发酵工程基础实验.doc

华东理工大学20112012学年第_学期发酵工程基础实验实验论文 2012.6班级 学号 姓名 成绩 _开课学院 生工学院 任课教师 李友元 论文题目： 洁霉菌紫外诱变与发酵论文要求：用中文写作，字数不少于3000字左右。论文格式与要求详见附件“论文格式体例”教师评语：评分项目及满分标准单项满分得分1） 论文整体格式规范符合要求、图表清晰；102） 中英文摘要书写规范符合要求、关键词选词规范；103） 材料和方法准确、全面；104） 实验内容全面、准确；255） 实验数据有原始记录，真实可靠；106） 数据分析与讨论翔实正确；257） 感想与建议；10总分教师签字： 年 月 日洁霉菌紫外诱变与发酵朱理，周文茹，陈鹏飞华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237摘要 优良的菌种是发酵工业的基础，工业生产的菌种一般都需要运用遗传学原理和技术进行改造，从而使得现存的优良性状强化，去除不良性状，提高菌种的生产能力。本实验从洁霉菌的单孢子悬浮液出发，采用紫外诱变选育菌株，经过种子扩陪、发酵培养后，最终用杯碟法对产物进行分析,并与原菌种进行比较。实验测得紫外诱变的平均死亡率为19.23%，诱变后效价值为1460.5u。并与其他实验组进行比较得，诱变剂量不同即紫外照射时间不同，会直接导致菌体的死亡率不同，且诱变剂量越大即紫外照射时间越长，则菌体死亡率越高。关键词 洁霉菌, 紫外诱变， 死亡率， 糖氮测定， 效价，中图分类号TQ92 文献标识码A 文章编号The Ultraviolet Mutagenesis and Fermentation of of S. LincolnensisZHU Li，ZHOU Wen-Ru，CHEN Peng-FeiState Key Laboratory of Bioreactor Engineering, ECUST, Shanghai 200237, ChinaAbstract The good strain is the basis of the fermentation industry, industrial production strains generally requires the use of genetic principles and techniques to improve the characteristic, in order to make the existing good traits to strengthen, remove the undesirable traits, and increase the production capacity of the strain. In the research, S.lincolnensis was mutated by UV. After scale-up and fermentation,we determined the potency by cylinder-plate method, then compared with the initial strain. Finally，We matured the death rate is about 19.23%，the podency of mutated strains efficiency was 1460.5u.And compared with other group, different UV radiation times cause different mortality, the greater UV radiation time, the higher mortality.Key words S. lincolnensis , UV mutation , mortality , potency 洁霉菌(S. lincolnensis,)，又名林可链霉菌，它可产生林可霉素(1incomycin)，一种林可胺类碱性抗生素，对多数的革兰氏阳性菌有较强抗菌活性，是临床用主要抗生素之一1。但链霉菌中普遍存在遗传不稳定性，从而引起抗生素产量下降。因此各国学者不断研究提高抗生素产量的方法，已期获得更大产量的抗生素，而提高产量的最重要途径是通过育种改变生产菌种。诱变育种是一种简便易行而且快速的选育方法 因而在抗生素的菌种筛选中应用最广泛。2本文对林肯链霉菌进行紫外诱变，以期获得较高产量的林可霉素产生菌。并进行不同诱变时间的处理，比较死亡率与诱变后洁霉素生物效价的变化。1材料和方法1.1 菌种洁霉菌；藤黄八叠球菌（均由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室提供）。1.2 仪器与材料1.2.1 实验仪器250ml三角瓶；150ml三角瓶；15150试管；双碟：直径9cm、直径5cm；涂布棒；1ml吸管；5ml吸管；粗口吸管15ml、5ml各一支；电子天平；无菌磁力搅拌子；微量移液器；接种环；不锈钢管（外径80.1mm、内径60.1mm、高100.1mm)；陶瓷瓦盖；滴管；镊子等。1.2.2 实验设备紫外照射箱：它是一台装有15瓦紫外灯管以及磁力搅拌器的带有可控样品进出口的封闭的装置、灯管与磁力搅拌器的距离（即照射距离）为30cm；旋转式摇床一台：其转速为230 r/min；离心机；灭菌锅；超净工作台等。1.2.3 试剂 洁霉素标准溶液：效价分别为5/ml和2.5/ml；pH 7.8的磷酸缓冲液（KH2PO4 0.41g 和K2HPO4 5.59g加蒸馏水1000ml）；蒸馏水；费林试剂；6mol/L NaOH；0.03569mol/L NaOH;6mol/L HCl；1mol/L HCl；Na2S2SO3标准液；1%淀粉指示剂；甲基红指示剂；酚酞指示剂；12%中性甲醛。1.2.4 培养基配方表1 培养基配方Table 1 Culture medium formular培养基种类 成分 pH分离培养基 可溶性淀粉 2%；KNO3 0.1%；K2HPO43H2O 0.05%； 7.2MgSO47H2O 0.05%；NaCl 0.05%；FeSO47H2O 0.001%；琼脂 1%。发酵培养基 葡萄糖 10%；淀粉 2%；黄豆饼粉 2.5%；玉米浆 0.2%； 7.0-7.5(NH4)2SO4 0.2%；NH4NO3 0.2%；NaCl 0.5%；NaNO3 0.8%；KH2PO4 0.025%；CaCO3 0.8%。效价培养基 蛋白胨 0.6%；酵母膏 0.6%；牛肉膏 0.15%；葡萄糖 0.1%。 7.8-8.01.3 方法1.3.1 洁霉菌单孢子悬浮液的制备取已培养好的洁霉菌孢子斜面（500ml的扁瓶）一只，加入40ml无菌水，把孢子轻轻刮下，将其倒入已灭菌盛有玻璃珠的三角瓶中，振荡20min，用带有无菌脱脂棉的漏斗过滤，即得分散较好的单孢子悬浮液。1.3.2 培养方法平板培养：接菌种于平板培养基，倒置放入28培养箱中，培养5-7天。斜面培养：将生长好的、孢子丰满的、没有染菌的单菌落挑入斜面，放入28培养箱中，培养7天。其中对照菌种挑一支，处理菌种挑三支。摇瓶发酵培养：将培养好的洁霉菌斜面挖一小块接入发酵培养基，在30、转速230 r/min的旋转式摇床上培养7天。其中对照菌种接一只摇瓶，处理菌种接三只摇瓶。1.3.3 诱变育种出发菌株单孢子悬浮液分离培养单菌落接斜面摇瓶初筛摇瓶复筛保种传代实验发酵条件实验菌株定名推广诱变处理图1 诱变育种流程图Fig.1 Flow diagram of mutation breeding1.3.4 分析方法死亡率：平板菌落计数法糖氮含量测定：斐林试剂法氮含量测定：甲醛法洁霉素效价：杯碟法（两剂量法）2 实验结果21 紫外诱变结果本实验中诱变剂量仅取决于紫外照射时间，分别选用了紫外照射20s和40s，死亡率用平板菌落计数法计算。实验结果如表2、表3所示。紫外照射死亡率=（对照组菌落数-诱变组菌落数）/对照组菌落数100%死亡率（20s）=(5.21054.2105)/（5.2105）100%=19.23%死亡率（40s）=(7105+8.351054.5105-3.23105)/(7105+8.35105)=49.64%诱变剂量不同即紫外照射时间不同，会直接导致菌体的死亡率不同，且诱变剂量越大即紫外照射时间越长，则菌体死亡率越高。表2 紫外诱变结果（20s）Table 2 Results of UV mutagenesis(20s)序号 处理类型 稀释倍数 菌落计数 平均数 总菌落数 1 103 502 对 103 54 52 5.21053 照 104 54 104 0 2.5 2.51055 103 416 实验 103 43 42 4.21057 （20S） 104 28 104 5 3.5 3.51052.2发酵培养基中糖氮含量测定各取发酵上清液0.25ml，分别用菲林试剂法和甲醛法测定。实验数据如表4、表5所示。表3 紫外诱变结果（40s）Table 3 Results of UV mutagenesis(40s)序号 处理类型 稀释倍数 菌落计数 平均数 总菌落数 1 103 882 对 103 79 83.5 8.351053 照 104 74 104 7 7 71055 102 3386 实验 102 307 332.5 3.3251057 （40S） 103 528 103 38 45 4.5105表4 糖氮含量测定结果（20s）Table 4 The results of total sugars ammonia nitrogen content(20s)测定类型 初始体积/ml 终止体积/ml 消耗体积/ml 总糖含量 实验组 4.37 6.30 1.93 空白组 3.10 11.15 8.05 氨氮含量 4.00 5.40 1.40表5 糖氮含量测定结果（40s）Table 5 The results of total sugars ammonia nitrogen content(40s)测定类型 初始体积/ml 终止体积/ml 消耗体积/ml 总糖含量 实验组 0.00 2.32 2.32 空白组 0.00 4.25 4.25 氨氮含量 3.12 6.65 3.5320s：总糖含量=（V2-V1）/34= （8.05-1.93）/34=8.16 %氨氮含量=V320= 1.4020=28.0 /100ml经测定，糖氮含量分别为8.16 %、28.0 /100ml，可知培养基营养成分较为丰富。40s：总糖含量=（V2-V1）/34= （4.25-2.32）/34=2.57 %氨氮含量=V320= 3.5320=70.6 /100ml2.3发酵放瓶结果经过发酵培养后，进行发酵放瓶，观察各瓶发酵液的外观、颜色、气味、稠度、是否染菌等，用精密pH试纸测定pH，初步判断摇瓶生产情况。实物图见图2，放瓶结果见表6。实验中，观察到2号、3号诱变组和4号实验组摇瓶的液体并无大致差异，而1号摇瓶中液体呈深褐色，与其他三个摇瓶有显著不同，并且仔细观察摇瓶中的液体，发现呈酸性且黏度较低，所以我们组成员觉得1号摇瓶可能污染了杂菌，导致发酵现象不同。图2 发酵结果图。从左至右，摇瓶标号依次为1、2、3、4。Fig.2 The result of the final fermentation. From left to right, the number of shake flask is 1,2,3,4,respectively表6 发酵放瓶结果分析表Table 6 The result of the final fermentation序号 处理类型 颜色 黏度 pH值 味道 外观 1 诱变 深褐色 黏度低，均一 5.5 味酸 壁上菌落固形物小而碎，呈粒状，无挂壁现象 2 诱变 黄褐色 黏稠，均一 7.0-7.5 霉味 壁上菌落固形物黏稠呈糊状，夹杂少量白色菌落，有挂壁现象。 3 诱变 黄褐色 黏稠，均一 7.0-7.5 霉味 壁上菌落固形物黏稠呈糊状，夹杂少量白色菌落，有挂壁现象。4 对照 黄褐色 黏稠，均一 7.0-7.5 霉味 壁上菌落固形物黏稠呈糊状，夹杂少量白色菌落，有挂壁现象。2.4洁霉素生物效价测定取直径9cm的碟子，摊铺好底层和菌层之后，子均匀放置4个钢管（如图3所示），分别注入等量的高浓度样品、低浓度样品、高浓度标准液、低浓度标准液。量取抑菌圈大小，用两剂量法计算洁霉素生物效价。由公式 为样品浓度与标准品浓度的百分数K高低浓度之比，本实验设定为2V=（UH + UL）-（SH + SL）W=（UH + SH）-（UL + SL）实际单位=估计单位样品的估计单位为1000U/ml。实验结果见图4，实验数据及计算结果如表7、表8所示。表7 抗生素效价测定结果（20s）Table 7 The podency of the antibiotic(20s)序号 处理类型 抑菌圈直径/ 效价/u 平均值/u SH SL UH UL 1 诱变 2.40 2.30 2.60 2.00 905.72 诱变 2.40 2.00 1.70 1.60 217.6 1460.53 诱变 1.70 1.50 2.70 1.60 1797.74 对照 2.70 2.20 2.20 1.60 500 500表8 抗生素效价测定结果（40s）Table 8 The podency of the antibiotic(40s)序号 处理类型 抑菌圈直径/ 效价/u 平均值/u SH SL UH UL 1 诱变 2.55 2.15 2.60 2.00 9442 诱变 2.60 2.15 2.60 1.90 860 8873 诱变 2.50 2.20 2.55 1.95 8574 对照 2.65 2.20 2.15 1.55 468 468 图3 钢圈放置位置示意图 图4 杯碟法结果图Fig. 3 Diagram of the placedrimslocation Fig.4 The results of cylinder plate method3 分析与讨论实验结果：经测定，紫外诱变的平均死亡率为19.23%，消后发酵培养基糖氮含量分别是8.16 %、 28.0 /100ml，培养基营养成分较为丰富。诱变后菌株的平均效价是1460.5u，较对照组洁霉素效价明显上升。3.1死亡率死亡率与诱变率有密切联系，而实验测出死亡率所耗时间短，可较早了解照射剂量是否合适。本实验中紫外波长、照射距离是相同的，因此诱变剂量仅与照射时间有关。通过对照组、处理20s组和处理40s组的对比可知，不同即紫外照射时间不同，会直接导致菌体的死亡率不同，且诱变剂量越大即紫外照射时间越长，则菌体死亡率越高。这其中存在一最适诱变剂量，一般照射剂量以照射后微生物的致死率为90%99.9%的剂量为最佳照射剂量，偏低的计量处理后正突变较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前多采用低剂量长时间处理，尽管致死率较高，但诱变效果好。3在实验中，本组采用了紫外照射20s，计算得到的死亡率为19.23%。此数值偏低，可能有以下几个原因：（1）紫外照射时间过短；（2）诱变组从紫外箱中取出后，未进行遮光处理，菌体可能发生了光修复作用，影响死亡率的测定；（3）稀释倍数为104那组，平板所得菌落数较少，存在偶然误差，不利于用于计数计算。3.2 营养成分含量控制营养成分的充足及碳氮平衡有利于维持菌体的正常代谢活动。本次的洁霉素发酵培养基中使用了黄豆饼粉、玉米浆等天然原料，成分复杂，通过测量糖氮含量可为日后培养基的优化及发酵过程中的补料操作提供依据，也可增加实验的可重复性。但实验中发现一现象：同一大组的发酵培养基同时配制，但测得的糖氮含量却不同，可能部分未溶解的颗粒分装不均所致。3.3洁霉素生物效价在生物效价的测定中，抑菌圈大小与抗生素效价的关系为： 抗生素的总量的对数值与抑菌圈半径的平方呈正比。此外还受C、H、D、T的影响，这些可用两剂量法消去。本实验所选用的杯碟法受以下因素影响：4（1）培养基厚度效果：H越大，其它条件相同时r越小。影响H的因素：培养基；小钢管的放置及重量（2）细菌生长到肉眼所需的时间效果：T越大在其它条件相同时，r越大影响T的因素：菌体本身，及影响菌体生长的条件.如：接种量，培养温度、及营养环境（3）最低抑菌浓度C效果：C越大在其它条件相同时，r越小影响C的因素：抗生素（本身、缓冲液）；试验菌；培养基（4）扩散系数D效果：D越大在其它条件相同时，r越大影响D因素：抗生素及缓冲体系；培养基的成分；温度；钢管的质量及放置而在本实验操作中，主要影响的有培养基厚度、钢圈的放置、抗生素剂量、菌体浓度。4 感想与建议发酵实验将发酵过程按工艺流程安排了培养基配制、菌种 诱变、种子扩陪、发酵培养、产物分析五大单元实验模块，使我们较好的掌握了基础实验技巧，也较为全面的了解了发酵工艺过程。发酵实验课上新颖的flash课件、生动的实验视频和神奇的随机点名系统，调动了同学们的积极性。实验课后的每次清洁为我们的实验提供一个良好的环境。这些都使本