缩写第二个大写字母 不同变种和品系的缩写罗马数字 同一微生物中多种限制酶分离的顺序 特征 识别序列 4 6个核苷酸 迴文结构 切割产物 同时切割dsDNA的两条链平滑末端或粘性末端 酶活性单位 一个活性单位 在适当的反应条件 1小时 完全酶解1 gDNA底物 限制性内切酶的量 单酶切 双酶切反应 30 l 37 4h 标准的酶解反应 50 l反应体系 1U内切酶 最适反应条件 1小时 1 gDNA完全降解 影响活性因素 DNA 纯度 甲基化程度 分子结构缓冲液 pH值溶液 离子种类及浓度消化反应的温度反应体系中甘油浓度 指改变酶反应条件时 酶原有的识别特异性降低的现象 即限制酶在非标准反应条件下 能切割一些与其特异识别序列相似的序列 一般在相应限制酶的名称右上角加一个星号 表示 几乎所有的限制酶都具有 星号活力 Star活力 星号活力的诱发因素 甘油含量高 酶量不超过反应体积的10 1 30内切酶用量过大 100U gDNA 2 10U gDNA离子强度低 25mmol L 推荐BufferpH值高 pH7 5 8 5 EcoRI出现 pH7 0含有机溶剂 DMSO 乙酸等 DNA纯度二价阳离子 Mn Co Zn 等 Mg 9 PCR产物的克隆 表达和鉴定 PCR产物 A T克隆 测序 重组表达载体 重组蛋白 制备抗体 检测活性 转染细胞 1 查找目的基因序列 mRNA序列NCBIGenBank 1atgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtggactttagccaga451MNFQQRLQSLWTLAR1546cccttctgccctcctttgctggcgacagcctctcaaatgcagatg9016PFCPPLLATASQMQM30541gacgtagaagcagctctgaccaaagcccttggggaagtggacatt585181DVEAALTKALGEVDI195586cttctgacctggatgcagaaattctacaagctctga621196LLTWMQKFYKL 2 酶切位点分析 http pga mgh harvard edu web apps web map start 3 设计引物 选择载体 原核表达载体 His pET pRSETGST pGEX酵母载体 YCP真核表达载体 pcDNA3 pcDNA3 1myc pCMV myc pcDNAmyc HisHA pcMV HAFlagGFP pEGGFP N pEGFP C pIRES2 EGFPRFP昆虫表达载体 病毒表达载体 pAdEasy His tag GST tag 5 保护碱基 酶切位点 起始密码 目的基因序列3 1atgaattttcaacagaggctgcaaagcctgtggactttagccaga451MNFQQRLQSLWTLAR15 上游引物 上游有标签读框 586cttctgacctggatgcagaaattctacaagctctga621196LLTWMQKFYKL 下游引物 反向互补 5 保护碱基 酶切位点 终止密码 目的基因反向互补序列3 下游有标签读框 4 PCR5 PCR产物的A T克隆和亚克隆DNA凝胶回收 KitPCR产物和T载体的连接 T4DNA连接酶 16 12h感受态细菌的制备转化挑克隆提质粒 Kit双酶切鉴定测序和分析冻存菌种 NCBIBlast 6 重组蛋白的制备 细菌 宿主菌 重组表达载体 重组蛋白表达 表达形式分析 亲和纯化 7 重组表达载体在哺乳动物细胞中的表达 脂质体 Lipofectamine2000 效率低病毒系统 腺病毒 逆转录病毒 腺相关病毒 效率极高 8 表达的鉴定mRNA水平 Northern blot RT PCR 原位杂交蛋白质水平